黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv的Indel标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明“黄瓜抗西瓜花叶病毒病基因wmv的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜西瓜花叶病毒病(WMV)抗性基因wmv紧密连锁的Indel标记，其中所述标记的引物的核苷酸序列为：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG；所述Indel标记扩增的与黄瓜WMV感病基因WMV连锁的特征条带为173bp，核苷酸序列见Seq ID No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜WMV抗病基因wmv连锁的特征条带为169bp，核苷酸序列见Seq ID No.2所示；采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其是否对WMV具有抗性，该标记具有高效、限制少的优点，对选育抗WMV的黄瓜育种材料提高了效率，缩短了育种周期。
【专利说明】黄瓜抗西瓜花叶病毒基因 wmv的Indel标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术辅助育种【技术领域】，特别涉及一种黄瓜中抗西瓜花叶病毒基 因 wmv的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
【背景技术】
[0002] 病毒病是影响黄瓜生产的主要病害之一，病原种类繁多，难以防治。其中西瓜花叶 病毒（Watermelon mosaic virus, WMV)就是引起该病的一种主要病原。WMV属于马铃薯Y 病毒属病毒，该病毒属世界各地均有分布。在自然界，主要以非持久性方式经蚜虫传播，也 可以经汁液的机械接种传染，可侵染葫芦科、豆科、藜科等多种植物种类。感病植株叶片表 现花叶、畸形、新生叶片扭曲，植株生长受阻，果实畸形。
[0003] 目前，在黄瓜上已经挖掘了一些抗WMV的种质资源，而且前人也利用了其中一些 抗病材料对黄瓜WMV抗性遗传规律及分子标记进行了初步研究，Cohen等（1971)研究发 现黄瓜栽培种Kyoto 3 Feet中存在抗WMV的显性基因 ；Wai (1995a)和Grumet (1995b)在 TMG-I中发现WMV的抗性分两种基因控制：一种是在子叶和全株均表现抗性的wmv-2,另一 种是只在真叶表现抗性的2个相互作用的上位基因 wmv-3和wmv-4。张海英等（2005)以感 病亲本自交系欧洲八号和抗病亲本自交系秋棚构建的RILs群体为材料，对WMV进行了抗病 性鉴定，研究表明抗病性状是受隐性单基因控制的，但同时也存在微效基因的修饰。目前报 道的与WMV抗性相关的遗传连锁标记有AFLP、RAPD、SSR标记，但是这些标记与抗病基因连 锁距离较远，并不能有效地应用于实际育种工作中。
【发明内容】
[0004] 基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜中抗WMV基因 wmv紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选对WMV抗病或感病的黄瓜种质资源上的 应用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一种与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的Indel标记，其特征在于：所述标记的 引物的核苷酸序列如下：
[0007] 碰vIndel3_F/VmvIndel3-R :
[0008] AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG
[0009] 所述引物扩增的与黄瓜感西瓜花叶病毒基因 WMV连锁的特征条带为173bp，其核 苷酸序列如Seq ID No. 1所示；
[0010] 所述引物扩增的与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的特征条带为169bp，其核 苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0011] 所述Indel标记在筛选具有抗西瓜花叶病毒基因 wmv的黄瓜种质资源中的应用， 其特征在于，包括如下步骤：
[0012] (1)采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所 述标记的引物的核苷酸序列如下：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R :
[0013] AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG ；
[0014] (2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
[0015] (3)从检测结果中筛选出现与抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的Indel标记特征条 带一致的材料，所述抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的Indel标记特征条带为169bp，其核苷 酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0016] 所述PCR扩增的反应体系为：1. 5ng/μ I DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ μ 1，0· 5 μ 1/μ I Go Taq? Green Master Mix，其余为双蒸水。
[0017] 所述PCR扩增的反应程序为：94°C预变性4分钟；94°C变性15秒，55 °C退火15秒， 72 °C延伸30秒，35个循环；72 °C保温5分钟，16 °C保存。
[0018] 所述凝胶电泳检测，指采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分 离，最后银染显色。
[0019] 本发明以感WMV高代自交系65G与抗WMV高代自交系02245为亲本构建F1J 2群体 及F2:3家系，通过苗期人工接种鉴定和ELISA检测，对黄瓜WMV抗性基因 wmv进行了遗传规 律分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现wmv基因在染色 体上的遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记wmv-Indel3,与wmv的遗传距离为I. 3cM。 所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜WMV感病基因 WMV连锁的特征条带为173bp，核苷 酸序列如Seq ID No. 1 ;所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜WMV抗病基因 wmv连锁 的特征条带为169bp，核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0020] 本发明通过利用54份不同遗传背景的黄瓜资源进行验证，结果表明wmv-lndel3 验证的正确率为83. 3% ·
[0021] 本试验不仅为黄瓜抗WMV基因 wmv的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为 利用分子标记辅助选育具有抗WMV基因的黄瓜新品种提供了高效途径。本发明基于开发的 Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定WMV抗性的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用 所述Indel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产 物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条169bp条带，这种为隐型纯合材料（抗WMV); 另一种是169bp条带和173bp条带都出现，这种是显性杂合材料（感WMV);第三种是仅仅 出现173bp条带，这种为显性纯合材料（感WMV)。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选 材料的任何阶段对其进行WMV抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1.采用本发明所述的wmvlndel3标记的特异性引物验证54份不同遗传背景的 黄瓜材料的电泳检测结果；
[0023] 黑体加粗字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范 围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获 得。
[0025] 牛物材料的来源和记载出处
[0026] 本研究所用的试验材料为黄瓜高代自交系65G和02245。以65G为母本，02245为 父本杂交，获得F1，自交获得F2群体及F2:3家系。
[0027] 黄瓜高代自交系65G(Pi):由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的欧洲温室型 黄瓜雌性系，生长势强，连续座果多，瓜长20多厘米，表面光滑无刺瘤，无苦味，抗黑星病， 感西瓜花叶病毒病（WMV)。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2006年在《园艺学报》第3期 第690页上发表的文章《黄瓜新品种'中农19号'》中也有记载。本实验室有保存，保证自 申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0028] 黄瓜1?代自受系02245 (P2):由中国农业科学院蔬菜花舟研究所选育的露地耐热 抗病自交系，华北型黄瓜，耐热性突出，分枝性强，腰瓜长约35厘米，刺瘤密，抗西瓜花叶病 毒病（WMV)，抗霜霉病，白粉病，枯萎病。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2008年在《中国 蔬菜》第6期第31-33页发表的文章《耐热黄瓜新品种中农106号的选育》中也有记载。本 实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0029] 54份不同遗传背景的黄瓜材料的具体来源和出处详见Zhang等于2010年在 ((Journal of the American Society for Horticultural Science〉〉第 135 期第 53-58 页 发表的文章 《Genetic Mapping of the Scab Resistance Gene in Cucumber》。其中 29 份 为抗性材料，25份为感病材料。
[0030] 重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文 ((A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity))
[0031] Indel标记引物是本实验室基于两亲本重测序的基因组信息、利用primer 3. 0软 件设计得到。
[0032] 丰要试剂
[0033] SSR引物来自国际黄瓜基因组计划（ICUGI) ;PCR实验使用Shanghai PromeGa公 司的 GoTaq Green Master Mix ;
[0034] 凝胶电泳使用康润公司的40%非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6%后使用。
[0035] 实施例1.与黄瓜抗WMV基因 wmv连锁的wmvlndel3标记的获得
[0036] 步骤1.黄瓜WMV苗期抗性鉴定
[0037] 本试验以黄瓜高代自交系65G(感病）和02245(抗病）为母本和父本，自交获得 FpF2群体及F2:3家系。2013年秋，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所病理课题组人工气候 室对F1及137个F2:3家系进行WMV苗期人工摩擦接种，其中每个家系种植15株，待第一片 真叶展平时，进行接种鉴定。
[0038] 待第一次接种20天后，进行调查，将病情划分为6个等级，分别为：0级，无症状；1 级，心叶明脉或轻花叶；3级，心叶及中部叶片花叶；5级，心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸 形、皱缩；7级，重花叶，多数叶片畸形、皱缩；9级，重花叶，叶片明显畸形，植株矮化，甚至死 亡。同时为了检测接种植株中病毒的含量，在调查后，采用了酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)方法对黄瓜植株的心叶中的病毒含量进行检测。根据调查 及ELISA检测结果判断植株对WMV是否有抗性，然后使用Microsoft Excel 2007及SAS9. 2 软件进行数据统计分析，判断分离比。
[0039] 结果显不：后代F1均表现感病；由F2:3豕系鉴定结果，可推断在F 2群体中，感病植 株有110株，抗病植株有27株。经卡方检测，符合3:1比例，表明在该群体中WMV抗性是受 一对隐性基因控制。
[0040] 步骤2. DNA提取和分子标记分析
[0041] 取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）法提取亲本及群体 各单株的基因组DNA。
[0042] PCR反应体系为：总反应体系IOyL, 3μ L DNA(5. Ong · μ Γ1)，正向和反向引物 (50ng · yL1)各 lyL，5yL Go "Taq? Green Master Mix (Promega 公司产品）。
[0043] 引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物（Ren et al. ,2009 ;Cavagnaro et al.， 2010)。
[0044] PCR 扩增程序为：94°C预变性 4min ;94°C变性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，35 个循环；72°C保温 5min，16°C forever。
[0045] 扩增产物用6 %非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0. 5 X TBE，150V恒功 率电泳分离I. 5h，电泳后银染显色，统计带型。
[0046] 步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建
[0047] 共显性标记的统计方法：与母本（65G) -致的带型记为a，与父本（02245) -致的 带型记为b，杂合的带型记为h。显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和 母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b ;若父本为显性标记，则分离群体中 和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。
[0048] 结果显示：
[0049] 用1288对SSR引物对P1 ^5G)和P2 (02245)进行筛选，其中在两个亲本间表现多 态的引物有296对，多态率23. 0%。结合BSA法建池，进一步筛选得到了 8个SSR多态性标 记。
[0050] 利用筛选出的多态性标记对65GX02245组合的F2群体进行分析，结合调查性状 数据利用J〇inmap4. 0构建连锁图。结果8个标记和目标性状（抗WMV)基因 wmv被定位在 同一连锁群上（L0D = 10)。
[0051] 将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱（Zhang et al.，2012)比较，发 现本连锁群的8对标记均分布在第6染色体，据此将wmv基因定位在第6染色体上。
[0052] 步骤4. Indel标记开发及wmv连锁群分子标记加密
[0053] 针对初定位的染色体区段，结合黄瓜基因组序列和两亲本重测序的数据，利用 primer 3. 0软件在目标区段（约2. 01M)共设计了 130对SSR标记引物和20对Indel标记 引物，对连锁群进行分析标记加密。用双亲筛选出有多态性的有8对标记。上群体后得到 一个总长度为19. OcM包含12个标记（初定位的其中4对+新设计的8对）的连锁群，获 得与黄瓜抗WMV基因 wmv连锁距离为I. 3cM的Indel标记wmvlndel3。
[0054] 步骤5. PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序
[0055] (1)目的片段的回收
[0056] 采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入I. 5mL的Eppendorf 管内，向管内加入100 μ L超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95°C 水浴锅（或PCR仪）中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3 μ L做模板进行 PCR扩增，剩余产物置-20°C保存备用。
[0057] (2)目的片段的纯化
[0058] 用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，_20°C过夜放 置，1，2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
[0059] (3)目的片段与载体的连接
[0060] 反应体系为 10 μ L :PMD18_T VectorL 0 μ L ;Ligation buffer I 5. 0 μ L ;目的片 段 4· Ομ L。
[0061] 在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16°C连接约lh，过夜也不影响连接 效率。
[0062] (4)连接产物的转化
[0063] 1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
[0064] 2)感受态（50 μ L) +5 μ LSolutionA+4 μ LSolutionB+46 μ L 预冷去离子水；
[0065] 3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到I. 5mL离心管，每管加入105 μ L，再加 入5 μ L的目的DNA，轻旋混匀；
[0066] 4) 42°C水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
[0067] 5)快速将管转移到冰浴器中，使细胞冷却3?5min ;
[0068] 6)加入500 μ L LB液体培养基。在37°C，150rpm摇床上预培养Ih ;
[0069] 7)将菌液涂布到含有 100 μ g .Hir1Amp、25 μ g .Hir1IPTG 和 40 μ g .Hir1X-GAL 的 LB 固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
[0070] 8)倒置平板，37°C培养12?16h。
[0071] (5)重组质粒的蓝白斑筛选
[0072] 经37°C培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色 菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中， 37°C，150rpm过夜培养。
[0073] (6)菌落PCR的检测
[0074] 吸取1 μ L菌液作为模板进行PCR扩增。取4 μ L PCR产物，经1. 5%琼脂糖凝胶电 泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致 的克隆即为阳性克隆。
[0075] (7)克隆后载体的测序与分析
[0076] 取3个阳性克隆菌液在甘油（330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液）中各保存两份， 一份-20°C保藏，一份送去测序。
[0077] 其中wmvlndel3标记引物wmvIndel3_F/wmvIndel3-R扩增出的与黄瓜感WMV基因 WMV连锁的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示；与黄瓜抗WMV基因 wmv连锁的特 征片段的核苷酸序Seq ID No. 2所示。
[0078] 实施例2.与黄瓜wmv基因连锁的wmvlndel3标记的验证
[0079] 用对实施例1获得的与wmv基因连锁的Indel标记wmvlndel3对54份不同遗传 背景的黄瓜材料进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施 例1中步骤2中的PCR扩增和检测方法。
[0080] 结果发现，在这54份材料中共有45个株系的带型反映的表型数据与田间调查结 果一致，经计算准确率为83. 3%，见图1。
【权利要求】
1. 一种与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的Indel标记，其特征在于：所述标记的 引物的核苷酸序列如下： wmvIndel3-F/wmvIndel3-R ： AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG 所述引物扩增的与黄瓜感西瓜花叶病毒基因 WMV连锁的特征条带为173bp，其核苷酸 序列如Seq ID No. 1所示； 所述引物扩增的与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的特征条带为169bp，其核苷酸 序列如Seq ID No. 2所示。
2. 权利要求1所述Indel标记在筛选具有抗西瓜花叶病毒基因 wmv的黄瓜种质资源中 的应用，其特征在于，包括如下步骤： (1) 采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述 标记的引物的核苷酸序列如下：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R :AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/ TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG ； (2) 对扩增结果进行凝胶电泳检测； (3) 从检测结果中筛选出现与抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的Indel标记特征条带一 致的材料，所述抗西瓜花叶病毒基因 wmv连锁的Indel标记特征条带为169bp，其核苷酸序 列如Seq ID No. 2所示。
3. 根据权利要求2所述的应用，其中，所述PCR扩增的反应体系为：1. 5ng/μ I DNA模 板，所述引物正向和反向各5ng/μ 1，0· 5 μ 1/μ I Go Taq? Green Master Mix,其余为双蒸 水。
4. 根据权利要求2或3所述的应用，其中，所述PCR扩增的反应程序为：94°C预变性4 分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保 存。
5. 根据权利要求2-4任一所述的应用，其中所述凝胶电泳检测，指采用6 %的非变性聚 丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
【文档编号】C12Q1/68GK104372085SQ201410608279
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】顾兴芳, 张圣平, 苗晗, 田桂丽, 王烨, 杨宇红, 谢丙炎 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所