重组水痘－带状疱疹病毒的制作方法

专利名称：重组水痘－带状疱疹病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组水痘一带状疱疹病毒，特别是利用BAC (大肠杆菌人工染色体)制备的重组水痘一带状疱疹病毒，以及包含此种病毒的药物组合物。此外，本发明还涉及包含水痘一带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体，以及包含此种载体的细胞。本发明还涉及制备重组水痘一带状疱疹病毒的方法。再有，本发明涉及包含能与水痘一带状疱疹病毒基因组进行同源重组的片段以及BAC载体序列的核酸盒。
背景技术：
水痘一带状疱疫病毒(varicella — zoster virus ;VZV)是属于人疱疫病毒科(Herpesviridae)的病毒，是表现出两种不同临床表象疾病(水痘和带状疱疹)的病因。这种病毒的初期感染弓I起水痘(水疱疮)。其后，此种病毒潜伏感染神经节，经年累月后由于某种诱因重新活化引发带状疱疹(形成病毒颗粒，通过神经传导，达到表皮细胞，在神经分布的区域形成水痘症状)。VZV基因组是双链DNA，包含约125000个碱基。全部的碱基序列已由Davison等人确定，已知该基因组中至少存在着72个基因。VZV疫苗的研发困难重重。VZV疫苗Oka株是由高桥等人开发的(特公昭53 —41202号)，是世界上唯一针对水痘一带状疱疹病毒的疫苗。现有的减毒活水痘疫苗是利用以来源于减毒水痘病毒Oka株的病毒作为种子制备的，目前在世界各国广泛应用(Requirements forVaricella (Live)Adopted 1984 ；Revised 1993:WH0 TechnicalReportSeries, N0.848, pp.22 — 38,1994)。这一 Oka株是由如下方式获得的，即将从表现典型的水痘症状的患儿分离的病毒(Oka原株)，利用人胎儿肺细胞在34°C下传代12代，再利用豚鼠胚胎细胞传代11代，然后利用人二倍体细胞传代数代来获得。所述的Oka原株虽然具有强病源性，但Oka疫苗株(Oka株)即使对正常的儿童接种也几乎没有发现副作用。因此，Oka株作为几乎没有病源性的疫苗株是有用的。病毒疫苗在进行传代培养时有可能改变其基因型。另外，由在Oka株自身的制备过程中经过多次传代培养，Oka株自身也可能具备遗传多样性。实践中，为了确保疫苗的安全性和有效性，考虑到在制备疫苗过程中，由于传代培养所导致的疫苗遗传改变，制定了种子批次系统作为对认可进行生产的水痘种子病毒的传代数的限制，即以确认种子时的传代数为O代，并把从O代开始总传代数在10代以内的病毒用作疫苗。另一方面，通过水痘疫苗的效果追踪，以及售后调查(PMS:post — marketingSurveillance)，从流行病学的观点，有必要对从自然感染的水痘患者分离的水痘病毒的新鲜野生株与来自上述Oka株的疫苗株之间的病毒学差异进行分析，故已进行了应用免疫学和遗传工程学进行分析的多种尝试。例如，已有基于下述文献进行的试验报道，即水痘病毒株间基因结构、DNA喊基序列之间的差异(Journal of GeneralVirology, 59,660 一 668,1986 ;同前 67，1759 — 1816，1986)，限制酶 Pst I 酶切位点的有无(Japanese Journal ofExperimental Medicine, 59，233 一 237，1989)，根据应用 PCR(聚合酶链式反应)进行的 RFLP(限制性片段长度多态性)判定(Journal of Virology,66,1016 一 1020，1992)，以及将上述Pst I 酶切位点的有无与 RFLP 分析相结合(Journalof Clinical Microbiology, 33,658 —660,1995).尽管通过这些试验提出了为鉴别新鲜的野生型菌株与来自Oka株的疫苗株的条件，但考虑到Oka株自身的遗传多样性的问题，仍缺乏可信性，且不具备确定性，故而仍然存在疫苗的品质管理问题。再有，已知有利用水痘病毒的基因14区域鉴定水痘病毒Oka株的方法(US Patent N0.6，093，535)，利用基因62区域鉴定减毒活水痘疫苗病毒株的方法(W0 00/50603)，这些方法中的任意一种技术均可以用于鉴定水痘病毒Oka株(强毒亲株)，由亲株衍生的疫苗株(减毒的Oka株)，以及Oka株之外的水痘病毒株之间的差异。但是以用于减毒活水痘疫苗的品质管理和品质保证的制剂标准尚不完备。目前，用于评定和确认疫苗品质的方法，还没有进行例如，通过对种子病毒和疫苗病毒的基因组DNA以直接的或定·量的遗传分析进行品质管理，因此用作活疫苗的减毒株的品质管理和品质保证的准确度无法计算，故而含混不清。因此，提高品质管理和品质保证的准确度对于确保减毒活水痘疫苗的有效性。安全性 均质性至关重要。然而，如上所述，由于尚未确立其方法，使其成为亟待解决的课题。此外，为了研制出一种优于Oka株的、经改变的水痘一带状疱疹病毒疫苗，也需要开发经诱变的重组水痘一带状疱疹病毒及其制备方法。专利文献1:特公昭53 — 41202号专利文献2:米国特许第6，093，535号专利文献3:国际公开番号WO 00/50603非专利文献1:Requirements for Varicella Vaccine (Live)Adopted 1984 ；Revised 1993:WH0 Technical Report Series, N0.848, pp.22-38,1994非专利文献2:Journal of General Virology, 59,660-668,1986非专利文献3:Journal of General Virology,67,1759-1816,1986非专利文献4Japanese Journal of Experimental Medicine, 59, 233-237,1989非专利文献5 Journal of Virology, 66,1016-1020,1992非专利文献6:Journal of Clinical Microbiology, 33,658-660,199
发明内容
本发明的一个目的在于提高水痘带状疱疹疫苗的品质控制和品质保证的精度，以确保、保证减毒活水痘疫苗的有效性，安全性和均质性。此外，本发明的课题还在于为了研制一种优于Oka株的，经改变的水痘一带状疱疹病毒疫苗，建立通过诱变生产重组水痘一带状疱疹病毒的方法，并提供此种病毒。为实现上述目的，本发明提供了重组水痘一带状疱疹病毒，及其生产方法，例如利用BAC (大肠杆菌人工染色体)由单一病毒株生产重组水痘一带状疱疹病毒的方法。发明概述本发明人通过开发利用BAC载体序列制造重组水痘一带状疱疹病毒的方法，完成了本发明。本发明提供了下述内容。1.重组水痘一带状疱疫病毒。2.1项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，包含BAC载体序列。3.如2项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，至少部分BAC载体序列插入到水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中。4.如3项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域选自下述区域:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因5`8的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。5.如4项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。6.如2项所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，至少部分BAC载体序列插入到水痘一带状疱疹病毒基因组的基因62的ORF区域。7.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。8.如2项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含选择
己 O9.如8项中所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是药物选择
己 O10.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。11.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。
12.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。13.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。 14.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组在基因62和基因6中带有突变。15.如14项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的基因62在SEQ ID N0.5中至少包含下述(a) - (d)中的碱基取代:(a)第2110位的G取代;(b)第3100位的G取代；(c)第3818位的C取代；和(d)第4006位的G取代， 以及前述基因6在SEQ ID N0.8的碱基序列中至少具有第5745位碱基是G的碱基取代。16.如2项中的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列是具有SEQID N0.:7中所示序列的载体。17.包含I项中所述病毒的药物组合物。18.如17项所述的药物组合物，其中，组合物是疫苗的形式。19.载体，其包含除基因62之外的水痘一带状疱疹病毒基因组必需基因和BAC载体序列。20.如19项所述的载体，其进一步包含基因62。21.如19项所述的载体，其中，当所述载体插入哺乳动物细胞时，哺乳动物细胞产生水痘一带状疱疫病毒。22.如19项所述的载体，其中，来自前述水痘一带状疱疹病毒基因组的序列与BAC载体序列相连的部分位于该水痘一带状疱疹病毒基因组非-必需区域内。23.如22项所述的载体，其中，所述的非必需区域选自下述区域:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。24.如23项所述的载体，其中，所述的连接部分是基因11的ORF侧翼区域或基因12的ORF侧翼区域。25.如19项所述的载体，其中，所述的来自水痘一带状疱疹病毒基因组的序列与前述BAC载体序列相连的部分位于水痘一带状疱疹病毒基因组中基因62的ORF中的区域内。26.如19项所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。27.如19项所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。28.如27项所述的载体,其中,所述的选择标记是药物选择标记。29.如27项所述的载体，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。30.如19项所述的 载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。31.如19项所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。32.如19项所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。33.如19项所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组带有在基因62和基因6中的突变。34.如33项中的载体，其中，所述的基因62在SEQ ID N0.5中至少包含下述(a) —(d)中的喊基取代:(a)第2110位的G取代;(b)第3100位的G取代；(c)第3818位的C取代；和(d )第4006位的G取代，此外，基因6在SEQ ID N0.8的碱基序列中至少包含第5745位碱基是G的碱基取代。35.如19项所述的载体，其中，是所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列的载体。36.包含19项所述载体的细胞。37.如36项所述的细胞，其中，所述的细胞是细菌细胞。38.如37项所述的细胞，其中，所述的细菌细胞是大肠杆菌细胞。39.如36项所述的细胞，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。40.如39项所述的哺乳动物细胞，其中，所述的哺乳动物细胞是来自人的细胞。41.由如39项所述的哺乳动物细胞产生的病毒。
42.包含如41项所述病毒的药物组合物。43.如42项所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗形式。44.生产重组水痘一带状疱疹病毒的方法，它是重组水痘一带状疱疹病毒的生产方法，该方法包含以下步骤:将含有除基因62之外的水痘一带状疱疹病毒基因组必需基因与BAC载体序列的载体导入哺乳动物宿主细胞的步骤；和培养该哺乳动物宿主细胞，产生重组水痘一带状疱疹病毒的步骤。45.如44项所述的方法，其中，所述的载体还包含基因62。46.如44项所述的方法，其中，所述的哺乳动物宿主细胞来源于人。47.如44项所述的方法，其中，所述的BAC载体序列至少包含两种重组蛋白依赖的重组序列。

48.如47项所述的方法，其中，进一步包含引起上述两个重组蛋白依赖的重组序列之间重组的步骤。49.如44项所述的方法，其中，来自前述水痘一带状疱疹病毒基因组的序列与BAC载体序列相连的部位位于该水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域内。50.如49项所述的方法，其中，所述的非必需区域选自下述区域:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。51.如50项所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF侧翼区域或基因12的ORF侧翼区域。52.如44项所述的方法，其中，所述的来自水痘一带状疱疹病毒基因组的序列与BAC载体序列相连接的部分位于水痘一带状疱疹病毒基因组的基因62的ORF区域内。
53.如44项所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。54.如44项所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。55.如第54项所述的方法,其中，所述的选择标记是药物选择标记。56.如第54项所述的方法，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。57.如44项所述的方法，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。58.如44项所述的方法，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。59.如44项所述的方法，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。60.如44项所述的方法，其中，前述水痘一带状疱疹病毒基因组具有基因62和基因6中的突变。61.如第60项所述的方法，其中，所述的基因62在SEQ ID N0.5中至少包含下述(a) - (d)中的碱基取代:(a)第2110位的G取代;(b)第3100位的G取代；(C)第3818位的C取代；和(d)第4006位的G取代，此外，基因6包含在SEQ ID N0.8的碱基序列中至少第5745位碱基是G的碱基取代。62.如44项所述的方法，其中，是所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列的载体。63.如第44项所述方法所生产的病毒。64.药物组合物，其包含如第63项所述的病毒。65.如第64项所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。66.向如第19项所述的载体中导入突变的方法，包括以下步骤:将所述载体导入细菌宿主细胞的步骤；将包含由水痘一带状疱疹病毒基因组的一部分组成的片段的质粒载体导入该细菌宿主细胞的步骤，其中，所述片段至少具有一个突变；培养所述的细菌宿主细胞的步骤；由经培养的细菌宿主细胞分离具有BAC序列的载体的步骤。67.向如第19项所述的载体中导入突变的方法，包括以下步骤:将所述载体导入细菌宿主细胞的步骤；将包含由水痘一带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第一片段的第一质粒载体导入所述细菌宿主细胞的步骤，其中，所述的第一片段至少具有一个变异；

将包含由水痘一带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第二片段的第二质粒载体导入所述细菌宿主细胞中的步骤，其中，所述的第二片段至少具有一个变异，所述的第二片段与第一片段不同；培养所述细菌宿主细胞的步骤；
从所培养的细菌宿主细胞分离具有BAC载体序列的载体的步骤。68.核酸盒，其包含在细菌细胞内可以与水痘一带状疱疹病毒基因组同源重组的第一片段，BAC载体序列，和在细菌细胞内可以与水痘一带状疱疹病毒基因组同源重组的第二片段的核酸，其中，所述的BAC序列两端分别与第一片段和第二片段相连。69.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为lkb。70.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为1.5kb。71.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为2kb。72.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘一带状疱疫病毒基因组序列至少80%同一。73.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘一带状疱疫病毒基因组序列至少85%同一。74.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘一带状疱疫病毒基因组序列至少90%同一。75.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘一带状疱疫病毒基因组序列至少95%·同一。76.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地来自选自下述的水痘一带状疱疹病毒基因组的区域:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域，基因70的ORF的侧翼区域。77.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘一带状疱疹病毒基因组的区域至少80%同一，所述的区域为:
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。78.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘一带状疱疹病毒基因组的区域至少85%同一，所述的区域为:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的`ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。79.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘一带状疱疹病毒基因组的区域至少90%同一，所述的区域为:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。80.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘一带状疱疹病毒基因组的区域至少95%同一，所述的区域为:基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF 中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。81.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段来自不同的区域。82.如第72项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地来自于基因11的ORF的侧翼序列和基因12的ORF的侧翼序列。83.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。84.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。85.如第84项所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。

86.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。87.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。88.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。89.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。90.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含SEQ ID N0.:7所示的序列。91.如第68项所述的核酸盒，其具有SEQ ID N0.:2所示的核酸序列。本发明提供重组水痘一带状疱疹病毒及其生产方法。例如，本发明提供利用BAC(大肠杆菌人工染色体)由单个的病毒株生产重组水痘一带状疱疹病毒的方法，以及由该方法生产的重组水痘一带状疱疹病毒。此外，本发明还提供包含所述重组水痘一带状疱疹病毒的药物组合物。本发明还提供包含水痘一带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体，包含所述载体的细胞，以及包含能与水痘一带状疱疹病毒基因组同源重组的片段以及BAC载体序列的核酸盒。


图1是显示水痘一带状疱疹病毒Oka株基因组和重组水痘一带状疱疹病毒的结构的模式图。图2是水痘一带状疱疫病毒Oka株(未株)基因组与重组水痘一带状疱疫病毒(rV02)的体外增殖比较图。优选实施方案的描述
以下，对本发明进行说明。在整个说明书中，只要没有特别说明，单数表达形式应当理解为也包含其复数形式的概念范畴。只要没有特别说明，本说明书中所使用的术语应理解为本领域通常所指的含义。因而在没有其它定义的情况下，本说明书中所使用的全部专业术语和科技用语，应理解为本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。当发生矛盾时，首先依照本说明书(包括定义)。以下对本发明进行说明。在本说明书中，只要没有特别说明，单数表达形式应当理解为包含其复数形式的概念范畴。因此，单数形式的冠词(例如英语中的“a”，“an”，“the”)在没有特别说明的情况下也包含其复数形式的概念范畴。在没有特别说明的情况下，本说明书中所使用的术语应理解为本领域通常所指的含义。因而在没有其它定义的情况下，本说明书中所使用的全部专业术语和科技用语，应理解为与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。发生矛盾时，优先依照本说明书中(包括定义)。术语的定义以下列举的是本说明书中特别使用的术语的定义。在本说明书中使用时，水痘一带状疱疹病毒的“必需基因”是指水痘一带状疱疹病毒增殖所必需的基因。水痘一带状疱疹病毒的“非必需基因”指对于非水痘一带状疱疹病毒增殖所必需的基因，即使缺失了这些“非必需基因”，水痘一带状疱疹病毒仍然可以增殖的基因。作为水痘一带状疱疹病毒的非必需基因，例如包括但不限于:基因7，基因8，基因9，基因10，基因11，基因12，基因13，基因14，基因15，基因17，基因18，基因19，基因38，基因39，基因46，基因47，基因48，基因49，基因50，基因56，基因57，基因58，基因59，基因61，基因63，基因64，基因65，基因66，基因67，基因68，基因69和基因70。当病毒基因组中的基因为必需基因时，由于该基因被破坏，病毒将不能增殖。因此，当病毒基因组中的任意基因被破坏后，通过检测病毒的增殖情况即可判断被破坏的基因是必需基因还是非必需基因。

本说明书中所述的水痘一带状疱疹病毒的“野生株”指未经人工修饰，从自然界中分尚的水痘一带状疱疫病毒株。作为野生株例如，包括但不限于Davison, A.J.and Scott,J.E.(J.Gen.Virol.67 (Pt 9)，1759 — 1816 (1986)鉴定的 Dumas 株。Dumas 株的核酸序列如SEQ IDN0.:5所示。该Dumas株的ORF的编号及其位置如下:
权利要求
1.重组、减毒水痘一带状疱疹病毒，其包含BAC载体序列，其中，至少部分前述BAC载体序列插入到水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中，并且其中，前述非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。
2.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF和基因12的ORF之间的区域。
3.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒,其中,所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
4.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
5.如权利要求4所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
6.如权利要求1所述 的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
7.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。
8.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒,其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
9.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
10.如权利要求1所述的重组水痘一带状疱疹病毒,其中,所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
11.包含权利要求1所述病毒的药物组合物。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。
13.载体，其包含水痘一带状疱疹病毒必需基因和BAC载体序列，其中，一部分BAC载体序列位于该水痘一带状疱疹病毒基因组的非必需区域内，所述的非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。
14.如权利要求13所述的载体，其进一步包含基因62。
15.如权利要求13所述的载体，其中，当所述载体插入哺乳动物细胞时，哺乳动物细胞产生水痘一带状疱疫病毒。
16.如权利要求13所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF与基因12的ORF之间的区域。
17.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
18.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
19.如权利要求18所述的载体，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
20.如权利要求18所述的载体，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
21.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。
22.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
23.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
24.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
25.包含权利要求13所述载体的细胞。
26.如权利要求25所述的细胞，其中，所述的细胞是细菌细胞。
27.如权利要求26所述的细菌细胞，其中，所述的细菌是大肠杆菌。
28.如权利要求25所述的细胞，其中，所述的细胞是哺乳动物细胞。
29.如权利要求28所述的哺乳动物细胞，其中，所述的哺乳动物细胞来源于人。
30.如权利要求28所述的哺乳动物细胞产生的病毒。
31.包含如权利要求30所述的病毒的药物组合物。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述的组合物是疫苗的形式。
33.生产重组、减毒水痘一带状疱疹减毒病毒的方法，该方法包含以下步骤: 将含有水痘一带状疱疹病毒基因组必需基因与BAC载体序列的载体导入到哺乳动物宿主细胞中的步骤；和 培养所述的哺乳动物宿主细胞，生产重组水痘一带状疱疹病毒的步骤，其中，所述BAC载体序列位于该水痘一 带状疱疹病毒基因组的非必需区域内，所述的非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域，或基因12的ORF的侧翼区域。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的哺乳动物宿主细胞来源于人。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列至少包含两种重组蛋白依赖的重组序列。
36.如权利要求35所述的方法，其进一步包含在上述两种重组蛋白依赖的重组序列之间的重组步骤。
37.如权利要求33所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF和基因12的ORF之间的区域。
38.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
39.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
42.如权利要求33所述的方法，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。
43.如权利要求33所述的方法，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
44.如权利要求33所述的方法，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
45.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
46.如权利要求33所述的方法制备的病毒。
47.包含权利要求46所述病毒的药物组合物。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。
49.将突变导入如权利要求13所述的载体中的方法，该方法包括以下步骤: 将所述载体导入到细菌宿主细胞中的步骤； 将包含由水痘一带状疱疹病毒基因组的一部分组成的片段的质粒载体导入该细菌宿主细胞的步骤，其中，所述片段至少具有一个突变； 培养所述的细菌宿主细胞的步骤； 由经培养的细菌宿主细胞分离具有BAC载体序列的载体的步骤。
50.向如权利要求13所述的载体中导入突变的方法，该方法包括以下步骤，将所述载体导入细菌宿主细胞的步骤； 将包含由水痘一带状疱疫病毒基因组的一部分组成的第一片段的第一质粒载体导入所述细菌宿主细胞的步骤，其中，所述的第一片段至少具有一个变异； 将包含由水痘一带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第二片段的第二质粒载体导入所述细菌宿主细胞的步骤，其中，所述的第二片段至少具有一个变异，并且所述的第二片段与第一片段不同； 培养所述细菌宿主细胞的步骤； 从所培养的细菌宿主细胞分 离具有BAC载体序列的载体的步骤。
51.核酸盒，其包含能够在细菌细胞内与水痘一带状疱疹病毒基因组基因组同源重组的第一片段，BAC载体序列，能够在细菌细胞内与水痘一带状疱疹病毒基因组基因组同源重组的第二片段，其中，所述的BAC序列两端与第一片段和第二片段相连，所述的第一片段和第二片段分别独立地选自基因11的ORF的侧翼区域，或基因12的ORF的侧翼区域。
52.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为lkb。
53.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段来自不同的区域。
54.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体包含重组蛋白依赖的重组序列。
55.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
56.如权利要求55所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
57.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
58.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自野生株。
59.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
60.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘一带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
61.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含SEQID N0.:7所示的序列。
62.如权利要求51所述的核酸盒，其具有SEQID N0.:2所示的核酸序列。
全文摘要
本发明提供重组水痘－带状疱疹病毒及其制备方法，和包含重组水痘－带状疱疹病毒的药物组合物；还提供包含所述水痘－带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体、包含这种载体的细胞以及能与水痘－带状疱疹病毒进行同源重组的片段、包含所述的BAC载体序列的核酸盒。为此，本发明通过开发利用BAC载体序列制备重组水痘－带状疱疹病毒的方法，解决了上述课题。
文档编号C12N7/04GK103074305SQ20121058160
公开日2013年5月1日 申请日期2005年3月3日 优先权日2004年3月5日
发明者长池和宏, 森康子, 五味康行, 高桥理明, 山西弘一 申请人:财团法人阪大微生物病研究会