专利名称：一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法，属生物农药技术领域目前国内外对松材线虫尚无有效的药剂及防治方法，一般情况下，发生了松材线虫后都是采用保守控制方法，即将感病松树砍伐并烧毁，以切断传播。而对植物寄生根结线虫和胞囊线虫有效的生物制剂，对松材线虫则根本没有活性。寻找对松材线虫有效的防治方法和药剂，已经迫在眉睫。
本发明采用的真菌是Pseudohalonectria adversaria(ZD1)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2003年5月26日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.0931。P.adversaria(ZD1)属于水生真菌，系本发明人从大量水生真菌菌株中筛选出的一株对松材线虫具有良好杀线虫活性的菌株。
本发明人通过研究发现Pseudohalonectria属的真菌对松材线虫都具有良好的杀虫效果，从Pseudohalonectria属中筛选确定了一株性状最好的菌株Pseudohalonectriaadversaria(ZD1)开展进一步研究。本发明将ZD1菌株通过液体发酵和麦粒固体发酵后，提取具有杀松材线虫活性的代谢产物，制备成生物杀线虫毒素。
本发明真菌P.adversaria(ZD1)培养方法(以下为重量百分比)液体培养基配方为1-4％大豆；1-5％葡萄糖；1-2％淀粉；0.1-0.5％酵母浸膏；0.2-1％氯化钠；0.02-0.1％磷酸二氢钾；0.02-0.1％硫酸镁；0.1-0.6％碳酸钙，余下为水。
麦粒固体培养基配方为0.2-1％碳酸钙；1-3％大豆粉；0.2-1％硫酸氨；0.5-3％过磷酸钙；小麦麦粒92％-96％。
本发明分为液体发酵提取水溶性杀线虫生物毒素和麦粒固体发酵提取脂溶性杀线虫生物毒素两种方法。
液体发酵提取杀线虫生物毒素的制备方法1、将ZD1的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18-26℃下培养6-12天，获得试管种；2、将试管种接种到250ml三角瓶(每瓶装70ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-30℃下摇床培养，转速为200-300rpm，培养时间5-8天。
3、将含菌丝的发酵液放入离心机中，3600转离心20分钟，过滤后得水溶性杀松材线虫生物毒素。
麦粒固体发酵提取杀松材线虫生物毒素的制备方法1、试管种培养方法与前述液体发酵生产方法1相同；2、采用前述麦粒固体培养基配方。将小麦用清水浸泡24小时后，捞起放入沸水中煮，以煮熟但皮不破为适。捞起滤水与辅料混合后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装700ml，120℃灭菌30分钟后，接入试管种，于22-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。
3、将已长满菌丝的麦粒挖出，冻干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提，浸提后浓缩，得总粗提物。将粗提物溶于少量二甲亚砜(DMSO)，再用一定浓度的吐温-20(Tween-20)溶液溶解，得脂溶性杀松材线虫生物毒素乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
用液体发酵培养提取的主要是水溶性杀线虫生物毒素，而用麦粒固体发酵生产提取的主要是脂溶性杀线虫生物毒素。
本发明产品对松材线虫的药效试验药效试验11、试验用药剂按液体培养方法生产杀线虫生物毒素；以未接种的培养基3600转离心20分钟后过滤作为对照。
2、松材线虫制备在100ml三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高压灭菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培养4至7天。待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25％次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15至20天。用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μl的线虫悬浮液。
3、试验方法取直径6cm培养皿，灭菌后加入2ml试验用药剂，然后加入20μl，线虫悬浮液(300条)，置25℃培养，定时用解剖镜检查线虫的死活，在生理刺激下线虫无反应则确定为线虫死亡，根据死亡率计算出生物杀线虫毒素的药效。
以未接菌的培养基的浸提液作对照，每处理重复三次。
4、试验结果表1 液体发酵生物毒素对松材线虫杀虫效果
结果表明本发明产品水溶性生物杀线虫毒素对松材线虫有良好的杀虫效果，其12小时平均死亡率达77.5％，最高达81.6％；48小时平均死亡率达87.4％，最高达89.3％，48小时平均药效达87.1％。
药效试验21、试验用药剂麦粒固体培养基配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；0.5％硫酸氨；0.5％过磷酸钙；小麦麦粒95％。按前述麦粒固体发酵提取杀松材线虫生物毒素的制备方法制备试验用药剂。
对照药剂按前述麦粒固体发酵生产方法，但麦粒固体培养基中不接入试管种。
2、松材线虫制备与药效试验1相同。
3、试验方法与药效试验1相同。
4、试验结果表2 粒麦固体发酵生物毒素对松材线虫杀虫效果
结果表明本发明脂溶性生物毒素对松材线虫有良好的杀虫效果，与水溶性物质相比，其药效产生较慢，在12小时和24小时药效不显著，36小时药效显著并超过水溶性生物毒素，死亡率达98％，显示其良好的应用开发前景。
再将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装70ml)液体培养基中，培养基配方为2％大豆；2％葡萄糖；0.5％淀粉；0.2％酵母浸膏；0.4％氯化钠；0.05％磷酸二氢钾；0.05％硫酸镁；0.2％碳酸钙，余下为水；于22℃下摇床培养，转速为250rpm，培养时间8天。
再将含菌丝的发酵液放入离心机离心，转速为3600转，时间为20分钟，过滤后得水溶性杀松材线虫生物毒素。
实施例二试管种培养方法与实施例一相同。
将试管种接种到麦粒固体培养基上，培养基配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；0.5％硫酸氨；0.5％过磷酸钙；小麦麦粒95％。将小麦麦粒用清水浸泡24小时后，捞起放入煮沸的水中煮，以煮熟但皮不破为适，捞起滤水后与辅料混合后装入1000ml的三角瓶中，每瓶装700ml，120℃灭菌30分钟后，接种后置于22℃培养20天。
然后将固体培养的菌株挖出，冻干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提，浸提后浓缩，得总粗提物。将粗提物溶于少量二甲亚砜(DMSO)，再用一定浓度的吐温-20(Tween-20)溶液溶解，得杀松材线虫生物制剂乳浊液。在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，Tween-20的终浓度不超过0.3％。
实施例三基本同实施例二，不同之处是培养基配方，其配方为0.5％碳酸钙；1％大豆粉；0.5％硫酸氨；2％过磷酸钙；小麦麦粒96％。
实施例四基本同实施例二，不同之处是培养基配方，其配方为1％碳酸钙；3％大豆粉；1％硫酸氨；3％过磷酸钙；小麦麦粒92％。
权利要求
1.一种防治松材线虫的生物毒素，由生产菌株及辅料按液体和麦粒固体培养后提取制备，其特征在于该生物毒素的生产菌株为Pseudohalonectria adversaria ZD1，ZD1菌株已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0931。
2.一种防治松材线虫的生物毒素的制备方法，由液体发酵和固体发酵制备，其特征在于2.1麦粒固体培养基配方为0.2-1％碳酸钙、1-3％大豆粉、0.2-1％硫酸氨、0.5-3％过磷酸钙、小麦麦粒92-96％；2.2麦粒固体发酵制备生物杀线虫毒素的方法是，将长满菌丝的麦粒挖出，冻干；用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶剂浸提，浸提后浓缩，得总粗提物，将粗提物溶于少量二甲亚砜，再用一定浓度的吐温-20溶液溶解，得杀松材线虫生物制剂乳浊液；在该乳浊液中，二甲亚砜的终浓度不超过3％，吐温-20的终浓度不超过0.3％。
全文摘要
本发明涉及一种防治松材线虫的生物毒素及制备方法，属生物农药技术领域。本生物毒素的生产菌株Pseudohalonectria adversaria(ZD1)已于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0931。ZD1通过液体和麦粒固体培养后，从代谢产物中提取有效的水溶和脂溶性物质制备成杀线虫生物毒素。本发明对松材线虫有良好的毒杀效果，具良好的应用开发前景。
文档编号A01N63/04GK1468523SQ0313513
公开日2004年1月21日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者张克勤, 董瑾艳, 蔡磊, 赵智娴 申请人:云南大学