专利名称：一种快速定量线虫存活率的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速定量线虫存活率的方法及试剂盒，该方法及试剂盒可在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面应用，属于生物技术领域。
背景技术：
秀丽隐杆线虫(C We^ms)是一种生长在土壤中的线虫，以细菌为食，很容易在实验室培养。成虫体长1mm，且通体透明，在显微镜下易于观察。L3 L4期对外界敏感。从一个受精卵发育成可以产卵的成虫，它只需要3天。在自然状态下，秀丽隐杆线虫绝大部分个体为雌雄同体，其一生能产生约300个受精卵，如果在一个培养皿上放几只线虫，几天之后就可得到大量的后代(庞林海等，2007)。上述这些特点使得秀丽隐杆线虫在很多方面都有应用(秦峰松和杨崇林，2006)。厦门大学柯翎等人(2004)以秀丽隐杆线虫作为重金属污染的指示生物，研究了 Cu2+，Cd2+，Pb2+, Si2+等4种重金属离子对秀丽隐杆线虫的毒性，发现重金属离子浓度越高， 毒性越强，线虫死亡率越高。在高浓度组中线虫的中毒反应较迅速，短期内就出现死亡；而在低浓度组，中毒反应较慢，经较长时间才出现死亡，对照组相对其他各组，存活时间最长。 北京师范大学的鄢雯等(2005)人将秀丽隐杆线虫用于环境水质的监测，同样发现秀丽隐杆线虫存活率与水样毒性之间存在紧密的关系，水样毒性越大，线虫死亡率越高，因此可用秀丽隐杆线虫的存活率评价饮用水源水和水厂工艺水水样毒性。王晓等人(2007)也将秀丽隐杆线虫用于对造纸厂废水中酸碱类毒物的追踪。实验显示，用秀丽隐杆线虫指示重金属危害、水样毒性大小等既降低了实验成本，又提高了检测效率。万树青(1993)等人用秀丽隐杆线虫的死亡率来评价棉酚，克线磷，甲基异柳磷，氧乐果，灭多威，硫酸铜等多种农药的杀虫效果。国外将秀丽隐杆线虫用于体内驱虫药物药效筛选的研究已有相关的文章发表 (tooula等，2007)，为驱虫药的体外研究提供了可行方法，并且呈现良好的选择性、准确度及重复性，而且成本低廉。这些研究表明，线虫死亡率的大小反应了供试药物的药效和毒性的大小。王摆(2006)以自由海洋线虫aroaai/ori/^ sp.为模型动物，选择水溶性的重金属镉离子和不溶于水的环境雌激素双酚A，以线虫的死亡率为指标，测试了两种化学物质对 Chromadorina sp.的急性毒性。由此可见，线虫可在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面应用。在以上诸多方面的应用中对线虫死活的判断是关键技术。在涉及线虫死亡或存活进行判断的现有技术中，万树青等(1993)人试图通过染色方法来区分死活线虫从而测定被测物杀线剂的活性，他们比较了中性红，甲基蓝，番红花红，曙红等4种染料的染色效果，发现这4种染料都能使死线虫着色，而活线虫不着色，番红花红效果最好。但是这种方法仍然需要在显微镜下一一计数，工作量很大。国外学者用MTT法检测了驱虫药物左旋咪唑对自由生活的幼体线虫存活率的影响(Catherine等，2007 ；Smith等2009)，但此方法用MTT对线虫染色的时间为3至对小时，且用DMSO溶出甲臢需要1小时，比较费时。而且，MTT价格昂贵，sigma公司产品Ig参考价格为1413. 36元，而同为sigma公司产品的TTC 5g参考价格为243元。美国专利(专利号为20060191023)公开了一种应用荧光染色剂法来鉴别死活线虫的染色方法。这种方法已用于驱虫药物的筛选研究，由于染色后活的线虫无荧光，而死亡的线虫有荧光，利用测试荧光强度的大小来确定线虫的死亡率，这样为高通量筛选提供了保证，但此法需要荧光酶标仪，对设备要求很高，难以在普通实验室和基层得以推广和应用。中国专利(专利号为200710202068. 8)公开了一种应用中性红染料来鉴别死活线虫的染色方法。该方法可以使死线虫着色，活线虫不着色，但染色后需要裂解线虫释放染料后再测定染料的吸光值，步骤繁琐，比较费时。通过对上述涉及线虫死亡或存活进行判断的现有技术分析可以看出，现有技术费时、费力、而且成本较高或需要昂贵的仪器设备，市场急需一种简单易行、成本低廉、不需昂贵的仪器设备就能进行快速定量线虫存活率的新方法，可以广泛应用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价等领域。参考文献
1.庞林海等，秀丽隐杆线虫的培养与保存方法，浙江农业学报，2007，19(1):34 36.
2.秦峰松，杨崇林，小线虫大发现:femorA^i/iiisWe^az7lS在生命科学研究中的重要贡献，生命科学，2006，18 (5) :419 424.
3.柯翎，4种重金属离子对秀丽小杆线虫急性毒性研究，厦门大学学报，2004，43(6) 133 135.
4.鄢雯等，线虫存活率指标对水样相对毒性的初步分析，北京师范大学学报，2005，41
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5.王晓等，利用模式生物线虫追踪造纸厂废水中酸碱类毒物的研究，环境科学，2007， 28 (4) 876 880.
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9.Smith R. A. , L. Pontiggia, C. Waterman, M. Lichtenwalner, J. ffasserman, Comparison of motility, recovery, and methyl-thiazolyl- tetrazolium reduction assays for use in screening plant products for anthelmintic activity. Parasitol Res, 2009， 105:1339-1343.
10.GILL M, S.，A. 0LSEN, G. J. LITHGOff, Automated method for high throughput screening of nematodes. US20060191023A1。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种简单易行、成本低廉的快速定量线虫存活率的新方法及试剂盒，可以广泛应用于新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价等领域。具体内容如下一种快速定量线虫存活率的方法，采用染料对线虫进行染色，由于活线虫着色，死线虫不着色，且光吸收值与活线虫的数量成正比，从而直接可反映线虫的存活率，该方法应用的染料是红四氮唑或称四氮红唑(全称为2，3，5_三苯基氯化四氮唑；英文名称为 2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride,简写为 TTC 或 TZ),分子式为 C19H15ClN40
TTC原理存活状态的线虫存在呼吸作用，在呼吸过程中产生还原态脱氢辅酶I或 II (NADH2或NADPH2)。当TTC的无色溶液渗入活线虫的活细胞内并作为氢受体被脱氢辅酶上的氢还原时，生成一种红色、稳定、不会扩散和不溶于水的三苯基甲臢(TTF)。化学方程式如下
权利要求
1.一种快速定量线虫存活率的方法，采用染料对线虫进行染色，由于活线虫着色，死线虫不着色，且光吸收值与活线虫的数量成正比，从而直接可反映线虫的存活率，其特征在于该方法应用的染料是红四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC)，分子式为C19H15ClN40
2.根据权利要求1所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法中的线虫是自由生活的种类，或者是寄生生活的种类，优选秀丽隐杆线虫(femorA^i/iiis elegans)。
3.根据权利要求1至2中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法中的线虫是处于任一发育阶段的线虫，自由生活的线虫是选自一期幼体线虫至成虫的任一发育阶段线虫，寄生生活的是自由生活时期的幼体线虫。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于染色温度为4°C 35°C、染料浓度为0. 1% 20%、染色时间为5min 45min。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于应用的线虫数量为15 1500条。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法采用二甲基亚砜(DMSO)或甲醇将在线虫体内显色的染料溶出。
7.根据权利要求1至5任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于染色后还可以采用甘油作为透明剂，然后采用酶标仪直接测定吸光值。
8.根据权利要求1至7任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的方法，其特征在于该方法在新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价领域应用。
9.一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有染料红四氮唑 (2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，分子式为 C19H15ClN40
10.一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒可以含有线虫，其中的线虫是自由生活的种类，或者是寄生生活的种类，优选秀丽隐杆线虫(femorA^i/iiis elegans)。
11.根据权利要求9至10中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒中的线虫是处于任一发育阶段的线虫，自由生活的线虫是选自一期幼体线虫至成虫的任一发育阶段线虫，寄生生活的是自由生活时期的幼体线虫。
12.根据权利要求9至11中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于染色温度为4°C 35°C、染料浓度为0. 1% 20%、染色时间为5min 45min。
13.根据权利要求9至12中任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于应用的线虫数量为15 1500条。
14.根据权利要求9至13任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有二甲基亚砜(DMSO)或甲醇。
15.根据权利要求9至14任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有甘油。
16.根据权利要求9至15任意一项所述的一种快速定量线虫存活率的试剂盒，其特征在于该试剂盒在新药筛选、农药筛选、环境评价及水质评价领域应用。
全文摘要
本发明涉及一种快速定量线虫存活率的方法及试剂盒，具体是首先采用染料TTC对线虫进行染色，由于活线虫着色，死线虫不着色，且光吸收值与活线虫的数量成正比，从而直接可反映线虫的存活率，并据此制备试剂盒。这种方法及试剂盒可以在以线虫存活率为指标的药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面应用。本发明在操作上快速、简单易行，对设备要求不高，成本低廉，具有很高的应用价值。
文档编号G01N1/30GK102213672SQ20101013862
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月3日 优先权日2010年4月3日
发明者周婷, 支德娟, 李红玉 申请人:李红玉