一种百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒双向胶体金免疫层析速测卡及制备方法
【专利摘要】一种百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡及制备方法，采用双向免疫层析技术，该速测卡可一次性同时快速检测LSV、LMoV和CMV，无需任何仪器和设备，较LSV和LMoV单一或LSV+LMoV复合胶体金免疫层析试剂卡，本发明速测卡检测效率更高，检测成本进一步降低，一次性检测病毒种类更齐全；此外，其操作简便，携带方便，检测快速、特异性强、重复性好，相对于PCR方法，假阳性率低于1％。可见本发明特别适用于在田间推广应用，并且可靠性很高。
【专利说明】一种百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒双向胶体金免疫层析速测卡及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能实现百合三种常见病毒快速检测的速测卡及制备方法，具体指运用胶体金免疫层析法，研制出同时能快速检测百合隐症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)和百合黄瓜花叶病毒(CMV)的双向复合速测卡及其制备方法。
【背景技术】
[0002]百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本植物,是一种集观赏、食用、药用价值于一身的重要经济作物。在中国，食用和药用百合产业发展较好。食用百合属于稀有特种蔬菜，是具有清热润肺、增强免疫力等保健功能的绿色食品，市场需求量很大，尤其是兰州百合以含糖量高，粗纤维少，肉质细腻，营养丰富而享有很高的声誉。目前，兰州市及周边等地兰州百合的种植面积近10万亩，产值11.6亿元，直接参与百合种植的农户已超过9万户，百合种植已成为产区农户的主要收入来源。对于切花百合，我国上世纪80年代末就开始了切花生产，但自繁百合种球普遍存在紧实度不够、病毒病等病害严重、切花品质差等问题，种球质量难以达到国外同类产品的水平。由于缺乏自繁种球的技术和能力，国内百合切花生产中90%以上的种球依赖进口，每年进口百合种球1.5亿个，耗资巨大。
[0003]近年来，随着国内百合种植面积的扩大，无性繁殖使病毒广泛传播并积累，其中，由三种主要病毒(百合斑驳病毒-Lily mottle virus, LMoV、百合黄瓜花叶病毒-Cucumbermosaic virus, CMV、百合隐症病毒-Lily symptomless virus, LSV)引起的病毒病在百合产区普遍发生，自然发病率一般在20%?30%，有的70%以上，严重者可高达100%，且病毒大多是以两种或三种病毒复合侵染的形式存在。LMoV侵染的百合症状主要表现为百合叶片有斑驳条纹甚至坏死斑，后期发展为花、叶片卷曲畸形，开碎色花，并常伴随植株矮小、花与球茎的减产等；CMV侵染的百合植株通常矮化，严重时叶片出现反卷、枯萎，茎畸形，鳞片短，不能开花；而LSV侵染的百合植株没有明显症状，但鳞茎缩小，切花寿命减短，LSV与CMV或LMoV复合侵染时，将导致百合出现坏死斑，田间部分敏感植株易产生条纹，发病严重时整株枯死。病毒病可使食用百合的产量由每亩3000斤降至1200斤，甚至更少。2012年7月，兰州百合产区发生了严重的病毒病等病害，导致百合大面积枯死，给农户带来了巨大的经济损失。病毒病已造成百合种源严重退化，已是制约百合产业发展的重要因素。如何对百合病毒实现快速检测，成为百合产业发展的迫切需要。
[0004]目前，百合病毒检测的主要技术和方法有电子显微镜技术、酶联免疫法(ELISA)和核酸检测法(PCR)等，但这些技术和方法普遍存在检测程序复杂、耗时^_7h/样)、分析费用高、对仪器和实验人员的技术水平要求高等问题，很难在生产中得到普遍推广应用。胶体金免疫层析技术(Immune colloidal gold technique, GI CA)是以胶体金作为示踪标志物的一种新型免疫标记技术，该方法避免了以上几种检测方法的缺点，以其简便(无需仪器)、快捷(5-10min)、成本低、对技术人员要求低、适合田间快速检测等优点已被广泛接受，已在人类传染病、动物病毒和环境检测等领域广泛应用。
[0005]我们经过前期的反复研究和试验，首次将胶体金免疫层析技术应用于百合病毒的快速检测，已经成功研制了能快速检测LMoV和LSV的单一和复合胶体金免疫层析检测试剂卡，并已在百合产区推广应用，非常受百合生产的企业、种植户以及地方相关单位的欢迎。但由于技术的局限性，LMoV和LSV单一及复合胶体金免疫层析检测试剂卡无法对CMV同时进行检测。然而，CMV感染百合非常普遍，对百合生长的抑制也非常严重，而且普遍与LMoV和LSV复合侵染，导致比单一侵染更加严重的症状。以目前的技术，要想完成对百合三种主要病毒的检测，必须将LMoV和LSV复合胶体金免疫层析试剂卡检测与能检测CMV的酶联免疫(ELISA)或聚合酶链式反应(PCR)等传统方法结合，这样一来，百合三种主要病毒同时检测的愿景将依旧停留在实验室阶段，无法进入田间，百合病毒检测工作还是不能得到真正意义上的推广与普及，百合病毒病仍然不能得到有效防治。
[0006]为彻底实现百合三种主要病毒的快速检测，我们通过实验研究，并对LMoV和LSV的单一和复合胶体金免疫层析检测试剂卡技术进行不断优化和改进，证明可采用双向免疫层析技术，通过一系列优化组合实验，研制能一次性同时检测LSV、LMoV和CMV的双向复合胶体金免疫层析速测卡，彻底解决LMoV和LSV的单一和复合胶体金免疫层析检测试剂卡技术所存在的单一性、局限性以及传统的百合病毒检测方法成本高、耗时长、对仪器设备和专业技能要求高等问题的束缚，让田间种植人员即可掌握病毒快速检测技术，在健康种源的选择以及百合种植和生长的全过程内随时检测病毒，为病毒病的动态监测和防治提供数据支持。该LSV、LMoV和CMV的双向复合胶体金免疫层析速测卡的开发，将为加快百合产业化的发展、提高百合产区农业的经济效益，增加农民收入，促进脱贫致富做出贡献。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是运用胶体金免疫层析法研制一种快速检测LSV、LMoV和CMV三种常见百合病毒的双向复合速测卡及其制备方法。本发明速测卡可一次性同时快速检测LSV、LMoV和CMV，无需任何仪器和设备，较LMoV和LSV单一及LMoV+LSV复合胶体金免疫层析试剂卡,本发明速测卡检测效率更高,检测成本进一步降低,一次性检测病毒种类更齐全；此夕卜，其操作简便，携带方便，检测快速、特异性强、重复性好，相对于PCR方法，假阳性率低于I %。可见本发明特别适用于在田间推广应用，并且可靠性很高。
[0008]本发明的技术方案为:
[0009]一种百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡，包括:试剂卡槽1，衬板16，样品垫10，复合胶体金结合垫AB11，硝酸纤维素膜AB12，单一胶体金结合垫C13，硝酸纤维素膜C14，吸水滤纸15，其特征在于:试剂卡槽I包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞2、第二孔洞3和第三孔洞4，样品垫10置于第一孔洞2下方，硝酸纤维素膜AB12置于第二孔洞3下方，硝酸纤维素膜C14置于第三孔洞4下方，复合胶体金结合垫ABll上含有复合金标探针，单一胶体金结合垫C13上含有单一金标探针，衬板16固定于试剂卡槽I中，样品垫10、复合胶体金结合垫ABl1、硝酸纤维素膜AB12和吸水滤纸15依次排列连接于衬板16右侧上表面，单一胶体金结合垫C13、硝酸纤维素膜C14和吸水滤纸15依次排列连接于样品垫10左侧衬板16的上表面，硝酸纤维素膜AB12上设有第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7，硝酸纤维素膜C14上设有第三检测线8和第二对照线9，第一检测线5上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，第二检测线6上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，第一对照线7上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，第三检测线8上包被的是兔抗CMV多克隆抗体，第二对照线9上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体合适包被量分别为2.0?2.5 μ g、1.5?
2.0 μ g以及2.0?2.5 μ g蛋白，LSV和LMoV复合金标探针合适抗体标记量均为18 μ g/mL，CMV单一金标探针合适抗体标记量为19 μ g/mL,羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?
3.0 μ g蛋白。
[0010]其中在用所述速测卡检测时，在所述第一孔洞2处加入少量百合样品的待检溶液，对比第一检测线5、第二检测线6、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9的颜色，即可判定被检测百合是否感染了百合瘾症病毒、百合斑驳病毒或百合黄瓜花叶病毒。
[0011]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中仅含有LSV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5结合的复合物继续向所述第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第二检测线6时不发生反应，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二检测线6和第三检测线8没有颜色变化而第一检测线5和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒。
[0012]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中仅含有LMoV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时不发生反应，当接触到所述第二检测线6时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5和第三检测线8没有颜色变化而第二检测线6和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒。
[0013]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中仅含有百合CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，则不能与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一检测线5、第二检测线6时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5和第二检测线6没有颜色变化而第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合黄瓜花叶病毒。
[0014]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中同时含有LSV和LMoV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV和LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5和第二检测线6时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5和第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第三检测线8没有颜色变化而第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
[0015]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中同时含有LSV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5结合的复合物继续向所述第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第二检测线6时不发生反应，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二检测线6没有颜色变化而第一检测线5、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0016]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中同时含有LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时不发生反应，当接触到所述第二检测线6时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5没有颜色变化而第二检测线6、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0017]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中同时含有LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV和LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5、第二检测线6时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5、第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5、第二检测线6、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9同时出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0018]其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞2处5?10分钟后，若待检溶液中不含LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，则不能与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一检测线5和第二检测线6时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5、第二检测线6、第三检测线8没有颜色变化而第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0019]一种百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡的制备方法，按以下步骤进行:(I)兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体的制备:分别从感染了 LSV、LMoV和CMV的百合叶片中提取总RNA，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增LSV、LMoV和CMV的CP基因片段。通过酶切克隆至pET_28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌BL21，37°C培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化分别获得大小为32.0,30.0、24kDa的LSV CP、LMoV CP和CMV CP基因工程融合蛋白。分别用lmg/mL的LSV CP、LMoVCP和CMV CP基因工程融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔，获得抗血清。所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至pH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化分别获得兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体IgG ； (2)胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法:取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180 μ g，在ΡΗ7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为I%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金-抗体结合物；(3)胶体金标记兔抗百合CMV多克隆抗体的方法:取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗百合CMV多克隆抗体190μ g，在PH7.7的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为I%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为单一胶体金-抗体结合物；(4)复合胶体金结合垫AB的制备:用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成复合胶体金结合垫AB ； (5)单一胶体金结合垫C的制备:用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮单一胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成单一胶体金结合垫C ； (6)免疫层析膜AB的包被:第一检测线5、第二检测线6上分别包被的是兔抗LSV和LMoV多克隆抗体，第一对照线7上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体；(7)免疫层析膜C的包被:第三检测线8上包被的是兔抗CMV多克隆抗体，第二对照线9上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体；(8)双向复合胶体金速测卡的组装:将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、复合胶体金结合垫AB、硝酸纤维素膜AB和吸水滤纸依次排列连接于衬板右侧上表面，单一胶体金结合垫C、硝酸纤维素膜C和吸水滤纸依次排列连接于样品垫左侧衬板的上表面，再将速测卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV、LMoV和CMV双向复合胶体金免疫层析速测卡。
[0020]本发明的试剂卡具有以下优点:
[0021]检测时，吸取少量百合样品的待检测溶液，滴在试剂卡槽上壳体第一孔洞处，在第二孔洞和第三孔洞处对比检测线和对照线的颜色，即可判定百合植株是否感染了 LSV、LMoV或 CMV。
[0022]1、检测快速:检测时间只需5?10分钟，可以满足现场检测的需要。
[0023]2、检测准确率高、特异性强、成本低:本反应相应的检测线与百合其他主要病毒没有交叉反应，检测灵敏度高，可一次性同时检测LSV、LMoV和CMV，进一步提高了检测效率，降低了检测成本。解决了现有百合病毒胶体金免疫层析检测试剂卡技术所存在的单一性、局限性以及传统的百合病毒检测方法成本高、耗时长、对仪器设备和专业技能要求高等问题的束缚。
[0024]3、携带方便，操作简便:本发明不需要借助其他仪器设备，适合广大基层单位开展百合病毒的检测和防控工作，也适合百合生产的企业、公司以及百合种植的农户使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡平面结构示意图
[0026]图2为本发明百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡内部结构示意图
[0027]其中:
[0028]1-试剂卡槽
[0029]2——第一孔洞
[0030]3——第二孔洞
[0031]4——第三孔洞
[0032]5——第一检测线
[0033]6——第二检测线
[0034]7——第一对照线
[0035]8——第三检测线
[0036]9——第二对照线
[0037]10——样品垫
[0038]11——复合胶体金结合垫AB
[0039]12—硝酸纤维素膜AB
[0040]13——单一胶体金结合垫C
[0041]14—硝酸纤维素膜C
[0042]15-吸水滤纸
[0043]16-衬板
【具体实施方式】
[0044]如图1和图2所示的LSV、LMoV和CMV双向复合胶体金免疫层析速测卡，包括试剂卡槽I，衬板16,样品垫10,复合胶体金结合垫AB11,硝酸纤维素膜AB12,单一胶体金结合垫C13，硝酸纤维素膜C14，吸水滤纸15，其中试剂卡槽I包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞2、第二孔洞3和第三孔洞4，样品垫10置于第一孔洞2下方，硝酸纤维素膜AB12置于第二孔洞3下方，硝酸纤维素膜C14置于第三孔洞4下方，复合胶体金结合垫ABll上含有复合金标探针，单一胶体金结合垫C13上含有单一金标探针，衬板16固定于试剂卡槽I中，样品垫10、复合胶体金结合垫AB11、硝酸纤维素膜AB12和吸水滤纸15依次排列连接于衬板16右侧上表面，单一胶体金结合垫C13、硝酸纤维素膜C14和吸水滤纸15依次排列连接于样品垫10左侧衬板16的上表面,硝酸纤维素膜AB12上设有第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7，硝酸纤维素膜C14上设有第三检测线8和第二对照线9，第一检测线5上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，第二检测线6上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，第一对照线7上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，第三检测线8上包被的是兔抗CMV多克隆抗体，第二对照线9上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体合适包被量分别为2.0?2.5 μ g、1.5?2.0 μ g以及2.0?2.5 μ g蛋白，LSV和LMoV复合金标探针合适抗体标记量均为18 μ g/mL, CMV单一金标探针合适抗体标记量为19 μ g/mL,羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.0 μ g蛋白。
[0045]其中，样品垫和胶体金结合垫材质均为玻璃纤维素膜，衬板为聚氯乙烯材质做成，起支持作用。
[0046]本发明试剂卡的制备方法:
[0047]1、本发明中兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体的制备方法
[0048]分别从感染了 LSV、LMoV和CMV的百合叶片中提取总RNA，进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增LSV、LMoV和CMV的CP基因片段，通过酶切克隆至pET_28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌BL21，37°C培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小32.0、30.0、24kDa的LSV CP、LMoV CP和CMV CP基因工程融合蛋白。分别用lmg/mL的LSV CP、LMoV CP和CMV CP基因工程融合蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔。初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5?7天颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02%的叠氮钠，-20°C保存。所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至PH7.8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化而获得兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体IgG。
[0049]2、胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法
[0050]取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180 μ g，在PH7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，使得终浓度为I %，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金-抗体结合物。
[0051]3、胶体金标记兔抗百合CMV多克隆抗体的方法
[0052]取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗百合CMV多克隆抗体190 μ g，在PH7.7的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为单一胶体金-抗体结合物。
[0053]4、复合胶体金结合垫AB的制备
[0054]用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成复合胶体金结合垫AB。
[0055]5、单一胶体金结合垫C的制备
[0056]用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮单一胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成单一胶体金结合垫C。
[0057]6、免疫层析膜AB的包被
[0058]第一检测线5、第二检测线6上分别包被的是兔抗LSV和LMoV多克隆抗体，第一对照线7上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，每条线宽2mm，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为
2.0?2.5 μ g蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体合适包被量为1.5?2.0 μ g蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.0 μ g蛋白。
[0059]7、免疫层析膜C的包被
[0060]第三检测线8上包被的是兔抗百合CMV多克隆抗体，第二对照线9上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，每条线宽2mm，兔抗百合CMV多克隆抗体合适包被量为2.0?2.5 μ g蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.0 μ g蛋白。
[0061]8、双向复合胶体金速测卡的组装
[0062]将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、复合胶体金结合垫AB、硝酸纤维素膜AB和吸水滤纸依次排列连接于衬板右侧上表面，单一胶体金结合垫C、硝酸纤维素膜C和吸水滤纸依次排列连接于样品垫左侧衬板的上表面，再将速测卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV、LMoV和CMV双向复合胶体金免疫层析速测卡。
[0063]9、双向复合胶体金速测卡的使用及结果判定
[0064]吸取少量百合样品的待检测溶液，滴在试剂卡槽上壳体第一孔洞2处，由于毛细效应液体往前移动，若待检溶液中仅含有LSV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5结合的复合物继续向所述第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第二检测线6时不发生反应，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二检测线6和第三检测线8没有颜色变化而第一检测线5和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒。
[0065]若待检溶液中仅含有LMoV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时不发生反应，当接触到所述第二检测线6时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合,当接触到所述第三检测线8时不发生反应,单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5和第三检测线8没有颜色变化而第二检测线6和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒。
[0066]若待检溶液中仅含有百合CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABlI时,则不能与复合金标垫ABlI上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一检测线5、第二检测线6时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5和第二检测线6没有颜色变化而第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合黄瓜花叶病毒。
[0067]若待检溶液中同时含有LSV和LMoV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV和LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5和第二检测线6时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5和第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第三检测线8没有颜色变化而第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
[0068]若待检溶液中同时含有LSV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5结合的复合物继续向所述第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第二检测线6时不发生反应，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二检测线6没有颜色变化而第一检测线5、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0069]若待检溶液中同时含有LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5时不发生反应，当接触到所述第二检测线6时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5没有颜色变化而第二检测线6、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0070]若待检溶液中同时含有LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABll时，LSV和LMoV与复合金标垫ABll上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线5、第二检测线6和第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一检测线5、第二检测线6时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线5、第二检测线6结合的复合物继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，百合CMV与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线8和第二对照线9方向渗移，当接触到所述第三检测线8时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线8结合的复合物继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5、第二检测线6、第三检测线8和第一对照线7、第二对照线9同时出现棕红色的条带时，则判定被检样品同时感染了百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0071]若待检溶液中不含LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞2的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫ABlI时,则不能与复合金标垫ABlI上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一检测线5和第二检测线6时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述第一对照线7方向渗移，当接触到所述第一对照线7时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞2的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C13时，则不能与单一金标垫C13上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线8时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线9方向渗移，当接触到所述第二对照线9时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线5、第二检测线6、第三检测线8没有颜色变化而第一对照线7、第二对照线9出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
[0072]上述实施例可以看出，本发明可对LSV、LMoV和CMV同时进行检测，一般人员不需专门培训即可操作，5?10分钟即可检测出结果，从而达到快速、简便、及时检测这三种病毒的目的。
【权利要求】
1.一种百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡，包括:试剂卡槽(1)，衬板(16)，样品垫(10)，复合胶体金结合垫AB(ll)，硝酸纤维素膜AB (12)，单一胶体金结合垫C (13)，硝酸纤维素膜C (14)，吸水滤纸(15)，其特征在于:试剂卡槽(I)包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞(2)、第二孔洞(3)和第三孔洞(4)，样品垫(10)置于第一孔洞(2)下方，硝酸纤维素膜AB (12)置于第二孔洞(3)下方，硝酸纤维素膜C (14)置于第三孔洞(4)下方，复合胶体金结合垫AB(Il)上含有复合金标探针，单一胶体金结合垫C(13)上含有单一金标探针，衬板(16)固定于试剂卡槽(I)中，样品垫(10)、复合胶体金结合垫AB(ll)、硝酸纤维素膜AB (12)和吸水滤纸(15)依次排列连接于衬板(16)右侧上表面，单一胶体金结合垫C (13)、硝酸纤维素膜C(14)和吸水滤纸(15)依次排列连接于样品垫(10)左侧衬板(16)的上表面，硝酸纤维素膜AB (12)上设有第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)，硝酸纤维素膜C(14)上设有第三检测线(8)和第二对照线(9)，第一检测线(5)上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，第二检测线(6)上包被的是兔抗LMoV多克隆抗体，第一对照线(7)上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，第三检测线(8)上包被的是兔抗百合CMV多克隆抗体，第二对照线(9)上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体合适包被量分别为2.0?2.5 μ g、1.5?2.0 μ g以及2.0?2.5 μ g蛋白，LSV和LMoV复合金标探针合适抗体标记量均为18 μ g/mL,百合CMV单一金标探针合适抗体标记量为19 μ g/mL,羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.0 μ g蛋白； 其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，若待检溶液中仅含有LSV，在所述第一孔洞⑵的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，LSV与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一检测线(5)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线(5)结合的复合物继续向所述第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第二检测线(6)时不发生反应，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C (13)时，则不能与单一金标垫C (13)上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线(8)时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二检测线(6)和第三检测线(8)没有颜色变化而第一检测线(5)和第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒； 若待检溶液中仅含有LMoV，将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，在所述第一孔洞⑵的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，LMoV与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一检测线(5)时不发生反应，当接触到所述第二检测线(6)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第二检测线(6)结合的复合物继续向所述第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C(13)时，则不能与单一金标垫C (13)上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线(8)时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线(5)和第三检测线(8)没有颜色变化而第二检测线(6)和第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒； 若待检溶液中仅含有百合CMV，将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，在所述第一孔洞(2)的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，则不能与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一检测线(5)、第二检测线(6)时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C(13)时，百合CMV与单一金标垫C(13)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线(8)和第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第三检测线(8)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线(8)结合的复合物继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线(5)和第二检测线(6)没有颜色变化而第三检测线(8)和第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合黄瓜花叶病毒； 若待检溶液中同时含有LSV和LMoV，将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，在所述第一孔洞(2)的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，LSV和LMoV与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一检测线(5)和第二检测线(6)时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线(5)和第二检测线(6)结合的复合物继续向所述第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C(13)时，则不能与单一金标垫C(13)上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第三检测线(8)时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第三检测线(8)没有颜色变化而第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合斑驳病毒； 若待检溶液中同时含有LSV和CMV，将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，在所述第一孔洞(2)的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，LSV与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一检测线(5)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线(5)结合的复合物继续向所述第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第二检测线(6)时不发生反应，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C(13)时，百合CMV与单一金标垫C(13)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线(8)和第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第三检测线(8)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线(8)结合的复合物继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第二检测线(6)没有颜色变化而第一检测线(5)、第三检测线(8)和第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒和百合黄瓜花叶病毒； 若待检溶液中同时含有LMoV和CMV，将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，在所述第一孔洞(2)的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，LMoV与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一检测线(5)时不发生反应，当接触到所述第二检测线(6)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第二检测线(6)结合的复合物继续向所述第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C(13)时，百合CMV与单一金标垫C(13)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线(8)和第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第三检测线(8)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线(8)结合的复合物继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线(5)没有颜色变化而第二检测线￠)、第三检测线(8)和第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒； 若待检溶液中同时含有LSV、LMoV和CMV，将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，在所述第一孔洞(2)的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB(Il)时，LSV和LMoV与复合金标垫AB(Il)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第一检测线(5)、第二检测线(6)和第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一检测线(5)、第二检测线(6)时分别发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第一检测线(5)、第二检测线(6)结合的复合物继续向所述第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C(13)时，百合CMV与单一金标垫C(13)上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述第三检测线(8)和第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第三检测线(8)时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未与第三检测线(8)结合的复合物继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线(5)、第二检测线￠)、第三检测线(8)和第一对照线(7)、第二对照线(9)同时出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
2.根据权利要求1所述的百合瘾症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡，其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞(2)处5?10分钟后，若待检溶液中不含LSV、LMoV和CMV，在所述第一孔洞(2)的右侧，检测样品经过所述复合胶体金结合垫AB (II)时,则不能与复合金标垫AB (II)上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述第一检测线(5)和第二检测线(6)时不发生反应，复合金标多克隆抗体继续向所述第一对照线(7)方向渗移，当接触到所述第一对照线(7)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；同时在所述第一孔洞(2)的左侧，检测样品经过所述单一胶体金结合垫C (13)时,贝U不能与单一金标垫C (13)上的金标多克隆抗体结合,当接触到所述第三检测线(8)时不发生反应，单一金标多克隆抗体继续向所述第二对照线(9)方向渗移，当接触到所述第二对照线(9)时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当第一检测线(5)、第二检测线(6)、第三检测线(8)没有颜色变化而第一对照线(7)、第二对照线(9)出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒。
3.—种如权利要求1-2所述百合瘾症病毒、百合斑驳病毒和百合黄瓜花叶病毒双向复合胶体金免疫层析速测卡的制备方法，其特征在于按以下步骤进行:①兔抗LSV、LMoV和CMV多克隆抗体的制备；②胶体金标记兔抗LSV和LMoV多克隆抗体的方法:取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗LSV和LMoV多克隆抗体各180 μ g，在PH7.5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为复合胶体金-抗体结合物胶体金标记兔抗百合CMV多克隆抗体的方法:取半径为30nm的胶体金10mL、兔抗百合CMV多克隆抗体190 μ g，在ΡΗ7.7的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为单一胶体金-抗体结合物；④复合胶体金结合垫AB的制备:用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮复合胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成复合胶体金结合垫AB ;⑤单一胶体金结合垫C的制备:用1/10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮单一胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成单一胶体金结合垫C ;⑥免疫层析膜AB的包被:在硝酸纤维素膜上分别包被兔抗LSV和LMoV多克隆抗体第一检测线(5)、第二检测线(6)和羊抗兔IgG纯化抗体第一对照线(7)，每条线宽2mm，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为2.0?2.5 μ g蛋白，兔抗LMoV多克隆抗体合适包被量为1.5?2.0 μ g蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.0 μ g蛋白；⑦免疫层析膜C的包被:在硝酸纤维素膜上包被兔抗百合CMV多克隆抗体第三检测线(8)和羊抗兔IgG纯化抗体第二对照线(9)，每条线宽2mm，兔抗百合CMV多克隆抗体合适包被量为2.0?2.5 μ g蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2.5?3.Ομ g蛋白；⑧双向复合胶体金速测卡的组装:将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、复合胶体金结合垫AB、硝酸纤维素膜AB和吸水滤纸依次排列连接于衬板右侧上表面，单一胶体金结合垫C、硝酸纤维素膜C和吸水滤纸依次排列连接于样品垫左侧衬板的上表面，再将速测卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV、LMoV和CMV双向复合胶体金免疫层析速测卡。
【文档编号】G01N33/558GK104374912SQ201410524273
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】张玉宝, 王亚军, 陈延, 谢忠奎, 王若愚, 郭志鸿 申请人:中国科学院寒区旱区环境与工程研究所