专利名称：与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及两个与黄瓜果瘤基因Tu共分尚的显性分子标记。
背景技术：
黄瓜(Cucumissativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis) —年蔓生的草本植物，黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育而成。在黄瓜果实上有一个重要的性状是果瘤，果瘤是黄瓜果实表面的瘤状突起。果瘤基因的研究始于1913年,有果瘤是黄瓜的野生性状,果瘤性状是由Tu (Tuberculate fruit)基因调控，有果瘤(Tu)为显性，无果瘤(Tu)为隐性。在经典遗传图谱上，果瘤基因(Tu，·Tuberculate fruit)和无光泽果皮基因(D)及一致果皮颜色基因(u, uniform immaturefruit color)紧密连锁在一起。曹辰兴通过分离群体的遗传分析结果表明控制茎、叶、果实表皮毛性状的无毛基因对控制果瘤性状的果瘤基因存在隐性上位作用(曹辰兴等.黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤刺性状的遗传关系.园艺学报，2001，28 ￠) :565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究将有助于揭示黄瓜果刺基因形成的分子机制，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。2009年张微微等得出黄瓜果瘤性状属于单基因显性性状，利用247个F2群体将果瘤基因初步定位于第五染色体SSR标记16203和SCAR标记C_SC933之间，遗传距离分别为I. 3cM和 5. 9cM,详细结果可以参看Zhang W W等在《Theoretical and Applied Genetics))(理论应用遗传学)2009年第120卷第3期645-654页发表的题为《Identificationand mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in thecucumber (Cucumis sativus L.)))(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记初步定位)一文,上述标记还存在分析群体相对较小，连锁距离相对较远等问题，候选区间存在100多个候选基因，也没有对候选基因分析。随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。黄瓜果实刺瘤性状属于感观品质范畴。欧美温室类型的黄瓜为无果瘤、少刺的果皮，称其为水果黄瓜，其市场价格为普通黄瓜的2-3倍。外观光滑黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，是无公害蔬菜的理想品种。经检测表明无瘤少刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27%，果皮农药残留量低18%。黄瓜果瘤基因Tu控制果瘤的形成，它的研究将会推动品质育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种的进程。
发明内容
本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供两个与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及的第一个与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，命名为DT-1，由序列表中SEQ ID NO. I所示的236个核苷酸组成，无果瘤基因不含有这236个核苷酸。世界各地有瘤黄瓜品种均含有该显性分子标记，无瘤黄瓜品种(除了突变体无毛无瘤品种gl)不含有该显性分子标记，该显性分子标记可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选。上述与果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，由SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物扩增得到。引物由上海生工合成。本发明涉及的第二个与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，命名为DT-2，由序列表中SEQ ID NO. 2所示的468个核苷酸组成，无果瘤基因不含有这468个核苷酸。世界 各地有瘤黄瓜品种均含有该显性分子标记，无瘤黄瓜品种(除了突变体无毛无瘤品种gl)不含有该显性分子标记，该显性分子标记可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选。上述与果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物扩增得到。引物由上海生工合成。用于控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因Tu的cDNA区域，由序列表中SEQ ID NO. 7所示的642个核苷酸组成，可以根据该基因设计更多的显性分子标记用于黄瓜的有瘤/无瘤(除了突变体无毛无瘤品种gl)类型的筛选、还可以为无毛基因，光泽基因的克隆提供分子基础。所述用于控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因Tu的cDNA区域来自于已经公布的黄瓜品种9330基因组序列Scaffold000083和gyl4黄瓜基因组序列Scaffold02633。本发明利用多种有瘤亲本和无瘤亲本杂交获得F1, F1再自交获得多种F2分离群体，确定黄瓜果瘤性状属于单基因显性性状。利用果瘤基因存在于SSR标记分子标记Y32和分子标记Y46之间的50Kb的序列，进行基因预测。这50Kb的序列同时存在于已经公布的黄瓜品种 9330 ScaffoId000083 和 gy 14 黄瓜基因组序列 ScaffoId02633 中(http://cucumber, vcru. wise, edu/wenglab/gy 14-9930/index, html)。对其中含有基因的 cDNA 区设计引物，查找多态性位点。开发果瘤基因共分离的标记和确定控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因的cDNA序列。本发明具有如下的有益效果本发明的两种显性分子标记与黄瓜果瘤性状完全共分离，所有世界各地的黄瓜品种均可以用这两个显性分子标记筛选有瘤/无瘤品种(除无毛无瘤黄瓜品种gl)。根据本发明中提供的控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因，可以设计多种显性分子标记，筛选有瘤/无瘤品种(除无毛无瘤黄瓜品种gl)，还可以为黄瓜无毛基因、光泽基因的克隆奠定分子基础。本发明中涉及的2个SSR分子标记Y32和Y46已于同日申请专利。
图I是SSR标记Y32和Y46之间50Kb的序列包含的3个候选基因结构示意图图中所示，I表示nudix水解酶基因；2为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；3为C2H2锌指蛋白基因。图2是2个显性分子标记DT-I和DT-2的PCR扩增效果图，图中所示，M代表MarkerDL2000, S52为有瘤亲本；S06为无瘤亲本R代表两亲本杂交后代；F2无果瘤单株和F2无果瘤单株分别代表在F2群体中随机挑选的10株有瘤和10株无瘤植株。图3是2个显性分子标记DT-I和DT-2对世界不同黄瓜品种的筛选效果蓝图图中所示，M代表Marker DL2000。
具体实施例方式一，遗传分离群体的构建与黄瓜果瘤基因的鉴定I.多种F2群体的构建构建F2群体所用到的无瘤自交系品种有欧洲温室类型自交系S06(母本)、·H34(母本)，S42。有瘤品种有中国自交系S110、S94、G1、华南类型自交系S52。本实施例利用这7个亲本配制了多种杂交组合，得到F1代，F1代自交或回交产生F2代群体。在多种F2群体鉴定有/无果瘤表型，最后分析F1表型和F2分离比，卡方分析法进行验证，最后得出黄瓜果瘤性状属于单基因控制的显性性状。2.黄瓜果瘤基因的鉴定2. I黄瓜基因组DNA的提取用CTAB法提取亲本及F2分离群体的叶片总DNA。2. 2确定果瘤基因序列用标记SSR标记Y32和Y46确定果瘤基因候选区域大概50Kb的序列，这50Kb的序列同时存在于已经公布的黄瓜品种9330基因组序列Scaffold000083和黄瓜品种gyl4基因组序列 Scaffold02633 中(http://cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)。用FGENESH软件和GENSCAN软件预测该候选区域，共包含3个基因(参见图I)，分别为 nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)水解酶、憐酸烯醇式丙酮酸羧激酶、C2H2锌指蛋白。针对每个基因的编码区设计引物扩增有瘤品种S52和无瘤品种S06两亲本，在前两个基因设计的引物序列扩增片段经测序后分析发现没区别，最后发现C2H2锌指蛋白基因序列中的标记DT-I和标记DT-2在两亲本产生很大差异，在有瘤亲本S52有该2个标记，在无瘤亲本S06中完全不存在2个标记。该2个显性分子标记在亲本S52和S06得到的2200株F2群体中已经完全共分离(参见图2)。该2个显性分子标记的PCR均为基因组 DNA30ng，引物 O. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/L MgCl2,1 X Taq 缓冲液，
O.5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μ L，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。显性分子标记DT-I 的 PCR 扩增程序为94°C 5min ；35cycles, 94°C 25s ；56°C 25s ；72°C 30s ；72°C 5min。显性分子标记DT-2 的 PCR 扩增程序为94°C 5min ；35cycles, 94°C 30s ；58°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。由于果瘤性状单基因控制的显性性状，推测该C2H2锌指蛋白基因就是目的基因。2. 3多态性片段的回收、克隆和测序在PCR产物中加入goldview荧光染料3ul，4°C下放置IOmin让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2ul，混匀后通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入I. 5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat. No. SKl 132。将回收产物与载体连接采用上海申能博彩公司的pUCm-T vector系统。用电击法将连有目标片段的T_vector转化进入E. coliDH5 α感受态细胞，将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培养箱培养过夜，挑菌、摇菌及PCR菌液检测，进行相关序列的测定。二，果瘤基因Tu的品种验证I.选取多种黄瓜品种由于推测C2H2锌指蛋白基因是控制果瘤性状的目的基因，随机对来自世界各地的22个黄瓜自交系品种对这2个显性分子标记进行验证其中无瘤品种有以色列亲本的S06、荷兰的 S46-2、S49-l、S49-2 和 S51-2，以色列的 S03、S04 和 S05，西班牙的 S75 和 S76,欧洲的H34，共11个无瘤黄瓜品种；有瘤品种有中国的S52、S94、S110、G1、M3、M12、419、493和S124-5，韩国的S112-7，美国的83G，共11个有瘤黄瓜品种。2.用2个显性分子标记验证22种黄瓜品种如图3所示，11种无果瘤品种均没出现DT-I和DT_2标记，而11种有果瘤品种均出现DT-I和DT-2标记。以上两种新开发的显性分子标记均存在于序列表中SEQ ID NO. 7所示果瘤基因Tu的cDNA区域的642个核苷酸中，经过分离群体验证和品种验证，由于都是特异性PCR扩增，·故两个显性分子标记具有高稳定性。所以本发明的两个显性分子标记可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选。本发明中的提供的果瘤基因的642个核苷酸序列还可以为黄瓜无毛基因和光泽基因的克隆奠定分子基础。本发明中PCR产物克隆测序中所使用的E. coli DH5a菌株已在文献《李欣等，电转化法制备高转化效率的E. coli感受态细胞研究。食品与生物技术学报，2007，26 (6) 48 51》中公开；本发明中涉及的E. coli DH5a菌株可通过公开市售的商业渠道取得，购于宝生物工程(大连)有限公司，公司地址大连经济技术开发区东北二街19号。
权利要求
1.一个与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，命名为DT-I，由序列表中SEQ IDNO. I所示的236个核苷酸组成,无瘤基因tu不含有该标记。
2.根据权利要求I所述的与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，其特征在于由SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物扩增得到，其扩增程序940C 5min ；35cycles, 94°C 25s ；56°C 25s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一个与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，命名为DT-2，由序列表中SEQ IDNO. 2所示的468个核苷酸组成,无瘤基因tu不含有该标记。
4.根据权利要求3所述的与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，其特征在于由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物扩增得到，其扩增程序为94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；58°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
5.用于控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因Tu的cDNA区域，由序列表中SEQID NO. 7所示的642个核苷酸组成，无瘤基因tu不含有该642个核苷酸。
6.根据权利要求5所述的用于控制黄瓜果瘤性状的果瘤基因Tu的cDNA区域，其特征在于由黄瓜品种9330基因组序列Scaffold000083和黄瓜品种gyl4黄瓜基因组序列Scaffold02633 得到。
全文摘要
本发明提供了两个与黄瓜果瘤基因Tu共分离的显性分子标记，第一个显性分子标记由序列表中SEQ ID NO.1所示的236个核苷酸组成；第二个显性分子标记由序列表中SEQ ID NO.2所示的468个核苷酸组成。本发明的两个显性分子标记均存在于序列表中SEQ ID NO.7所示果瘤基因Tu的cDNA区域中，两个显性分子标记都具有高稳定性，可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选。根据SEQ ID NO.7所示果瘤基因Tu的cDNA区域，还可以设计多对分子标记作为世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种g1)筛选的显性分子标记，果瘤基因Tu的cDNA区域还可以为黄瓜无毛基因和光泽基因的克隆奠定分子基础。
文档编号C12N15/29GK102925434SQ201210382888
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者蔡润, 杨绪勤, 何欢乐, 潘俊松, 任国良 申请人:上海交通大学