专利名称：一种防治植物寄生线虫的生防制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治植物寄生线虫的生防制剂，属生物农药技术领域。
自然界中，线虫的天敌是很多的，主要有真菌、细菌、螨、捕食性线虫等。其中最多的是真菌，目前研究最多且成为产品上市的也主要是真菌。根据其侵染线虫的特性主要分为1、捕食菌物通过营养菌丝特化形成的捕食器捕捉线虫；2、寄生菌物通过寄生线虫的卵、雌虫、胞囊等的菌物；3、产毒菌物能够产生毒素毒杀线虫的菌物。
目前成为产品进入市场的主要是捕食菌物和寄生菌物。
本发明采用的真菌是中华轮枝菌(Verticillium sinense)GAUZ 412，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2003年5月26日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.0933。
中华轮枝菌GAUZ 412，系本发明人于1996年发现的一个轮枝菌新种。主要形态特征为营养菌丝分隔，分枝，常膨大；分子孢子梗直立，无色，长50-300μm，产生1个瓶梗或2-6个瓶梗轮生；瓶梗下部膨大，膨大的基部长4.8-12.2μm，宽1.5-2.0μm。自基向顶逐渐变细，顶端宽0.5-0.7μm；10-50个分生孢子聚集成头状或呈链状；分子孢子不分隔，无色，橡果形，大小为0.8-1×0.8-1.2μm。缺砖格厚垣孢子。
中华轮枝菌(Verticillium sinense)容易变异，原始菌株生长缓慢。我们从线虫及土壤中分离到不同菌株，其中大部份不具备我们所需的“明显稳定的防治效果，综合性状好，易于规模化生产”的特性。通过对菌株进行筛选和改良后，获得了中华轮枝菌的一株独特菌株，命名为GAUZ 412。它不但对根结线虫(Meloidogyne)、胞囊线虫(Heterodera)具良好的防治效果，同时具备了工业化生产的基本性状。
鉴于该菌株可能由于(自发的、物理的或化学的)突变、原生质体融合，转化或其他通过生物技术而发生变化或被改造，本菌种任何菌株的突变株、变种和衍生物均在本发明的保护范围内。
本发明按常规方法制备。即将中华轮枝菌GAUZ 412，通过固体或液体培养，获得包括菌丝、分子孢子、厚垣孢子的菌体培养物，与蟹壳粉、虾壳粉、几丁质、活性炭和草碳、农作物秸杆糠等辅料和吸附载体按一定比例混合后，经固体发酵生产和液体发酵生产，制成粉剂或微粒剂。
1、固体发酵生产(1)试管种培养将GAUZ 412的菌丝体或孢子接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升PDA培养基中添加5-10克蔗糖和5-10毫升甘油，22-26℃下培养6-10天，获得试管种。
(2)菌种摇床扩大培养(以下均为重量百分比)将斜面种子接种到三角瓶液体培养基中，培养基配方为1000毫升PDA中添加10-20克糖蜜、2-5克硫酸铵，2-4克氯化钠，1-3克硫酸二氢钾，2-4克柠檬酸三钠，5-10克蔗糖，5-10毫升甘油。25-30℃下摇床培养(转速200-300rpm)，8-15天。
(3)固体发酵制备生防制剂将培养好的液体种子接入固体培养基中，培养基的配方为40％-60％农作物秸杆糠、10-20％豆饼粉、20-30％麸皮、10％-20％蟹壳粉或虾壳粉或几丁质，22-26℃培养20-30天后，40-45℃温度条件下烘干后制成粉剂或微粒剂。
2、液体发酵生产(1)试管种培养与前述固体发酵生产中(1)相同(2)菌种摇床扩大培养与前述固体发酵生产中(2)相同(3)液体发酵制备生物制剂将逐级扩大的菌种按10％比例接种于不同容量的发酵罐中，培养基配方为前述固体发酵(2)培养基配方，培养温度28-32℃，培养时间为144-240小时，获生产所需的菌丝体和孢子。将菌体培养物与5％-10％蟹壳粉或虾壳粉或几丁质，1％-2％活性炭混合后，用草碳和农作物秸杆糠吸附并混匀，制成粉剂或微粒剂。
本生防制剂可以与其他的杀线虫农药、植物生长调节剂混合使用，但必须保证所混药剂对本发明采用的中华轮枝菌无副作用。
本发明的线虫生防制剂一般在作物播种或移栽时施用。方法是播种时与种子共同施入土壤中，移栽时将本制剂施入作物根际周围。对线虫发生严重地区可在作物生长过程中追施一次，方法是将本制剂施入作物根际周围，每亩每次施用量为2-3公斤。
本发明具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。
实例一生防制剂对线虫卵寄生1、制备试验用制剂将GAUZ 412菌株接种于培养皿中培养，培养基配方为1000毫升PDA培养基中添加6克蔗糖和6毫升甘油，25℃下培养8天后，用无菌水将孢子洗下，用血球计数板进行计数，制成孢子含量为1×108/毫升的孢子悬浮液。
2、试验方法以吸管取5毫升孢子悬浮液置于直径5厘米的无菌培养皿中，然后接入根结线虫卵(Meloidogyne)悬浮液，每皿接种1000头卵。
卵的制备将带有大量根结线虫的根系剪碎与土壤混合，然后移栽4周龄的番茄苗，5个月左右转繁一次。使用时从钵栽番茄苗中取出已接种上根结线虫的根系，水洗，切碎后放入广口瓶中，加入1％次氯酸钠，振荡3分钟后倒入双层筛中(上筛孔径250微米，下筛孔径38微米)，反复冲洗直到所有卵都冲洗到下筛中，收集后制成线虫卵悬浮液，用线虫计数板计数。
试验重复3次。对照加入5毫升无菌水。25℃下培养，将各处理培养皿用封口膜封严，以减少污染以及菌液蒸发。15天后观察线虫孵化情况，孵化了即说明未被抑制，未孵化即说明其卵已被抑制而未能萌发，然后计算卵抑制率。
3、试验结果表1 生防制剂对根线虫卵孵化的抑制率
结果表明菌剂对根结线虫的卵孵化具有较好的抑制作用，抑制率达62.2％。本发明菌剂通过抑制卵孵化而达到防治线虫的目的。
实例二深层发酵制备生防制剂及对根结线虫的药效试验1、深层发酵制备生防制剂(1)将GAUZ 412的菌丝或孢子接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为1000毫升PDA培养基中添加6克蔗糖和6甘油，25℃下培养8天获得试管种。
(2)将斜面种子接种到三角瓶(500毫升)液体培养基中，培养基配方为1000毫升PDA中添加12克糖蜜、3克硫酸铵，4克氯化钠，1克硫酸二氢钾，2克柠檬酸三钠，8克蔗糖，8毫升甘油。26℃下，摇床(转速250rpm)培养10天。
(3)将发酵好的三角瓶液体菌种接入1吨发酵罐中，培养基配方与前述(2)相同，30℃，培养48小时后接入10吨发酵罐中发酵190小时后，放出与5％蟹壳粉或虾壳粉或几丁质，1％活性炭混合后，用草碳和农作物秸杆糠吸附并混匀，42℃烘干后制成微粒剂。
2、试验方法(1)试验用药剂及处理A、生防制剂2公斤/亩，在烤烟移栽时一次性施于苗根际；B、阿巴丁，稀释1000倍液，在烤烟移栽时一次性施于苗根部；C、空白对照，施入清水。
(2)试验方法供试作物为感病烟草品种红花大金元，试验地点为云南省昆明市宜良县马街乡龚家营村，历年发生根结线虫(Meloidogyne)很严重的地块，土壤为红壤，肥力中等。
小区为单行区，面积33平方米，种烟50株，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按优质烟栽培管理措施规范化管理。
(3)调查方法在烤烟采收最后一片烟叶后立即进行发病情况调查，每小区随机取10株进行挖根调查，根翻挖出来后，用水轻洗去泥沙，用放大镜检查根结并注意观察卵块情况，按烟草系统根结线虫病分级标准(Y/cT40-1996)分级记载，分别计算病株率、根结百分率、根坏死百分率、病情指数、防治效果。
各个小区挂牌采收和烘烤，不同处理分别分级，称重计算产量、产值、均价、上等烟和中上等烟比例。
4、实验结果表2 生防制剂对根结线虫的防治率
表3 不同药剂处理烟株的经济性状指标
结果表明生防制剂的病株率/％、根结百分率/％、根坏死百分率/％、病情指数分别比阿巴丁低24.8％、15％、8％、23.3，比空白对照低41.5％、30％、13％、40，平均防效比化学农药阿巴丁高41％，显示了生防制剂很好的防效，具备了生产上大量推广的基本条件。
经济性状指标分析表明，生防制剂的各个经济性状指标都较化学农药和对照高，其产量、产值、均价、上等烟比例和中上等烟比例分别比化学农药阿巴丁高3.9kg、32.7元、0.06元、10.3％、7％，比对照分别提高了4.4kg、50元、1.41元、12.8％、11.2％。
田间药效试验表明，本发明生产的生防制剂对根结线虫有良好的防治效果，其防效超过化学农药阿巴丁，可以在生产上推广使用。
实例三固体发酵制备生防制剂采用前述实例二(1)制备固体试管斜面菌种，实例二(2)制备三角瓶液体菌种，将培养好的三角瓶液体菌种接入固体培养基中，固体培养基的配方为15％豆饼粉、20％麸皮、55％农作物秸杆糠、10％蟹壳粉或虾壳粉或几丁质，25℃培养20天后，42℃温度条件下烘干后制成粉剂或微粒剂。
权利要求
1.一种防治植物寄生线虫的生防制剂，由生产菌株和辅料按常规方法制备，其特征在于该生防制剂的生产菌株为中华轮枝菌Verticillium sinense GAUZ 412，该菌株已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0933。
全文摘要
本发明涉及一种防治植物寄生线虫的生防制剂，属生物农药技术领域。本发明的生防制剂按常规方法制备，其中，生产菌株采用中华轮枝菌Verticillium sinense GAUZ 412，该菌株已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0933。本发明将该菌株，通过固体或液体培养，获得包括菌丝、分子孢子、厚垣孢子的菌体培养物，与蟹壳粉、虾壳粉、几丁质、活性炭和草碳、农作物秸杆糠等辅料和吸附载体按一定比例混合后，制成粉剂或微粒剂的线虫生物制剂。本发明具有明显稳定的防治效果，综合性状好，易于工业化生产。
文档编号A01N63/00GK1476762SQ0313513
公开日2004年2月25日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者周薇, 张克勤, 莫明和, 周 薇 申请人:云南大学