专利名称:单节显性人体γ-干扰素的制造技术
各种干扰素都是用较高级的动物细胞经过病毒和核酸等的诱发而产生的蛋白质，具有抗病毒和抗癌等作用。
目前，按特性的差异，一般将干扰素分成α、β和γ三种类型。
有关α型和β型干扰素的各种研究工作已经取得了相当大的进展。经过改进的纯化干扰素的方法已经出现。对于干扰素性质，也已有了相当深的认识。
在能使淋巴细胞冲击转型或产生淋巴激活素那样的条件下，能用免疫活性细胞制造γ型干扰素。因此γ型干扰素也称为免疫干扰素。与α型和β型干扰素相比，γ型干扰素具有较高的抗增生或抗癌活性，因此从临床应用的观点来看，其优越性更大。但是由于受到如制造γ-干扰素需要新鲜淋巴细胞之类的各种限制，有效的生产系统至今未建立起来。曾有人指出，用不同的实验系统和不同品种的细胞生产γ-干扰素时，能生产出不同分子的，结构和性质等至今还不清楚的γ-干扰素品种。
本发明者曾从是旨在开发一种纯化由基因工程技术制造的人体γ-干扰素的工艺方面的研究和发展工作。在有关的研究工作中，他们发现γ-干扰素具有强的聚合倾向。其结果是使单节显性人体γ-干扰素的产率大大降低。
虽然述及人体γ-干扰素的物理和化学性质的文献很少，但是它可能具有聚合型是清楚的。不过如何从聚合型转化成单节显性型，或者如何阻止由单节显性型转化成聚合型，则是前所未知的。
本发明为制造单节显性人体γ-干扰素提供了一种方法。这种方法包括在还原硫化物和蛋白质变性剂存在下使粗人体γ-干扰素经受凝胶过滤。
上文提到的用本发明方法纯化的人体γ-干扰素，可以是任何含人体γ-干扰素的原料，例如，可以用自然界存在的人体γ-干扰素(即天然γ-干扰素)经过浓缩后所得的粗产物，或用培养由基因转换工艺〔参见欧洲专利0089676，Nucleic Aoids Reseach，10，2487-2501(1982);Nature，295，503-508(1982);Nucleic Acids Reserch，10，3605-3615(1982)〕转换所得的产生人体γ-干扰素的微生物而得的含人体γ-干扰素原料，即重组γ-干扰素。更具体地说，例如，上述重组γ-干扰素包括由146个氨基酸所组成的和氨基酸的排列顺序如图1所示的多肽(Ⅰ)，和象缺N-末端和缺C-末端之类的各种肽段。缺N-末端肽段，即多肽(Ⅰ)的N端部分的氨基酸缺少不到2个的肽段。缺C-末端肽段，即在多肽(Ⅰ)第131个氨基酸残基之后的地方裂开的肽段，例如，在第131和第132个氨基酸残基之间裂开的蛋白质，在其C-末端上的是赖氨酸。
从实用观点来看，从抽提上述培养产生γ-干扰素的微生物而得的细菌所获得的γ-干扰素的有用部分，或用硫酸铵分离、抗体柱洗脱法或离子交换洗脱法，从上述抽提液获得的有用部分，都是可用的。但是由于污染蛋白质的含量较大，还原硫化物的需要量较大，不经济，所以一般最好是采用抗体柱法或离子交换法。在此类粗原料中的γ-干扰素可能以聚合型的形式存在。
还原硫化物包括半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰同型半胱氨酸、谷胱甘肽(还原型)、硫代二醇胺、一硫甘油、dithio-threitol、硫化烷烃(1-7碳)和甲醛次硫酸钠的二水物之类的有机化合物，和偏亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钾之类的含硫无机化合物。
蛋白质变性剂包括盐酸胍、硫酸胍、尿素、硫氰酸钠和硫氰酸钾等。
上述凝胶过滤用的凝胶可从工业用凝胶中选取。最好是选用葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖之类的粒状凝胶。例如，在处理用基因转换技术生产的粗人体γ-干扰素时，从分离出其中污染蛋白质的效率来看，最好是应用分子量范围约10，000到80，000、能够有效分离的凝胶。更确切地说，最好是采用Pharmacia有限公司销售的葡聚糖G50、G75(葡聚糖凝胶与氯甲代氧丙环的交联物)和丙烯酰基凝胶S-200(葡聚糖凝胶与N，N′-二丙烯酰胺的交联物)，Bio-Rad有限公司销售的凝胶过滤剂P-10，P-30和P-60(聚丙烯酰胺凝胶)和Pharmacia有限公司销售的琼脂糖(琼脂糖凝胶)6B。
凝胶的用量一般为所处理样品量的5～100倍(按重量计)，较合适的用量为10～30倍。
采用标准柱法实行凝胶过滤较为合适。
例如，将粗人体γ-干扰素溶入缓冲剂内，将此水溶液送入予先用展开溶剂平衡了的凝胶柱进行处理。用展开溶剂进行洗脱。洗脱速率决定于样品的纯度以及凝胶的类型和数量，洗脱空速一般在0.1～10的范围内，最佳为0.5～3。用通常的方法分馏洗脱液。
用通用的方法可以容易地鉴别含人体γ-干扰素的部分，例如用基于光密度280毫微米吸收数据的曲线来鉴别，等等。
在上述凝胶过滤过程的任何步骤中都可以将还原硫化物和蛋白质变性剂加入到人体γ-干扰素内。最好是将还原硫化物和蛋白质变性剂加入到要进行凝胶过滤的人体γ-干扰素水溶液和展开溶剂中。
当在抽提或抗体柱予处理步骤中使用了蛋白质变性剂时，用不着在待凝胶处理的水溶液中再加这种剂。
待处理水溶液和展开溶剂的PH值宜为5.0～8.0，个别情况的PH值约为中性，还原硫化物的浓度一般为1～100mM，最好为5～20mM。蛋白质变性剂的浓度为0.1～7M，个别情况为1～2M，三盐酸化合物、醋酸盐、磷酸盐和硼酸盐缓冲剂可用作上述水溶液和展开溶剂的缓冲剂，其中最好的是磷酸盐缓冲剂。
在所获得的含有纯化了的人体γ-干扰素洗脱液中所含的还原硫化物和蛋白质变性剂在必要时可以脱除。分离这种低分子量化合物和高分子量化合物-人体γ-干扰素，最好是应用凝胶过滤。
在使用适合于脱除低分子量化合物的凝胶(例如葡聚糖25)时，可以用与上述单体凝胶过滤相同的方法进行凝胶过滤。
在必须脱除还原硫化物的情况下可以用通用的方法实行脱脱液超滤。
在从人体γ-干扰素中分出这些低分子化合物的过程中，可以加血清清蛋白，以保持人体γ-干扰素稳定。
当需要的时候可以将这种纯化了的单节显性人体γ-干扰素冷冻干燥成粉。
按本发明生产的单节显性γ-干扰素在用途和使用方式上与通用的γ-干扰素产品一样。由于其清除污染蛋白质和发热物质比通用产品更为彻底，因此可以比较安全地、大量地用其作生产注射制品的材料，等等。
按照本发明生产的单节显性人体γ-干扰素具有抗病毒、抗癌、抗增生和免疫增强等活性，并可以用管理旧名牌γ-干扰素的方法进行管理。
本发明所指的干扰素活性是抗病毒活性，单位为单位/毫升。测定活性的方法如下所述。为了估计在人体羊膜衍生的FL细胞系中由疱疹性炎病毒(VSV)引起的细胞变性的抑制作用，曾用试验方法对已知活性的国际标准α-干扰素和白血球衍生的粗γ-干扰素进行了测定，用与已知值比较的方法，确定淋巴细胞衍生的γ-干扰素值，并用此γ-干扰素作试验室标准γ-干扰素。在计算原料中γ-干扰素值时，此实验室标准γ-干扰素总是与上述WISH-SVS法测定结果平行地应用，和根据比值计算其值。
在技术要求和权利要求
的说文中mM和M分别表示毫克分子浓度和克分子浓度。
图的简要说明图1表示多肽(Ⅰ)氨基酸的排列顺序，重组γ-干扰素的例子。
图2表示参考例2-(Ⅰ)中质粒PHIThp 1101-d2的构成图。
下列诸例和参考例更详细地阐述了本发明，但决无限制本发明应用范围的意思。
诸例中述及的抗体柱Ab(Mor-2-11.1)系根据欧洲专利0103898(国际申请号PCT/JP83/00174，存档日期1983年5月31日)。
例1(Ⅰ)将300毫升含7M盐酸胍和2mM苯甲磺酰氟的100mM三盐酸缓冲液(PH7.0)，加入100克的由参考例1制得的冷冻细胞中，在4℃下将此混合物搅拌1小时，然后离心分离(17000转/分，30分钟)。用由137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，8mM磷酸氢二钠和1.47mM磷酸二氢钾组成的缓冲液(以下简写为PBS)将所得清洁透明的上清液稀释到70倍。用沙氏离心机(10，000转/分)除去所产生的沉淀，然后用Pericon膜滤器(Millipoke公司产，可以通过分子量低于1000的物质)将所得的22立升上清液浓缩到1.5立升。证此浓缩液在4℃下静止一夜，然后再进行离心分离(10000转/分，30分钟)，以除去所产生的沉淀以1000毫升/时的流率，将所得的上清液输入予先填充好的抗体柱〔Ab(Mor2-11.1)，5×3厘米〕。然后将500毫克的PBS，1000毫升含1M氯化钠和0.1%吐温20的10mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)，500毫升的PBS和500毫升含0.5M盐酸胍的20mM磷酸缓冲液(PH7.0)等洗涤用溶液依次通过抗体柱。然后用含2M盐酸胍的20mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)进行洗脱，以取得62毫升具有抗病毒活性的洗脱物。
(Ⅱ)用含1mM乙二胺四乙脂酸，150mM氯化钠，10mM盐酸半胱氨酸和2M盐酸胍的25mM乙酸盐缓冲液，对装填了丙烯酰基凝胶S-200(Pharmacia公司销售)的柱子(50×60.0厘米)进行予平衡。将例1-(Ⅰ)中所得的62毫升含γ-干扰素的洗脱物输入该柱内，然后同一缓冲液洗脱，以取得83毫升的单体洗脱物。该洗脱物的硫酸十二烷酯切片电泳法(以下用SDS-PAGE表示)测定结果也证明其单节显性型的聚集(表观分子量约为18000)。经过这种分子筛处理，得到3.7毫克比活性为1.5×107单位/毫克蛋白质的γ-干扰素。在参照试验中，除了凝胶过滤用的展开溶剂不含10mM的盐酸半胱氨酸外，其余均用与例1-(Ⅱ)相同的方法对用例1-(Ⅰ)方法制的γ-干扰素进行处理，结果是洗脱物中二聚物和低聚物约占90%，单聚物只约占10%。此结果证明，盐酸半胱氨酸和盐酸胍同时存在的作用是使单节显性型聚集。
(Ⅲ)用含10mM盐酸半胱氨酸、150mM氯化钠和0.01%吐温20的25mM乙酸盐缓冲液(PH6.0)，对葡聚糖G25柱(5.0×60.0厘米)进平予平衡。将例1-(Ⅱ)获得的83毫升含γ-干扰素的洗脱物输入该柱，然后用相同的缓冲液洗脱。这样得到的含γ-干扰素的洗脱物(90毫升，2.7毫克)不含盐酸胍，比活性为1.7×107单位/毫克蛋白质。
(Ⅳ)将450毫克的人体血清清蛋白加入90毫升例1-(Ⅲ)获得的含γ-干扰素的洗脱物中，稀释之后用超滤法将溶液浓缩到60毫升，超滤用的膜是Diaflo PM-10膜(Amico超滤膜)。将此浓缩物输入予先用含150mM氯化钠的25mM磷酸盐缓冲剂(PH7.0)平衡过的葡聚糖G75柱(5×60厘米)，然后用同一缓冲剂展开和洗脱，以取得含γ-干扰素的洗脱物，这种方法清除了例1-(Ⅲ)获得的含γ-干扰素的洗脱物中残存的半胱氨酸，得到了33毫升(2.2毫克)、含血清清蛋白和具有比活性为1.5×107单位/毫克蛋白质的γ-干扰素溶液。
例2按得到浓度为10mM溶液的要求，将谷胱甘肽(还原型)加入用与例1-(Ⅰ)相同的方法所得到的抗体柱洗脱物中，以取得富单聚物、比活性为3×106单位/毫克蛋白质的粗γ-干扰素溶液(63毫升、11毫克)。然后用与例1-(Ⅱ)相同的方法(除凝胶过滤缓冲液中的半胱氨酸为10mM的还原型谷胱甘肽所代之外)，处理该粗γ-干扰素溶液。此法所聚集的单体洗脱物(85毫升)，同样可以用SDS-PAGE方法证明其单体型的聚集(表观分子量约为18000)。将425毫克的血清清蛋白加入85毫升的洗脱物，然后进行凝胶过滤，以制取90毫升不含盐酸胍和比活性为1.8×107单位/毫克蛋白质的γ-干扰素的溶液。
例3(Ⅰ)取参照例2-(Ⅱ)制得的冷冻细胞5.9毫克悬浮于18毫升含7M盐酸胍和2mM苯基甲基磺酰氟的0.1M三盐酸缓冲液(PH7.0)中。在4℃下将此混合搅拌1小时，然后离心分离(10000转/分，30分钟)。用260毫升含137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，8.1mM磷酸氢二钠和1.5mM磷酸二氢钾的缓冲液(PH7.4)(以下简写为PBS)稀释所产的20毫升上清液，然后以1毫升/分的流率将稀释液通过单克萨抗体(Mor2-11.1)柱(床体积12毫升)。用60毫升含0.5M盐酸胍的20mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)洗涤抗体柱，然后用36毫升含2M盐酸胍的20mM磷酸钠缓冲液洗脱多肽，以取得20毫升具有抗病毒活性的洗脱物。
将此20毫升的洗脱物送入用含2M盐酸胍，0.15M氯化钠，1mM乙二胺四乙酸酯和10mM半胱氨酸的25mM乙酸铵缓冲液(PH6.0)平衡过的丙烯酰基凝胶S-200(Pharmacia精细化学公司产)柱(2.6×94厘米，床体积500毫升)，然后用相同的缓冲洗脱，以制得37毫升具有抗病毒活性洗脱液。
这样可以获得5.9毫克比活性为1.0×107单位/毫克的肽。十二烷磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法(根据Laemmli提出的方法〔Nature 227，680-685(1970)〕)测定的结果表明，多肽的分子量约为18000。在非还原的条件下，在相当于二聚物分子位置上只观察到了若隐若现的蛋白质带。
参考例1如欧洲专利0089676例8中所述的，在30℃的MP葡萄糖培养基中培养载有人体γ-干扰素基因表现的菌株RRI(PRK248CIts，PRC231/IFI-900)，直到细胞浓度达到3～4×108个细胞/毫升为止。加入的葡萄糖和酪蛋白氨基酸的浓度分别为1.0%和0.5%。在42℃下，诱导1小时后，用离心法分离培养物。由此获得的细胞被冷冻和贮藏，含在其中的粗γ-干扰素具有如图1所示的氨基酸的排列顺序。
参考例2用限制性内切酶AvaⅡ和PstⅠ水解γ-干扰素表现质粒(参见欧洲专利0110044的例2(Ⅲ))，然后分离出含γ-干扰素结构基因的Ava Ⅱ-Pst Ⅰ 1KbDNA。对于由此获得的DNA′(脱氧核糖核酸)片断Ava Ⅱ的裂开端，用TA DNA连接酶将其连接成含有蛋白合成开始密码(见下)的低聚核甘酸的连接物。
CGATAATGTGCCAGTATTACACGGTCCTG此密码是三酯(Triester)法化学合成的密码。
将与上述连接物结合在一起的γ-干扰素结构基因，插入用限制性内切酶Cla Ⅰ和Pst Ⅰ切割质粒Ptrp771(参见欧洲专利0110044的例2(Ⅱ))而得的DNA片断启动子的后部，以构成表现质粒PHIttrp1102-d2(图2)。
用Cohen等人的方法(Proc Natl Acad Sci USA，69，2110(1972))，用所得的质粒PHII trp 1102-d2，将大肠杆菌294转变成变形的大肠杆菌294/PHII trp1101-d2。此物存放在大板发酵研究所，编号为IFO-14350。
置大肠杆菌294/PHII trp1102-d2于含四环素8微克/毫升，酪蛋白氨基酸0.4%和葡萄糖1%的培养基中，在37℃下进行孵化。当增大程度达到KU220时，加入3β-吲哚丙烯酸(IAA)，至浓度为25微克/毫升时为止，然后再孵化4小时。孵化之后用离心分离法将细胞聚集。包含在其内的重组γ-干扰素具有图1中第3号到第146号氨基酸的排列顺序。
图11半胱氨酸 酪氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 天冬氨酸 脯氨酸酪氨酸 缬氨酸 赖氨酸 谷氨酸 丙氨酸 谷氨酸 天冬酰胺20亮氨酸 赖氨酸 赖氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 天冬酰胺 丙氨酸甘氨酸 组氨酸 丝氨酸 天冬氨酸 缬氨酸 丙氨酸 天冬氨酸天冬酰胺 甘氨酸 苏氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 甘氨酸40异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 天冬酰胺 色氨酸 赖氨酸 谷氨酸谷氨酸 丝氨酸 天冬氨酸 精氨酸 赖氨酸 异亮氨酸 甲硫氨酸谷氨酰胺 丝氨酸 谷氨酰酸 异亮氨酸 缬氨酸 丝氨酸 苯丙氨酸60酪氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 天冬酰胺苯丙氨酸 赖氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷氨酰胺 丝氨酸异亮氨酸 谷氨酰酸 赖氨酸 丝氨酸 缬氨酸 谷氨酸 苏氨酸80异亮氨酸 赖氨酸 谷氨酸 天冬氨酸 甲硫氨酸 天冬酰胺缬氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸 苯丙氨酸 天冬酰胺 丝氨酸天冬酰胺 赖氨酸 赖氨酸 赖氨酸 精氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸100苯丙氨酸 谷氨酸 赖氨酸 亮氨酸 苏氨酸 天冬酰胺 苏氨酸丝氨酸 缬氨酸 苏氨酸 天冬氨赖 亮氨酸 天冬酰胺 缬氨酸谷氨酰酸 精氨酸 赖氨酸 丙氨酸 异亮氨酸 组氨酸 谷氨酸120亮氨酸异亮氨酸谷氨酰胺
氨酸甲硫氨酸丙氨酸谷氨酸亮氨酸 丝氨酸 脯氨酸 丙氨酸 丙氨酸 赖氨酸 苏氨酸甘氨酸 赖氨酸 精氨酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 谷氨酸140甲硫氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 精氨酸 甘氨酸 精氨酸 精氨酸146丙氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺
权利要求
1.在还原硫化物和蛋白质变性剂存在下，粗人体γ-干扰素经过凝胶过滤制造单节显性人体γ-干扰素的方法。
2.按照权利要求
1的方法，其中的还原硫化物是有机硫化物。
3.按照权利要求
2的方法，其中的有机硫化物应从半胱氨酸、谷胱甘肽(还原型)，硫化乙醇胺，一硫甘油，ditbiotherei-tol，硫代烷烃(1～7碳)和甲醛次硫酸钠的二水物这些有机硫化物中挑选一个。
4.按照权利要求
3的方法，其中的有机硫化物是谷胱甘肽(还原型)。
5.按照权利要求
1的方法，其中的蛋白质变性剂应从胍盐，尿素和硫氰酸盐这些化合物中挑选一个。
6.按照权利要求
5的方法，其中的蛋白质变性剂是胍盐。
7.按照权利要求
1的方法，其中的粗人体γ-干扰素是重组人体γ-干扰素。
8.按照权利要求
1的方法，粗γ-干扰素是载有含人体γ-干扰素提取液的抗体柱的洗脱物。
9.按照权利要求
1的方法，其中的凝胶应从葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖这些凝胶中挑选一个。
10.按照权利要求
9的方法，其中的凝胶是葡聚糖凝胶。
11.按照权利要求
1的方法，其中的凝胶过滤的做法是先将粗人体γ-干扰素溶解在含有还原硫化物和蛋白质变性物的缓冲溶液中，然后将此溶液输入粒状凝胶填充柱，然后用同一缓冲液洗脱γ-干扰素。
12.按照权利要求
11的方法，缓冲溶液中还原硫化物和蛋白质变性剂的浓度依次为1～100mM和0.1-7M。
13.按照权利要求
11的方法，其中缓冲溶液的PH值约为5.0～8.0。
14.按照权利要求
11的方法，其中的洗脱空速约为0.1～10。
15.按照权利要求
1的方法，应用适宜于脱除低分子量的凝胶，将所得的单节显性人体γ-干扰素再进行一次凝胶过滤，以获得不含还原硫化物和蛋白质变性剂的单节人体γ-干扰素。
专利摘要
在还原硫化物和蛋白质变性剂存在下，粗人体γ-干扰素经过凝胶过滤，可以高效地制造单节显性人体γ-干扰素。
文档编号C07K14/57GK85101907SQ85101907
公开日1987年1月10日 申请日期1985年4月1日
发明者奈良洁, 本多进 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan