一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法
【专利摘要】一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择及处理：(2)外植体的灭菌及生长点的剥取：(3)启动培养；(4)RT?PCR病毒检测及丛生芽诱导培养；(5)鳞茎诱导及生根培养。利用本发明可以100％脱去百合体内主要病毒，特别是对于已经感染病毒的百合外植体经多次实验验证可以成功脱除，且成活率高达85％以上，此外，通过本发明在获得较高增殖系数的同时缩短百合生长周期，使百合在短时间内获得大量脱毒苗，满足生产的需求。
【专利说明】
一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种百合的高效脱毒及快速繁殖新技术，特别针对卷丹百合具有极高脱毒快繁效率的组培方法。
【背景技术】
[0002]卷丹百合在湖南、安徽和江西等省(区)都有分布，仅湖南龙山县常年种植药食两用的卷丹百合3400hm2，是该县农业支柱产业之一。由于百合生产上多采用无性繁殖造成病毒大量累积使植株发生病毒病，造成产量品质大幅下降，制约了百合的发展。
[0003]危害百合的主要病毒病有百合无症病毒(Lilysymptomless virus，LSV)、百合丛族病毒(Lily rosette virus，LRV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)等。百合一旦传染病毒，终生带毒，且难以用化学药剂或生物制剂进行直接有效防治。因此，当务之急是通过生物技术手段剔除百合体内病毒，获得脱毒苗，从源头上掐断病毒的侵染。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于，提供一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法，尤其针对已经感染多种病毒的百合种球，脱去植株体内病毒获得无菌苗，同时在短时间内通过组织培养获得大量优质种苗，从而满足生产需求。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法，包括以下步骤:
[0006](I)外植体的选择及处理:选择百合珠芽作为外植体，用水冲洗去除泥土后，在35-40 °C (优选36-38°C)恒温箱中热处理10-20天(优选15-18天)，保持相对湿度在85-100%;
[0007](2)外植体的灭菌及生长点的剥取:将经过热处理后的百合珠芽加洗洁精在水中清洗，洗净表面粘液后，先用酒精浸泡(优选浸泡时间20-30秒)，再用质量分数为0.1-0.2%的升汞灭菌(优选灭菌时间10-15分钟)，然后用无菌水清洗(优选4-5次)，洗净残液，备用；
[0008]将灭菌后的百合珠芽置于体视显微镜下，先用解剖刀切下四周较大的鳞片，再用解剖针挑取0.4-0.8mm(优选0.4-0.6mm)大小的茎尖，接种在启动培养基中；
[0009](3)启动培养:启动培养基配方为:MS(Murashige和Skoog于1962年设计的配方)+5-15mg/L病毒唑(优选6-12mg/L)+0.5-3.0mg/L 6_BA(6_苄氨基腺膘呤，优选1.5-2.5mg/L)+0.5-2.0mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，优选 1.0-2.0mg/L)+0.1-0.5mg/L NAA(萘乙酸，优选0.3-0.4mg/L)+0.1-0.5mg//L活性炭(优选0.2-0.4mg/L) +5-7g//L琼脂+20_40g/L白糖(优选30-35mg/L)，先暗培养5-10天，再在光下培养，光强500-1500LX(优选1000-1200LX);
[0010](4)RT-PCR病毒检测(逆转录PCR)及丛生芽诱导培养:在启动培养基中培养(先暗培养5-10天，再在光下培养)50-60天，待幼芽长出2-3片叶时，取叶片进行RT-PCR病毒检测，确定已脱除病毒则可转入新的培养基中诱导丛生芽，丛生芽诱导培养基配方为:MS+2.0-
4.0mg/L 6-BA(优选2.5-3.5mg/L)+0.1-0.5mg/L NAA(优选0.2-0.3mg/L)+5_7g/L琼脂+20-40g/L 白糖，光强 500-3000Lx ；
[0011](5)鳞茎诱导及生根培养:在丛生芽诱导培养基中培养40-60天后，转至鳞茎诱导培养基中培养，鳞茎诱导培养基配方为:MS+1.0-3.0mg/L 6-BA(优选2.0-3.0mg/L)+0.Ι-Ο.5mg/L NAA(优选0.2-0.4mg/L)+0.2-0.6mg/L活性炭(优选0.4-0.5π^/1)+5-78/1琼脂+20-40g/L白糖(优选35-40g/L)，在此培养基中培养50-60天后，鳞茎发育较多且根系生长良好，可直接成苗移栽。
[0012]本发明的优异之处在于:利用本发明可以100%脱去百合体内主要病毒，特别是对于已经感染病毒的百合外植体经多次实验验证可以成功脱除。同时，比报导的成活率低于50%的问题，本发明成活率高达85%以上。此外，通过本发明在获得较高增殖系数的同时缩短百合生长周期，使百合在短时间内获得大量脱毒苗，满足生产的需求。
【具体实施方式】
[0013]以下结合实施例对本发明作进一步说明。
[0014]以下各实施例是以已感染多种病毒的龙山百合上的珠芽为试材。
[0015]实施例1
[0016]本实施例包括以下步骤:
[0017](I)外植体的选择及处理:选择百合珠芽作为外植体，先用水冲洗去除泥土，再放入广口容器中，其上盖上打湿的毛巾，然后在38土 TC恒温箱中热处理15天，保持相对湿度在 100% ；
[0018](2)外植体的灭菌及生长点的剥取:将经过热处理后的百合珠芽加洗洁精在水中清洗，洗净表面粘液后，先用体积分数为75%酒精浸泡25秒，再用质量分数为0.15%升汞灭菌15分钟后，用无菌水清洗4次，洗净残液，备用；
[0019]将灭菌后的百合珠芽置于体视显微镜下，先用解剖刀切下四周较大的鳞片，再用解剖针挑取0.4-0.6mm大小的茎尖，接种在启动培养基中；
[0020](3)启动培养:启动培养基配方为:MS(Murashige和Skoog于1962年设计的配方)+10mg/L病毒卩坐+2mg/L 6_BA(6_节氨基腺膘呤)+lmg/L 2，4_D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0.3mg/LNAA(萘乙酸)+0.3mg/L活性炭+6g/L琼脂+30g/L白糖，先暗培养8天，再在光下培养，光强1200Lx；
[0021](4)RT_PCR病毒检测(逆转录PCR)及丛生芽诱导培养:在启动培养基中培养(先暗培养8天，再在光下培养)55天，待幼芽长出2-3片叶时，取叶片进行RT-PCR病毒检测，确定已脱除病毒则可转入新的培养基中诱导丛生芽，丛生芽诱导培养基配方为:MS+3mg/L 6-BA+
0.2mg/L NAA+6g/L琼脂+30g/L白糖，光强 1500Lx ；
[0022](5)鳞茎诱导及生根培养:在丛生芽诱导培养基中培养50天后，转至鳞茎诱导培养基中培养，鳞茎诱导培养基配方为:MS+2mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+0.3mg//L活性炭+6g//L琼脂+30g/L白糖，在此培养基中培养55天后，鳞茎发育较多且根系生长良好，可直接成苗移Mo
[0023]试验结果表明，本实施例能成功脱除植株体内病毒，脱毒率达100%，成活率在85%以上。
[0024]实施例2
[0025]本实施例包括以下步骤:
[0026](I)外植体的选择及处理:选择百合珠芽作为外植体，先用水冲洗去除泥土，再放入广口容器中，其上盖上打湿的毛巾，然后在36土 TC恒温箱中热处理12天，保持相对湿度在 85±1%;
[0027](2)外植体的灭菌及生长点的剥取:将经过热处理后的百合珠芽加洗洁精在水中清洗，洗净表面粘液后，先用体积分数为70 %酒精浸泡20秒，再用质量分数为0.12%升汞灭菌12分钟后，然后用无菌水清洗4次，洗净残液，备用；
[0028]将灭菌后的百合珠芽置于体视显微镜下，先用解剖刀切下四周较大的鳞片，再用解剖针挑取0.4-0.6mm大小的茎尖，接种在启动培养基中；
[0029](3)启动培养:启动培养基配方为:MS+8mg/L病毒唑+2.5mg/L 6-BA+2.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA+0.lmg/1活性炭+5/L琼脂+30g/L白糖，先暗培养8天，再在光下培养，光强100Lx；
[0030](4)RT_PCR病毒检测及丛生芽诱导培养:在启动培养基中培养(先暗培养8天，再在光下培养)52天，待幼芽长出2-3片叶时，取叶片进行RT-PCR病毒检测，确定已脱除病毒则可转入新的培养基中诱导丛生芽，丛生芽诱导培养基配方为:MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+6g/L琼脂+30g/L白糖，光强2500Lx;
[0031](5)鳞茎诱导及生根培养:在丛生芽诱导培养基中培养50天后，转至鳞茎诱导培养基中培养，鳞茎诱导培养基配方为:MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.4mg//L活性炭+6g//L琼脂+30g/L白糖，在此培养基中培养55天后，鳞茎发育较多且根系生长良好，可直接成苗移Mo
[0032]试验结果表明，本实施例能成功脱除植株体内病毒，脱毒率达100%，成活率在86%以上。
[0033]实施例3
[0034]本实施例包括以下步骤:
[0035](I)外植体的选择及处理:选择百合珠芽作为外植体，先用水冲洗去除泥土，再放入广口容器中，其上盖上打湿的毛巾，然后在37土 TC恒温箱中热处理18天，保持相对湿度在90±1% ;
[0036](2)外植体的灭菌及生长点的剥取:将经过热处理后的百合珠芽加洗洁精在水中清洗，洗净表面粘液后，先用体积分数为75 %酒精浸泡30秒，再用质量分数为0.12%升汞灭菌12分钟后，然后用无菌水清洗4次，洗净残液，备用；
[0037]将灭菌后的百合珠芽置于体视显微镜下，先用解剖刀切下四周较大的鳞片，再用解剖针挑取0.4-0.6mm大小的茎尖，接种在启动培养基中；
[0038](3)启动培养:启动培养基配方为:MS+12mg/L病毒唑+3mg/L 6-BA+2mg/L 2,4-D+0.4mg/L NAA+0.3mg/L活性炭+6/L琼脂+30g/L白糖，先暗培养8天，再在光下培养，光强I10Lx；
[0039](4)RT_PCR病毒检测及丛生芽诱导培养:在启动培养基中培养(先暗培养8天，再在光下培养)52天，待幼芽长出2-3片叶时，取叶片进行RT-PCR病毒检测，确定已脱除病毒则可转入新的培养基中诱导丛生芽，丛生芽诱导培养基配方为:MS+3.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7g/L 琼脂+35g/L 白糖，光强 2000Lx;
[0040](5)鳞茎诱导及生根培养:在丛生芽诱导培养基中培养60天后，转至鳞茎诱导培养基中培养，鳞茎诱导培养基配方为:MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L ΝΑΑ+0.5mg//L活性炭+6g//L琼脂+40g/L白糖，在此培养基中培养60天后，鳞茎发育较多且根系生长良好，可直接成苗移Mo
[0041]试验结果表明，本实施例能成功脱除植株体内病毒，脱毒率达100%，成活率在88%以上。
【主权项】
1.一种食用百合的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)外植体的选择及处理:选择百合珠芽作为外植体，用水冲洗去除泥土后，在35-40V恒温箱中热处理10-20天，保持相对湿度在85-100%; (2)外植体的灭菌及生长点的剥取:将经过热处理后的百合珠芽加洗洁精在水中清洗，洗净表面粘液后，先用酒精浸泡，再用质量分数为0.1-0.2%的升汞灭菌，然后用无菌水清洗，洗净残液，备用； 将灭菌后的百合珠芽置于体视显微镜下，先用解剖刀切下四周较大的鳞片，再用解剖针挑取0.4-0.8mm大小的茎尖，接种在启动培养基中； (3)启动培养:启动培养基配方为:MS+5-15mg/L病毒唑+0.5-3.0mg/L 6-BA+0.5-2.0mg/L2，4-D+0.1-0.5mg/L ΝΑΑ+0.1-0.5mg/L活性炭+5_7g/L琼脂+20_40g/L白糖，先暗培养5-10天，再在光下培养，光强500-1500Lx ； (4)RT-PCR病毒检测及丛生芽诱导培养:在启动培养基中培养50-60天，待幼芽长出2-3片叶时，取叶片进行RT-PCR病毒检测，确定已脱除病毒则可转入新的培养基中诱导丛生芽，丛生芽诱导培养基配方为:MS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L NAA+5_7g/L琼脂+20_40g/L白糖，光强 500-3000Lx; (5)鳞茎诱导及生根培养:在丛生芽诱导培养基中培养40-60天后，转至鳞茎诱导培养基中培养，鳞茎诱导培养基配方为:MS+1.0-3.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L ΝΑΑ+0.2-0.6mg/L活性炭+5_7g/L琼脂+20-40g/L白糖，在此培养基中培养50-60天后，鳞茎发育较多且根系生长良好，可直接成苗移栽。2.根据权利要求1所述的食用百合的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于，步骤(I)中，将珠芽放在36-38 0C恒温箱中热处理15-18天，保持相对湿度在100%。3.根据权利要求1或2所述的食用百合的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)中，剥取的百合茎尖大小为0.4-0.6_。4.根据权利要求1或2所述的食用百合的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于，优化了脱毒百合培养基成分，缩短了组培苗生长周期，提高了生产效率； 启动培养基配方为:MS+6-12mg/L病毒唑+1.5-2.5mg/L 6-BA+1.0-2.0mg/L2，4-D+0.3-0.4mg/L NAA+0.2-0.4mg/L活性炭+5_7g/L琼脂+30_35g/L白糖； 丛生芽诱导培养基配方为:MS+2.5-3.5mg/L 6-BA+0.2-0.3mg/L NAA+5_7g/L琼脂+20-40g/L白糖; 鳞茎诱导及生根培养基配方为:MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.2-0.4mg/L NAA+0.4-0.5mg/L活性炭+5-7g/L琼脂+35-40g/L白糖，在此培养基中既可分化鳞茎同时根系生长良好，可以减少一次继代生根培养的时间，提早成苗。5.根据权利要求1或2所述的食用百合的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于，步骤(3)中，将剥取的茎尖接种在启动培养基中，培养条件为:先暗培养5-10天，再在光下培养，光强1000-1200LX。
【文档编号】A01H4/00GK105830930SQ201610341190
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】周晓波, 向清平, 吴艺飞, 向永号, 丁茁荑, 张治国, 袁祖华, 李世树, 戴雄泽, 周仕兵, 刘峰
【申请人】湖南省蔬菜研究所, 龙山县科学技术情报交流站