专利名称：绿花百合快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种绿花百合快速繁殖方法。
背景技术：
秦岭作为我国南北的分界线，地形复杂，气候多样，已经发现的野生百合就有11种，资源十分丰富，且极具开发价值。百合是世界著名的切花和盆花，花色花型各异，常具有优雅的香味，多可药用和观赏，经济价值很高。绿花百合是其中的一种，被誉为“花中大熊猫”，现在已经濒临灭绝，为了更好的保护和利用珍贵的绿花百合资源，首先必须进行大量繁殖，快速扩大其种群
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产的绿花百合快速繁殖方法。采用该方法繁殖绿花百合，生根率达93. 3%以上，移栽成活率达90%以上。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤步骤一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，用洗涤剂将所述鳞片叶上的泥土洗净，然后用流水冲洗O. 5h I. 5h，再采用常规外植体材料灭菌方法对冲洗后的鳞片叶进行灭菌，得到外植体；步骤二、在无菌条件下将步骤一中所述外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后整个外植体产生愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-节氨基嘌呤I. 5mg/L 2. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L O. 2mg/L和琼脂6g/L 12g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5. 4 5. 8 ;所述培养的条件为培养温度21°C 25°C,12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ；步骤三、在无菌条件下将步骤二中产生的愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，增殖培养12 18天后愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 8mg/L 2. Omg/L、萘乙酸O. 05mg/L O. 2mg/L和琼脂6g/L 12g/L ;所述继代培养基的pH值为5. 4 5. 8 ;所述增殖培养的条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ；步骤四、在无菌条件下将步骤三中所述增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，接种40 50天后分化出丛生芽；所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 5mg/L I. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L O. 2mg/L和琼脂6g/L 12g/L ;所述芽分化培养基的pH值为5. 4 5. 8 ;所述芽分化诱导的培养条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ；步骤五、在无菌条件下将步骤四中分化出的丛生芽接种于生根培养基上，培养10 15天后获得生根的绿花百合幼苗；所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-节氨基嘌呤 O. 5mg/L I. 2mg/L、萘乙酸 O. 02mg/L O. 08mg/L 和琼脂 6g/L 12g/L ；所述生根培养基的pH值为5. 4 5.8 ;所述培养的条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为lOOOLx 2000Lx ；步骤六、将步骤五中所述生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株；所述栽培基质由草炭、珍珠岩和沙组成，其中草炭、珍珠岩和沙的体积比为5 7 I 3 2。上述的绿花百合快速繁殖方法，步骤二中所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤2. Omg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6。上述的绿花百合快速繁殖方法，步骤三中所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 2mg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述继代培养基的pH值为5. 6o上述的绿花百合快速繁殖方法，步骤四中所述芽分化培养基为在MS常规基本培·养基中添加6-苄氨基嘌呤I. Omg/L、萘乙酸0. lmg/L和琼脂9g/L ;所述芽分化培养基的pH值为5.6。上述的绿花百合快速繁殖方法，步骤五中所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤0. 8mg/L、萘乙酸0. 05mg/L和琼脂9g/L ;所述生根培养基的pH值为 5. 6。上述的绿花百合快速繁殖方法，步骤六中所述草炭、珍珠岩和沙的体积比为6:2:2。本发明与现有技术相比具有以下优点I、本发明的愈伤组织诱导培养基针对性强、适用性好，外植体经愈伤组织诱导培养基培养4天后鳞片开始变绿，8天后鳞片边缘有乳白色愈伤组织产生，继续培养观察，20天后整个鳞片有愈伤组织产生，愈伤组织长势最好，颜色最浓，呈深绿色，为致密的颗粒状，2个月后产生大量愈伤组织。2、本发明的继代培养基增殖效果好，愈伤组织生长良好，培养12 18天后开始有愈伤组织增大并有新愈伤组织产生，新生愈伤组织比原有愈伤组织增大约三倍，产生的愈伤组织颜色为浓绿色，无褐化现象出现；愈伤组织经芽分化培养基培养40 50天后开始分化出芽，产生的芽数量较多，发芽率最高可达93. 3%，且芽为深绿色，比较健康；分化后的芽经生根培养基培养15天后产生根，生根率达93. 3%以上，移栽成活率达90%以上。3、本发明的方法不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产，为快速扩大其种群提供切实可行的方法。下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施例方式实施例I步骤一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，用洗涤剂将所述鳞片叶上的泥土洗净，然后用流水冲洗lh，再采用常规外植体材料灭菌方法对冲洗后的鳞片叶进行灭菌，得到外植体；所述常规外植体材料灭菌方法为将鳞片叶在无菌室工作台上用质量纯度为75%的乙醇消毒30s,然后投放入O. 1%的升萊消毒液中5min IOmin,最后用无菌水冲洗2 3遍；步骤二、在无菌条件下将步骤一中所述外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后整个外植体产生大量愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤2. Omg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的PH值为5. 6 ;所述培养的条件为培养温度23°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为1500Lx ；步骤三、在无菌条件下将步骤二中产生的愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，增殖培养14天后愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 2mg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述继代培养基的PH值为5. 6 ;所述增殖培养的条件为培养温度23°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为1500Lx ； 步骤四、在无菌条件下将步骤三中所述增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，接种45天后分化出丛生芽；所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. Omg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述芽分化培养基的PH值为5. 6 ;所述芽分化诱导的培养条件为培养温度23°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为1500Lx ；步骤五、在无菌条件下将步骤四中分化出的丛生芽接种于生根培养基上，培养12天后获得生根的绿花百合幼苗；所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 8mg/L、萘乙酸O. 05mg/L和琼脂9g/L ;所述生根培养基的pH值为5. 6 ;所述培养的条件为培养温度23°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为1500Lx ；步骤六、将步骤五中所述生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株；所述栽培基质由草炭、珍珠岩和沙组成，其中草炭、珍珠岩和沙的体积比为6:2:2。本实施例生根率达93. 3%以上，移栽成活率达90%以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产。实施例2步骤一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，用洗涤剂将所述鳞片叶上的泥土洗净，然后用流水冲洗O. 5h，再采用常规外植体材料灭菌方法对冲洗后的鳞片叶进行灭菌，得到外植体；所述常规外植体材料灭菌方法为将鳞片叶在无菌室工作台上用质量纯度为75%的乙醇消毒30s，然后投放入O. 1%的升汞消毒液中5min lOmin，最后用无菌水冲洗2 3遍；步骤二、在无菌条件下将步骤一中所述外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后整个外植体产生大量愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 5mg/L、萘乙酸O. 2mg/L和琼脂6g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的PH值为5. 4 ;所述培养的条件为培养温度25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx ；步骤三、在无菌条件下将步骤二中产生的愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，增殖培养12天后愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤2. Omg/L、萘乙酸O. 05mg/L和琼脂12g/L ;所述继代培养基的pH值为5.8 ;所述增殖培养的条件为培养温度25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤四、在无菌条件下将步骤三中所述增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，接种50天后分化出丛生芽；所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 5mg/L、萘乙酸O. 2mg/L和琼脂6g/L ;所述芽分化培养基的PH值为5. 4 ;所述芽分化诱导的培养条件为培养温度21°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx ；步骤五、在无菌条件下将步骤四中分化出的丛生芽接种于生根培养基上，培养15天后获得生根的绿花百合幼苗；所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 2mg/L、萘乙酸O. 08mg/L和琼脂6g/L ;所述生根培养基的pH值为5. 4 ;所述培养的条件为培养温度21°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；
步骤六、将步骤五中所述生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株；所述栽培基质由草炭、珍珠岩和沙组成，其中草炭、珍珠岩和沙的体积比为5:1:2。本实施例生根率达93. 3%以上，移栽成活率达90%以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产。实施例3步骤一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，用洗涤剂将所述鳞片叶上的泥土洗净，然后用流水冲洗I. 5h，再采用常规外植体材料灭菌方法对冲洗后的鳞片叶进行灭菌，得到外植体；所述常规外植体材料灭菌方法为将鳞片叶在无菌室工作台上用质量纯度为75%的乙醇消毒30s，然后投放入O. 1%的升汞消毒液中5min lOmin，最后用无菌水冲洗2 3遍；步骤二、在无菌条件下将步骤一中所述外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后整个外植体产生大量愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤2. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L和琼脂12g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的PH值为5. 4 5. 8 ;所述培养的条件为培养温度21°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤三、在无菌条件下将步骤二中产生的愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，增殖培养18天后愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 8mg/L、萘乙酸O. 2mg/L和琼脂6g/L ;所述继代培养基的PH值为5. 4 ;所述增殖培养的条件为培养温度21°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx ；步骤四、在无菌条件下将步骤三中所述增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，接种40天后分化出丛生芽；所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L和琼脂12g/L ;所述芽分化培养基的PH值为5. 8 ;所述芽分化诱导的培养条件为培养温度25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤五、在无菌条件下将步骤四中分化出的丛生芽接种于生根培养基上，培养10天后获得生根的绿花百合幼苗；所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 5mg/L、萘乙酸O. 02mg/L和琼脂12g/L ;所述生根培养基的pH值为5. 8 ;所述培养的条件为培养温度25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx ；步骤六、将步骤五中所述生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株；所述栽培基质由草炭、珍珠岩和沙组成，其中草炭、珍珠岩和沙的体积比为7:3:2。本实施例生根率达93. 3%以上，移栽成活率达90%以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产。实施例4步骤一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，用洗涤剂将所述鳞片叶上的泥土洗净，然后用流水冲洗lh，再采用常规外植体材料灭菌方法对冲洗后的鳞片叶进行灭菌，得到外植体；所述常规外植体材料灭菌方法为将鳞片叶在无菌室工作台上用质量 纯度为75%的乙醇消毒30s,然后投放入O. 1%的升萊消毒液中5min IOmin,最后用无菌水冲洗2 3遍；步骤二、在无菌条件下将步骤一中所述外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后整个外植体产生大量愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤2. Omg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的PH值为5.6 ;所述培养的条件为培养温度23±2°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤三、在无菌条件下将步骤二中产生的愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，增殖培养14天后愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 2mg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述继代培养基的PH值为5. 6 ;所述增殖培养的条件为培养温度23±2°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤四、在无菌条件下将步骤三中所述增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，接种45天后分化出丛生芽；所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. Omg/L、萘乙酸O. lmg/L和琼脂9g/L ;所述芽分化培养基的PH值为5. 6 ;所述芽分化诱导的培养条件为培养温度23±2°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤五、在无菌条件下将步骤四中分化出的丛生芽接种于生根培养基上，培养15天后获得生根的绿花百合幼苗；所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 8mg/L、萘乙酸O. 05mg/L和琼脂9g/L ;所述生根培养基的pH值为5. 6 ;所述培养的条件为培养温度23±2°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为2000Lx ；步骤六、将步骤五中所述生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株；所述栽培基质由草炭、珍珠岩和沙组成，其中草炭、珍珠岩和沙的体积比为6:2:2。本实施例生根率达93. 3%以上，移栽成活率达90%以上，该方法不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于 本发明技术方案的保护范围内。
权利要求
1.一种绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 步骤一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，用洗涤剂将所述鳞片叶上的泥土洗净，然后用流水冲洗O. 5h I. 5h，再采用常规外植体材料灭菌方法对冲洗后的鳞片叶进行灭菌，得到外植体； 步骤二、在无菌条件下将步骤一中所述外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后整个外植体产生愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-节氨基嘌呤I. 5mg/L 2. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L O. 2mg/L和琼脂6g/L 12g/L ；所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5. 4 5. 8 ;所述培养的条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ； 步骤三、在无菌条件下将步骤二中产生的愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，增殖培养12 18天后愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤O. 8mg/L 2. Omg/L、萘乙酸O. 05mg/L O. 2mg/L和琼脂6g/L 12g/L ;所述继代培养基的pH值为5. 4 5. 8 ;所述增殖培养的条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ； 步骤四、在无菌条件下将步骤三中所述增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，接种40 50天后分化出丛生芽；所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-节氨基嘌呤O. 5mg/L I. 5mg/L、萘乙酸O. 05mg/L O. 2mg/L和琼脂6g/L 12g/L ;所述芽分化培养基的pH值为5. 4 5. 8 ;所述芽分化诱导的培养条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ；步骤五、在无菌条件下将步骤四中分化出的丛生芽接种于生根培养基上，培养10 15天后获得生根的绿花百合幼苗；所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤0. 5mg/L I. 2mg/L、萘乙酸0. 02mg/L 0. 08mg/L和琼脂6g/L 12g/L ;所述生根培养基的pH值为5. 4 5.8 ;所述培养的条件为培养温度21°C 25°C，12h光照与12h黑暗交替培养，光照强度为IOOOLx 2000Lx ； 步骤六、将步骤五中所述生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株；所述栽培基质由草炭、珍珠岩和沙组成，其中草炭、珍珠岩和沙的体积比为5 7 : I 3 : 2。
2.根据权利要求I所述的绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，步骤二中所述愈伤组织诱导培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤2. 0mg/L、萘乙酸0. lmg/L和琼脂9g/L ;所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5. 6。
3.根据权利要求I所述的绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，步骤三中所述继代培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 2mg/L、萘乙酸0. lmg/L和琼脂9g/L ;所述继代培养基的pH值为5. 6。
4.根据权利要求I所述的绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，步骤四中所述芽分化培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤I. 0mg/L、萘乙酸0. lmg/L和琼脂9g/L ;所述芽分化培养基的pH值为5. 6。
5.根据权利要求I所述的绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，步骤五中所述生根培养基为在MS常规基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤0. 8mg/L、萘乙酸0. 05mg/L和琼脂9g/L ;所述生根培养基的pH值为5. 6。
6.根据权利要求I所述的绿花百合快速繁殖方法，其特征在于，步骤六中所述草炭、珍珠岩和沙的体积比为6 : 2 : 2。
全文摘要
本发明公开了一种绿花百合快速繁殖方法，该方法为一、挑选无病斑的绿花百合地下鳞茎上的鳞片叶，洗净，冲洗，灭菌，得到外植体；二、将外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，培养两个月后产生愈伤组织；三、将愈伤组织接种于继代培养基上进行增殖培养，愈伤组织增大并有新的愈伤组织产生；四、将增大的愈伤组织或新的愈伤组织接种于芽分化培养基上进行芽分化诱导，分化出丛生芽；五、将分化出的丛生芽接种于生根培养基上，获得生根的绿花百合幼苗；六、将生根的绿花百合幼苗移植于栽培基质中培养，得到绿花百合再生植株。本发明的方法不受季节限制，可常年、快速繁殖绿花百合，实现绿花百合的规模化生产，为快速扩大其种群提供切实可行的方法。
文档编号A01H4/00GK102696483SQ20121020322
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者丁群英, 孟长军, 杜喜春, 王芫英, 赵银萍 申请人:西安文理学院