专利名称：兰州百合的快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地属于一种兰州百合(Liliumdavidii var.unicolor)的快速繁殖方法。
背景技术：
兰州百合(Lilium davidii var.unicolor)，又称大王百合、甜百合和平陆百合等。它除具有观赏价值外，还可药用和食用。兰州百合品质优、抗病性强和产量高(亩产1500kg，单个鳞茎最重者达0.5kg)，比其它食用百合如龙牙百合、宜兴百合更适宜种植。但兰州百合的子球长成商品球约需3至4年，而且以鳞茎为主的常规无性繁殖，繁殖速度慢，浪费商品球，病毒在鳞茎逐年种植中积累，造成品质和优良性状的退化。迄今为止，现有技术未见有兰州百合快速繁殖方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，采用组织培养方法对兰州百合进行快速繁殖，达到在短时间内生产大量优质种苗，提供给广阔山区种植，为农民开展多种经营、脱贫致富增加一条途径。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案兰州百合的快速繁殖方法，选取兰州百合鳞片、叶和根的切段，采用外植体消毒后接入含不同植物激素的培养基，诱导产生芽，继代培养后移入生根培养基，当试管苗高约3-5厘米时移栽入种植炼苗基质，鳞片不定芽的诱导和快繁培养基为MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、叶诱导和繁殖培养基为MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，试管苗生根培养基为1/2MSNAA0.3mg/L，温度27±2℃，光照强度2000LX，光照时间12h/d，pH为5.8。
上述的快速繁殖方法，外植体消毒采用兰州百合鳞片、叶和根，用自来水冲洗后，用75％酒精溶液处理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用无菌水冲洗4至5次，每次5min，再用无菌纸吸干材料上所带的水分，切口基部去掉2-3mm，切为上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培养瓶，诱导产生芽以供试验用；上述的快速繁殖方法，所说种植炼苗基质用挖地基时深处污染少的黄土一份与过筛腐叶土两份均匀混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打开周边覆盖塑料薄膜，约6天后装袋使用。
上述的快速繁殖方法，所说生根培养用兰州百合产生的不定芽，在继代培养中增殖、长高、长叶，将5cm左右的不定芽切割下来，接在1/2MSNAA0.3的培养基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
上述的快速繁殖方法，所说移栽过程采用当完整的试管苗高约3-5cm，根健壮，便可移入已消毒过的基质中，试管苗由异养、恒温和无菌状况下移入土中要进行自养，不可伤试管苗的叶片和根尖，以防伤口染菌，移入土中后要保持湿度，用塑料薄膜覆盖，为保温透气以防试管苗过湿霉变，每天早上11时至下午2时，视苗状况进行通风，随着试管苗的适应，逐渐加长通风时间，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面将结合本发明的实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例11材料与方法1.1材料兰州百合鳞片、叶和根的切段1.2.1外植体消毒采用兰州百合鳞片、叶和根，用自来水冲洗后，用75％酒精溶液处理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用无菌水冲洗4至5次，每次5min，再用无菌纸吸干材料上所带的水分，切口基部去掉2-3mm，切为上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培养瓶，诱导产生芽以供试验用。
1.2.2培养条件鳞片不定芽的诱导和快繁培养基为MSBA2mg/L(单位下同)、NAA0.2，根、叶诱导和繁殖培养基为MSBA2NAA0.4，试管苗生根培养基为1/2MSNAA0.3。温度27±2℃，光照强度2000LX，光照时间12h/d，pH为5.8。
1.2.3种植炼苗基质栽苗基质用挖地基时深处污染少的黄土一份与过筛腐叶土两份均匀混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打开周边覆盖塑料薄膜，约6天后装袋使用。
2结果2.1.鳞片不定芽的诱导繁殖鳞片接种在MSBA2NAA0.2培养基上，两周左右鳞片颜色由白变绿，约3周鳞片腹面膨胀，鳞片切口处出现白色小突起(新产生不定芽)单独或排状数个着生，这些产生不定芽的鳞片可切割、继代在MSBA2NAA0.2的培养基上增殖。影响因素有植物激素种类、组合与量(见表1)，以及鳞片不同切段在鳞片中的位置(见表2)。
表1 植物激素对鳞片不定芽分化的影响培养基(mg/l) 分化不定芽所需天数 分化率(％，90d)BA2NAA0.2 16d开始分化不定芽98％BA2NAA0.2 30d开始分化不定芽50％BA2 28d开始分化不定芽80％NAA0.290d开始分化不定芽67％表2 鳞片不同部位对不定芽分化的影响鳞片部位芽分化的天数分化率(％，90d)上部 53d始分化芽 1.5％(2芽/片)中部 22d始分化芽 36％(3-5芽/片)下部 20d始分化芽 91％(8-11芽/片)完整鳞片 18d始分化芽 95％(1-13芽/片)注每处理试验鳞片总数为30片；培养基为MSBA2NAA0.2。
2.2根段不定芽的诱导不定芽发生部位多在根切口处，根中部也有不定芽分化，并伴随着愈伤组织产生。将2-3cm长的根切为2段，一般根基部的分化率大于根尖部分(表3)。
表3 培养基对根切段不同部位芽分化的影响培养基(mg/L) 根尖部分 根基部完整根BA2NAA1 30d初芽，分化率50％BA2NAA0.4 20d初芽，分化率50％BA2NAA0.240d初芽，分化率37d初芽，分化率 28d初芽，分化率30％10％ 30％BA2NAA0.4 40d初芽，分化率21％KT10IAA10 21d初芽，分化率10％NAA1 仅诱导愈伤组织，10％2.3叶段不定芽的诱导分化情况见表4。
2.4生根培养兰州百合产生的不定芽，在继代培养中增殖、长高、长叶，将5cm左右的不定芽切割下来，接在1/2MSNAA0.3的培养基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
表4 培养基对叶切段不同部位芽分化的影响培养基(mg/L) 叶尖部分叶基部叶中部 全叶BA2NAA0.2 37d初芽， 37d初芽， 37d初芽， 28d初芽，50％分化10％分化50％分化 20％分化BA2NAA0.4 28d初芽，50％分化，但出芽率为上面的2倍NAA2 90d天内无不定芽产生2.5移栽当完整的试管苗高约3-5cm，根健壮，便可移入已消毒过的基质中。试管苗由异养、恒温和无菌状况下移入土中要进行自养，必须细心管理。注意不要伤试管苗的叶片和根尖，以防伤口染菌，移入土中后要保持湿度，要用塑料薄膜覆盖。为保温透气以防试管苗过湿霉变，每天早上11时至下午2时，视苗状况进行通风，随着试管苗的适应，逐渐加长通风时间，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理，移苗成活率达95％以上。
3讨论在组织培养条件下兰州百合鳞片、叶片和根的不同切段的培养效应所得的结论是各器官切段不定芽的分化速度和数量是下段＞中段＞上段。芽的诱导和增殖的最适外植体为鳞片。兰州百合组织培养中鳞片不定芽诱导和快繁培养基为MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L，增殖培养基与上相同，3d左右不定芽开始分化。生根培养基为1/2MS+NAA0.3mg/L，15d左右生根，生根率95％以上。月增殖率为1∶4，初建无性系时，整个繁殖周期约需3个月。
百合是一种单子叶植物。国内外大量研究表明，单子叶植物的薄壁细胞一般不易回复到分生组织状态。但百合科植物例外，以兰州百合鳞片、根和叶片等外植体组培进行脱分化时，具有获得初生分生组织的趋势。这为兰州百合各种组织、器官等诱导与分化，以及规模化生产提供了可能。采用兰州百合根段和叶段培养，大大增加了外植体来源(约10倍以上)。
兰州百合的鳞茎、根和叶片等外植体，可以切割为2至3段培养，均能诱导与分化不定芽。但它们所处位置不同，不定芽分化能力的大小也不同，从不定芽出现时间早晚和诱导丛芽数来看，鳞片为基部＞中部＞上部，根部为基部＞根尖，叶片为基部＞中部＞叶尖。造成这种现象的原因，与外植体营养状况有关。例如鳞片培养中，外围肥厚鳞片分化不定芽的能力比内部较小而薄的鳞片强，一片鳞片的厚度也是基部＞中部＞上部。另外鳞片分化能力与外加植物激素种类和浓度关系也很大。百合的鳞茎是贮藏器官，同时又是无性繁殖器官，从植株的整体情况来讲，它位于中间偏下部位，从遗传势的角度出发，这种情况应全息于每个鳞片即鳞片中偏下，对小鳞茎发生有较强的遗传势，小鳞茎发生能力中下部最强，顶部差，符合生物全息率的遗传优势理论。关于再生植株的遗传变异问题通过愈伤组织长期循环培养，百合在植株活力、染色体数目、叶斑、叶形及大小、花的发育和多年生性上等都会发生变异，但这些变异的特征不能有性遗传。通过对麝香百合(2n)愈伤组织培养6年，其染色体和再生能力都无变化。用兰州百合叶、根和鳞片作外植体得到的再生植株没有经过愈伤组织途径，而是直接由不定芽到试管苗。
权利要求
1.兰州百合的快速繁殖方法，选取兰州百合鳞片、叶和根的切段，采用外植体消毒后接入含不同植物激素的培养基，诱导产生芽，继代培养后移入生根培养基，当试管苗高约3-5厘米时移栽入种植炼苗基质，其特征在于鳞片不定芽的诱导和快繁培养基为MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、叶诱导和繁殖培养基为MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，试管苗生根培养基为1/2MSNAA0.3mg/L，温度27±2℃，光照强度2000LX，光照时间12h/d，pH为5.8。
2.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所说外植体消毒采用兰州百合鳞片、叶和根，用自来水冲洗后，用75％酒精溶液处理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用无菌水冲洗4至5次，每次5min，再用无菌纸吸干材料上所带的水分，切口基部去掉2-3mm，切为上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培养瓶，诱导产生芽以供试验用；
3.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所说种植炼苗基质用挖地基时深处污染少的黄土一份与过筛腐叶土两份均匀混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打开周边覆盖塑料薄膜，约6天后装袋使用。
4.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所说生根培养用兰州百合产生的不定芽，在继代培养中增殖、长高、长叶，将5cm左右的不定芽切割下来，接在1/2MSNAA0.3的培养基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
5.根据权利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所说移栽过程采用当完整的试管苗高约3-5cm，根健壮，便可移入已消毒过的基质中，试管苗由异养、恒温和无菌状况下移入土中要进行自养，不可伤试管苗的叶片和根尖，以防伤口染菌，移入土中后要保持湿度，用塑料薄膜覆盖，为保温透气以防试管苗过湿霉变，每天早上11时至下午2时，视苗状况进行通风，随着试管苗的适应，逐渐加长通风时间，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理。
全文摘要
兰州百合的快速繁殖方法，选取兰州百合鳞片、叶和根的切段，采用外植体消毒后接入含不同植物激素的培养基，诱导产生芽，继代培养后移入生根培养基，当试管苗高约3－5厘米时移栽入种植练苗基质，鳞片不定芽的诱导和快繁培养基为MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、叶诱导和繁殖培养基为MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，试管苗生根培养基为1/2MSNAA0.3mg/L，温度27±2℃，光照强度2000LX，光照时间12h/d，pH为5.8。
文档编号A01H4/00GK1460409SQ0313514
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者龙春林, 程汉英, 张长芹, 罗吉凤, 左太春, 王俐 申请人:中国科学院昆明植物研究所