线虫贮存和运输的改进方法

专利名称:线虫贮存和运输的改进方法
一方面，本发明阐述了特别适用于防治有害昆虫的昆虫病原线虫的贮存方法。另一方面，本发明阐述了适合于贮存和运输线虫的容器。
在探索能防治有害昆虫并对环境影响最小的替代农用杀虫剂的过程中，现在的注意力正在转向生物制剂，昆虫病原线虫类，其中包括斯太内尔线虫科(Steinernematidae)和异小杆科(Hetror-habditidae)，提供了这样一种可能性。它们是昆虫的天然病原菌。
在土壤中发现的昆虫病原线虫为第三期感染幼虫。它能找到并穿透昆虫的幼虫和成虫。这些线虫带有特有的共长细菌嗜线虫异小杆科/发光异小杆科(Xenorhabdus nematophilus/lumines-cens)。它们有助于杀死昆虫。在昆虫内，一旦线虫干扰昆虫的免疫系统并释放出迅速增殖的共长细菌，就会破坏昆虫的血腔(昆虫的血液和组织)。线虫开始以细菌和部分消化的血腔为食，并成熟和繁殖。该线虫和细菌一起可引起昆虫在24-72小时内死亡。
用昆虫病原线虫治害虫的概念是建立在线虫的大量培养，并能有效地用于对线虫敏感的有害昆虫的基础上的。由于线虫的大量培养存在问题，以及不能有效地贮存昆虫病原线虫，用于生物防治的昆虫病原线虫的开发进程受到阻碍。过去，线虫的培养限于体内法，如在大蜡螟(Galleria mellonella)上。但最近用体外培养已取得很大进展。因为已实现人工大量培养线虫，用昆虫病原线虫作为商业生物杀虫剂的可能性更加现实了。
把线虫作为化学杀虫剂的实际替代物之前，它的贮存和运输已成为关键性因素。
众所周知，第三期线虫在极苛刻条件(如干燥和冷冻)下，能在土壤中很好存活相当长时间。并且当条件变得有利时，还能复苏，并在昆虫出现时感染它们。
然而另一方面，线虫对于迅速干燥和处于紫外线照射和高温下易于损伤。
第三期感染线虫幼虫(非喂养期)靠体内贮存的物质生存。
很可能，在所希望的感染期之前的生长期间，一定种的线虫存活能力与它积累特定的能量储备(如糖原或脂类)的能力有关，也与使它们以一定速率活动的能力有关。该速率是以满足线虫幼虫不生长(存活)的需要。在感染的第三期，在环境中无助于使目标昆虫宿主感染的过快活动会继续浪费能耗，减短存活期和随后的感染机会。因此，存活时间部分地可由可利用的能量贮备决定，但也可能还包括几个另外的因素，如酶的失活作用和有毒新陈代谢付产物的产生和分泌。
目前出售并用于某些昆虫的效能试验的线虫，贮存在低温(1-10℃)下。在这样的条件下，降低了线虫中的分解代谢速率。
不是用连续的或间歇的方法，就是通过有限数量的线虫给密闭的容器供氧。许多工作者都强调，贮存线虫时，氧化作用的重要性和大的表面积/体积比对氧交换的重要性。(Datky et al，1964 and Hara et al，1981)。由于使用滤纸、试纸、棉绒和海绵等，提高了线虫悬浮液与空气的接触面积。例如，在100克清洁干燥的海绵上，5亿个毛纹斯太内尔线虫(Steinernema feltiae)和毛蚊斯太内尔线虫(S·bibionis)可在1-2℃，连续充气的气囊中贮存长达4个月(Bedding，1984)。
上述工作者在为实验室和田间试验提供线虫的文章讨论了线虫的保存。
通常由于下列缺点，所描述的、用于田间试验和实验室的线虫贮存方法都不适合于广泛的商业模规配给。
例如(ⅰ)需要冷冻(ⅱ)需要氧(它通过充气或扩大充气的空间提供)(ⅲ)即便用上面提到的措施，线虫密度仍有限(最高达150000个/毫升)。
(ⅳ)即便使用载菌体，仍难以抽提线虫。
本发明的目的之一是要提供更适合于商业应用的线虫贮存和运输方法。
本发明一个方面的内容是以感染的线虫在缺氧和低于40℃的条件下，仍能生存很长时间这一惊人发现为基础的。根据本发明这一方面的内容，提供了贮存昆虫病原线虫的方法，其中感染的昆虫病原线虫幼虫的乳油在基本上厌氧的条件下贮存。
“基本上厌氧的条件”这一术语意思是，在这些条件下，线虫得不到游离氧。应该指出，在贮存气氛中，存在的氧的数量可能变化。厌氧作用可能意味着对于不同种的线虫有不同的O2含量。本发明这一方面的内容是以本发明者的发现为前题。即感染的幼虫在贮存期间不需要氧化作用和换气或高的表面/体积比。因此，最初的贮存条件可能是相当好氧的。但是一旦O2含量被线虫吸呼作用消耗，它就会变成厌氧条件。
厌氧条件可用各种方法达到。例如，像上面提出的那样，线虫本身可消耗贮存气氛中的氧。另一方面，线虫可在真空、氮气、二氧化碳或其它惰性气体条件下装封。
氧气含量最好小于0.4%(体)，特别是小于0.25%(体)。但是正如上面提出的那样，对于不同种线虫，厌氧生活可能高于上述氧浓度。
上述条件与商业上使用的线虫数量有关，即每克乳油至少含0.2×106个线虫。按照以前描述的技术(线虫浓度相当低)来看，这一浓度是很惊人的。
线虫最好在该微生物生长受抑制条件下贮存，特别是在抗菌剂存在的条件下。
这里使用的抗菌剂这一术语指的是可破坏细菌和真菌生长或可抑制细菌和真菌生长的物质。它包括制菌剂、杀菌剂、制真菌剂和杀真菌剂。
抗菌剂最好是甲醛或次氯酸钠水溶液，浓度最好为0.1-1.0%(重)。有许多替代的抗菌剂可以使用，只要它们在使用的数量范围内对线虫是无毒的。
按照本发明另一方案，线虫贮存在容器中之前，先用能使线虫表面灭菌的抗菌剂洗涤。
在本发明可供选择的另一方面内容中，提供了这样一种有特征的方法。在该方法中，线虫在对线虫无毒的有高渗透力的溶液中贮存和运输。在这一方案的最优形式中，线虫悬浮在浓度为30-70%(重)的单糖或二糖溶液中。例如，蔗糖或葡萄糖。因为这一原理没有限制，可以认为，高渗透力的溶液降低了线虫不希望有的生长速度。
本发明的另一方面的内容中，线虫在吸附剂(如活性炭)或合成树脂(如Amberlite)存在下贮存。吸附剂最好呈粉状、放入凝胶中的粉或片剂。在本发明这一情况中，线虫乳油或悬浮液与适量吸附剂(如活性炭)混合，并在能抑制线虫生长的条件下贮存。在这一情况下，线虫可在基本上厌氧条件或好氧条件或真空下贮存。线虫最好在基本上处于厌氧条件的容器中贮存。虽然厌氧条件有助于降低线虫不希望的生长的可能性，但是人们发现，氧的存在没有多大的影响。在线虫-吸附剂混合物中，吸附剂最好为10-70%(重)。由此得出，线虫乳油最好为混合物的90-30%(重)。在线虫乳油中，线虫的浓度最好为(0.2-2)×106个线虫/克乳油。
吸附剂是能把各种化学物质吸附到它的表面上的物质。这样就可以把吸附剂或其它相对惰性的物质(如木屑、海绵、砂、滤纸和非活性炭)区分开。
上述这些方法阐述了线虫贮存和运输的新方法，然而本发明另一方面的内容，不仅根据本发明而且也根据已知的贮存线虫的方法，阐述了贮存和运输线虫的容器。
过去，运输在载菌体基质上(如聚氨基甲酸乙酯海绵屑、滤纸、试纸、玻璃毛或木屑等)的线虫是常事，以便提高总的表面积/体积比，改进装在密封容器或开孔容器的线虫周围的空气的转移。根据本发明这一方面的内容，线虫贮存在粉状吸附剂或颗粒吸附剂上。在活性炭粉的情况下，线虫可与活性炭混合，但在其它许多情况下，即吸附剂呈颗粒状或运输在载菌体基质上的线虫的情况下，在线虫用于所希望的地方之前，从载菌体基质中回收线虫是必要的。回收线虫可能耗时多，劳动强度大，并常常由于从载菌体基质中除去线虫的收率低而引起线虫大量损失。另外，在已分离的线虫悬浮液中存在的一些载菌体基质小碎片可能给后处理带来问题。例如，堵塞所用的设备。为了解决这一问题，这里提供了贮存和运输线虫的容器。该容器是有两个空室和适合于把载菌体基质保留在上述第一空室中而又可让线虫渗透的设备构成的密封容器。第一个空室装线虫载菌体基质，第二个空室有助于从上述基质中回收线虫。把载菌体基质保留在上述第一空室的设备最好由线虫能穿透的、有适当筛目的筛子，或线虫可渗透的海绵过滤器，或全部或部分可渗透线虫的袋子构成。
虽然有许多可能属于本发明的其它形式，现在仅参考附图来描述几个最优方案。其中图1说明贮存和运输线虫的第一个最优方案。
图2说明贮存和运输线虫的第二个最优方案。
图3是本发明第三个最优方案的容器剖面图。
图4是本发明第四个最优方案的容器剖面图。
图5是本发明第五个最优方案的容器剖面图。
图6是本发明第六个最优方案的容器剖面图。
关于图1。它描绘了密闭容器2(如塑料容器)，它装有与吸附剂(如活性炭)混合的线虫乳油3。活性炭的数量可以在很宽的范围内变化。但活性炭的数量在30-50%(重)的范围内，得以满意的结果。
关于图2。线虫乳油5装在半透膜气囊4内，例如渗析管。气囊4装在容器6中，该容器装有活性炭或者水或缓冲液的活性炭悬浮液。抗菌剂最好混在线虫乳油或混在容器6、囊4周围的液体中。图2描绘的方案特别适合于活性炭与线虫乳油保持分离的情况。渗透膜的孔径最好小于10微米。因此，在另一方面，这里提供了线虫贮存设备，它由可装在可密闭的容器中的密封的半透膜气囊构成。在半透膜气囊和容器壁之间装有很细的粉状吸附剂或分散在水溶液中的吸附剂。吸附剂最好是活性炭。应当知道，活性炭的配方可使线虫以高密度装填，即每克100万个毛纹斯太内尔线虫。对包装的大小设有限制，可以1克以下到1公斤或1公斤以上，这取决于应用的面积和单位面积的用量。
应当知道，本发明上述的每一个方案都可使线虫在不同程度的厌氧和氧压下贮存。线虫可以在真空中贮存，或在氮气、一氧化氮、二氧化碳或空气中贮存。而且贮存条件不要求低温。可以看到，从室温到37℃左右，线虫可长时间维持生存能力。
转过来看图3。容器10由盖12密闭的空壳体11构成。袋13悬挂在盖12下面，它装有线虫载菌体基质14。袋13的一部分15，线虫可渗透过去，而带菌基质不能渗透。
盖12装有管口16，水可通过管口16进入袋13，以便从载菌体基质14中抽提线虫。
使用中，通过管口16泵入水，线虫通过可渗透部分15从载菌体基质14中洗出。空壳体11可用来装线虫洗涤液。作为一个替代的办法，盖12和袋13可从容器中取出，从袋13洗出的线虫装入另一适合的容器中。
现在表明，在另一可选择的方案中，为了易于通过盖12输入水，管口16可用减薄的部分(Weakened portion)或薄片部分(pull tab portion)代替。
转过来看图4。容器20由盖22密闭的空壳体21构成，它借助于线虫可渗透网25分成两个室。第一室和第二室分别为23和24。
使用中，支持线虫培养物的线虫载菌体基质26被送到密封容器20的第一室23中。当需要抽提线虫时，取下盖22，用水洗线虫载菌体基质，悬浮的线虫通过网25进入第二室24。管口27装在壳体21的下半部第二室24中，以便能从容器20中放出悬浮线虫。另一方面，管口可用减薄的部分或薄片部分代替。为了排出悬浮在洗涤水中的线虫，可把容器刺穿。
转过来看图5。容器30由盖32密闭的空壳体31构成。线虫可渗透的袋33放在空壳体31内。它能使载菌体基质34保留在袋33中，而使水和悬浮的线虫通过袋33。
在使用中，可仅把袋33从容器中取出，洗涤出线虫。或取下盖32，用水通过装有载菌体基质34的袋33进行洗涤。减薄的部分35最好装在空壳体31的底部，以便为水和悬浮的线虫提供可排空的出口。
转过来看图6。容器40为盖42密闭的空壳体41。在空壳体41的底部装有填料43即粗粒泡沫物质，如聚氨基甲酸乙酯海绵。载菌体基质44置于粗粒的多孔海绵状物质43的上方。使用中，取下盖42或在盖上装一管口，水经载菌体基质44进行洗涤，从载菌体基质中抽提出线虫。水和悬浮的线虫经粗粒泡沫物质43到孔口45。孔口45可为薄片部分，但另一方面，在容器底部的减薄的部分可由适于刺穿的物质组成。
前面描述的本发明的几种方案和对于这些技术的明显改进可在不违背本发明的范围内作到。例如，通过适宜的柱塞设备，可使从容器的第一室取出线虫变得更为方便。另一可取的方法，容器可有一个普通的灵活出口软管，借助软管可用压力排出第二室内的水。
上述这些方法可用于各种线虫，特别是纯的线虫或斯太内尔线虫科和异小杆科菌种的混合物，其中包括毛纹斯太内尔线虫、格氏斯太内尔线虫(S·glaseri)、(以前为小卷蛾新寄生线虫〔Neoaple-ctama carpocapsae〕、嗜杆菌异小杆科＊(Heterorhabditis bacteriophora)和夜蛾异小杆科＊(H·heliothidis)。
实用于本发明上述的运输方法的现场使用容器，可由任何适宜的材料制成并有任何适宜的尺寸。例如，真空包装的塑料小药囊、类似注射器的铸模、充有空气或惰性气的瓶子、罐子、洋铁罐或渗析管。
＊此处可能有误，Heterophabdilis应为Heterorhabdilis(译者注)线虫可直接从容器中取出使用或用水或其它溶液稀释的方法取出使用，这取决于特定的产品配方和应用。
应该指出，评价贮存配方的性能是以贮存的线虫的感染能力以及游动性(生存能力)为基础的。
用在滤纸上的羊丽蝇类铜绿蝇幼虫进行贮存的线虫的常规生物鉴定。在23℃黑暗中孵化5天后，解剖幼虫确定它们是否感染。得到的结果再与由新鲜线虫得到的结果比较。
为了概括地描述发明的特征，现在描述一些特定的例子，仅作为一个说明。
例1格氏斯太内尔线虫菌株NC513在人工介质上的单寄生培养物中培养，该人工介质由鸡废弃物组织匀浆和聚氨基甲酸乙酯海绵组成。从人工介质上收获的第三期感染幼虫，并用水洗涤。清洁的线虫与0.1%甲醛溶液混合，并在37℃下贮存在密封瓶中。实验结果在表1中给出。结果证明加入抗菌剂(甲醛)，增加了线虫贮存稳定性。作为对比，1.0%甲醛溶液优于水。
在另一相同实验中，在30℃下贮存54天后，格氏斯太内尔线虫的生存能力为90%。
表1 在37℃下贮存后抗菌剂对格氏斯太内尔线虫生存能力的影响配方 生存能力格氏斯太内尔线虫在水中 13天后 19天后 30天后- 0 -格氏斯太内尔线虫在0.1%甲醛溶液中 90 80 80
例2象例1概述的那样，准备格氏斯太内尔线虫菌株NC513。已洗涤的线虫悬浮在M9冲缓溶液中，并在22、28、33和37℃下在密封的瓶中贮存30天，为了对照，悬浮在水中的线虫贮存19天。
在表3给出了这些试验的结果。它们表明生理冲缓缓剂M9的加入增加了线虫的贮存稳定性。
表3 格氏斯太内尔线虫在不同温度下贮存30天(在M9缓冲剂中)后的生存能力在19天(水)和30天(M9)后的生存能力%配方 22℃ 28℃ 33℃ 37℃格氏斯太内尔线虫在水中 0 0 0 0格氏斯太内尔线虫在M9缓冲剂＊90 60 20 -＊M9缓冲剂溶液的组成为在1立升蒸馏水中含Na2HPO46克KH2PO43克Nacl 5克MgSO4·7H2O 0.25克例3象例1概述的那样，准备Agriotis毛纹斯太内尔线虫菌株。线虫悬浮在水或1.0%甲醛溶液中，过滤，用活性炭粉稍加覆盖。然后线虫在22℃贮存。表2列出贮存33天后的试验结果。
这些结果证明了加入吸附剂(如活性炭)大大改善了线虫的贮存稳定性，并证明了通过加入抗菌剂(甲醛)进一步提高了稳定性。
表2 吸附剂和抗菌剂对毛纹斯太内尔线虫在22℃贮存33天后生存能力的影响配方 生存能力(%)毛纹斯太内尔线虫在水中 0毛纹斯太内尔线虫在水+活性炭中 80毛纹斯太内尔线虫在1%甲醛溶液+活性炭中 90-95例4象例1概述的那样，准备Agriotis毛纹斯太内尔线虫菌株。已洗涤的线虫悬浮在高渗透力溶液(30%蔗糖溶液)中，并在22℃贮存。贮存33天后线虫的生存能力为85%。水的对比试验表明，线虫已无生存能力。
例5象例1概述的那样，准备Otio毛纹斯太内尔线虫菌株。已洗涤的线虫(在每毫升0.1%甲醛溶液中4000个)与活性炭粉(在0.1%甲醛溶液中，浓度为20%〔重〕)按1∶1混合。
10毫升混合物经予过滤器微孔填料过滤。完全沥干的带有线虫和活性炭粉的填料放入塑料小药囊中，并密闭。
在室温下贮存140天后，线虫的生存能力为92%。贮存后感染能力稍有下降。
例6象例1概述的那样，准备Mexican毛纹斯太内尔线虫菌株。含65×106个已洗涤的线虫的乳油(在每毫升0.1%甲醛溶液中有1.5×106个线虫)与干的活性炭粉(直径小于400微米)按1∶1混合，然后密封在塑料小药囊中。
在24℃下贮存30天和在4℃下贮存至少80天，感染能力仍完整无损。
小药囊中的混合物悬浮在水中，并通过高压喷咀(2000千帕)喷到朝鲜蓟上。并得出，在应用过程中活性炭无有害的影响。贮存线虫的温度对洋葱羽蛾(artichoke plume moth，platyptilia cazrduidactyla)是满意的。
一个药囊中的混合物(90克)足以覆盖500-5000米2土壤(单位面积用量104-105个线虫/米2)。
参考文献Dutky，S·R·，Thompson，J·B·，and Cantwell，G·E·(1964)DD-136线虫大量繁殖的技术。J·Insect Pathol，6417-422;
Hara，A·H· et al.(1981)weiser小卷蛾新寄生线虫(Neoaptectana carpocapsae weiser)昆虫病原线虫在狗食/洋菜介质上的单寄生大量培养，Advances in Agricul-tural Technology，Wester Series，№ 16 June。
Bedding R·A(1984)昆虫寄生线虫新寄生线虫属and异小杆层的大规模生产，贮存和运输Ann App Biol 104，117-120。
勘误表
权利要求
1.贮存昆虫病原线虫的一种方法。其中感染的昆虫病原线虫的幼虫乳油与吸附剂混合，并在该微生物生长受到抑制的条件下贮存。
2.如权利1要求的方法，其中上述吸附剂选自活性炭和合成树脂。
3.如权利1或2要求的方法，其中活性炭的浓度为10-70%(重)。线虫乳油浓度为30-90%(重)。
4.权利1～3中任何一项要求的方法，其线虫的浓度为(0.2-2)×106个线虫/克线虫乳油。
5.权利1-4中任何一个要求的方法，其中线虫是斯太内尔线虫科和异小杆科纯的线虫或任何菌种的混合物。
6.权利5中要求的方法，其中所说的菌种是毛蚊斯太内尔线虫、格氏斯太内尔线虫、毛纹斯太内尔线虫、嗜杆菌异小杆科和夜蛾异小杆科。
7.权利1-6中任何一项要求的方法，其中微生物的生长由于抗菌剂的存在而受到抑制。
8.权利1-7中任何一项要求的方法，其中在贮存前用抗菌剂洗涤线虫，抑制微生物的生长。
9.权利7或8要求的方法，其中所说的抗菌剂选自甲醛和次氯酸钠。
10.权利7或8要求的方法，其中所说的抗菌剂是高渗透力溶液。
11.权利9要求的方法，其中所说的抗菌剂是浓度为0.1-1.0%(重)的甲醛溶液。
12.适合于延长线虫贮存时间的配方由感染的昆虫病原线虫幼虫乳油与吸附剂和抗菌剂混合组成。
13.权利12要求的线虫配方，其中所说的线虫的浓度为(0.2-2)×106个线虫/克线虫乳油。
14.权利12或13要求的配方，其中所说的配料贮存在密封的容器中。
15.贮存昆虫病原线虫的方法，其中感染的昆虫病原线虫幼虫乳油在基本上厌氧的条件下贮存。
16.权利15要求的方法，其中贮存前线虫用抗菌剂洗涤。
17.权利15要求的方法，其中线虫在抗菌剂存在的条件下贮存。
18.权利15、16或17的方法，其中乳油至少约含0.2×106个线虫/克。
19.如权利1或2或3要求的方法，其中线虫在基本上厌氧的条件下贮存。
20.贮存和运输线虫的容器，该容器是可密闭的，并有两个室和适合于把载菌体基质保留在上述第一空室中，而又可让线虫渗透的设备。第一室装线虫载菌体基质，第二室易于从上述基质中回收线虫。
21.如权利20要求的容器，其中所说的保留载菌体基质在第一室的设备可选自有适宜筛目的筛子，线虫可从该筛渗透;或选自子，它的全部或一部分是线虫可渗透的;或选自线虫可渗透的海绵过滤器。
专利摘要
本发明阐述了线虫贮存和运输的改进方法。一方面，本发明提供了一种贮存昆虫病原线虫的方法。感染的昆虫病原线虫幼虫的乳油与吸附剂混合，并在该微生物生长受到抑制的条件下贮存。另一方面，本发明提供了另一种贮存昆虫病原线虫的方法。感染的昆虫病原线虫幼虫贮存在基本上厌氧的条件下。
文档编号C12N1/04GK85101908SQ85101908
公开日1987年1月10日 申请日期1985年4月1日
发明者塔科·尤卡瓦, 贾尼斯·玛格丽特·比梯 申请人:澳大利亚生物科技公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan