专利名称：一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术，涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒。
背景技术：
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus, CGMMV),是完菁花叶病毒科(Tymoviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员。该病毒主要侵染葫芦科作物，可引起黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、笋瓜、无花果、叶瓜等葫芦科作物叶片黄化畸形、生长缓慢、结果延时、果实大部分黄化变白并产生黑绿色水疤状的坏死斑，产量损失可高达15%。世界上许多国家和地区将黄瓜绿斑驳花叶病毒列为葫芦科作物的重要检疫性病毒。2006年12月，我国将黄瓜绿斑驳花叶病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)粒子主要分布于植物的叶片、表皮、薄壁组织、木质部、韧皮部及其他各部的细胞质和细胞液泡内。黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的检测方法有生物学方法、电子显微镜技术、血清学技术、分子生物学技术等。生物学检测可以确定CGMMV的侵染性、传播方式和寄主范围，但所需时间长、工作量大，靠肉眼观察，稳定性和可靠性不高。电子显微镜技术需要很高的硬件要求、专业知识要求，不适用于规模化、现场检测。随着分子生物学的发展与应用，运用分子生物学技术进行CGMMV检测的方法越来越多，尤其是基于聚合酶链式反应(PCR)的反转录(RT-)PCR，实时荧光RT-PCR。但是该方法需要昂贵且专业的仪器设备，尤其是实时荧光RT-PCR，所用耗材也价格不菲，操作也是需要经过专业培训的人员才能胜任，而且样品及操作容易出现污染而造成假阳性。而基于抗体的捕获ELISA、胶体金试纸条等方法可以快速、灵敏地检测CGMMV病毒，适于在大规模的监测系统中应用和现地检测。而捕获ELISA、胶体金试纸条等方法的应用依赖于CGMMV病毒的特异性单克隆抗体的研制。但目前为止，尚未有见灵敏度好、特异性强、效价高的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV的单克隆抗体的报道。
发明内容
根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种灵敏度好、特异性强的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV的单克隆抗体，本发明单克隆抗体可以应用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒。一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No. 6958，所述杂交瘤细胞株的获得是通过将黄瓜绿斑驳花叶病毒毒源接种在葫芦上制备黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)粒子提纯液，并纯化的，用将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV )粒子提纯液免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,后对上述细胞进行培养,进一步亚克隆,筛选出一株针对黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)粒子的单克隆抗体，及分泌这些单克隆抗体的杂交瘤细胞，纯化并保藏。
一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌而得。上述单克隆抗体在检测黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的反应载体，其特征在于，所述反应载体上直接或间接包被有上述单克隆抗体。一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，其特征在于，包含有上述的反应载体。所述反应载体是基于免疫反应原理的检测仪器，可以是荧光化学检测板、酶联免疫检测板等，本发明实施例优选的是酶标板。一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的胶体金试剂盒，其特征在于，在金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗CGMMV的单克隆抗体，即Au-McAb ;检测线上包被有兔抗CGMMV多抗，即CGMMV-Pc ;检测时，当样本中存在CGMMV，则与Au-McAb形成复合物，进而与检测线的 CGMMV-Pc结合，显色。本发明试剂盒可以用于鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒，辅助鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒以及辅助鉴定待测植物样本是否感染黄瓜绿斑驳花叶病毒。本发明提供的单克隆抗体用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒，具有特异性好、敏感性强、效价高等优点。本发明研制的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体可用于研制黄瓜绿斑驳花叶病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。本发明酶联免疫检测试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的黄瓜绿斑驳花叶病毒抗原。先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被兔抗黄瓜绿斑驳花叶病毒粒子的多克隆抗体，当加入的样品中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒时，微孔中预包被的多克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体与之结合，然后通过酶催化底物的显示程度来判断结果。当标本中不含黄瓜绿斑驳花叶病毒时，底物不会显色。可检测的标本包括种子、叶片等待检测物的研磨液等。本发明胶体金试剂盒是采用胶体金免疫层析技术研制的双抗体夹心法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒(以下简称CGMMV)的新一代诊断试剂，可检测种子、叶片等标本中是否含有CGMMV。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需要任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30min。本试剂盒分别在硝酸纤维素膜上用兔抗CGMMV多抗(即CGMMV-Pc)包被检测线，用葡萄球菌A蛋白(即SPA)包被对照线；在标记物垫上用胶体金标记抗CGMMV的单克隆抗体(即Au-McAc)。检测时，如果样本中存在CGMMV，则与Au-McAb形成复合物，在层析作用下，沿膜层析至检测线，并与CGMMV-Pc形成的肉眼可见的紫红色检测线；而未结合CGMMV的Au-McAb继续层析至对照线，与SPA结合也形成肉眼可见的紫红色对照线。如果样本中无CGMMV,则只有一条紫红色对照线。本发明单克隆抗体具有如下优点1.特异性好、敏感性强、效价高；2.可用于基于免疫反应的检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂及试剂盒；3.能应用于各地进行黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测；4.应用本发明单克隆抗体并且基于免疫反应的试剂盒灵敏特异，快速方便。杂交瘤细胞保藏信息杂交瘤细胞株名称黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMMV 2G5
菌株分类小鼠杂交瘤细胞系保藏编号为CGMCCNo. 6958保藏日期2012年12月13日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏地址为北京市朝阳区大屯路
图1为本发明胶体金试剂盒检测结果示意图
图2为本发明黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体腹水效价测定
具体实施例方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。本发明实验材料的来源生物材料黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、辣椒轻斑驳病毒、齿瓣兰环斑病毒、烟草花叶病毒均由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所惠赠。申请人:声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。试剂的来源及规格
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No. 6958。
2.—种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌而得。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。
4.一种用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的反应载体，其特征在于，所述反应载体直接或间接包被有权利要求2所述单克隆抗体。
5.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求4所述的反应载体。
6.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的胶体金试剂盒，其特征在于，在金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的单克隆抗体，即Au-McAb ;检测线上包被有兔抗黄瓜绿斑驳花叶病毒多抗，即CGMMV-Pc ;检测时，当样本中存在黄瓜绿斑驳花叶病毒，则与Au-McAb形成复合物，进而与检测线的CGMMV-Pc结合，显色。
全文摘要
本发明提供了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体及试剂盒，本发明获得了分泌黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所得到的黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体具有灵敏度好、特异性强、效价高等优点，可用于鉴定待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒，鉴定待测样本是否感染黄瓜绿斑驳花叶病毒。所述单克隆抗体可用于制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。
文档编号C12R1/91GK102994455SQ201210581888
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者陈西钊, 孙明, 张丽, 马永缨, 迟立超, 秦亚嫚 申请人:北京世纪元亨动物防疫技术有限公司