专利名称：一种重组肝靶向干扰素的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组肝靶向干扰素的制备工艺。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(简称乙型肝炎)是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus，HBV) 引起的肝脏炎性损害。目前HBV感染已经成为全球性危害的态势，全球60亿人口中，约20 亿人有过HBV感染经历，3. 5亿人为慢性HBV感染者，大约80%的患者有不同程度的肝细胞受损，并可能发展成肝硬化和肝癌。每年死于乙肝相关疾病的人数高达100多万，WHO已将 HBV感染列为全球十大最常见致死病因之一。我国属HBV高流行区，一般人群HBsAg携带率高达7. 18%，这不仅严重影响人民身体健康，同时也是一个严重的社会问题。
大量的临床研究证明，HBV在体内长期存在和不断复制引起肝脏病变的持续活动和发展是导致病情进展的根本原因，故抗病毒治疗是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)治疗的关键。目前干扰素(Interferon, IFN)是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)抗病毒治疗的首选药物之一。根据IFN的细胞来源、分子结构、理化性质和生物学活性的差别，将其分为α-干扰素(IFNci )、β-干扰素(IFNi3 )和Y-干扰素(IFNy)三型，每一型根据其组成氨基酸的差异又可分为多个亚型，如IFNa lb、IFNa 2b等。IFNa 2b 是FDA批准的第一个抗HBV药，经过几十年的临床运用，其治疗乙型肝炎得到了充分肯定。 然而作为抗HBV的首选药物之一，IFN a 2b存在着用药剂量大、疗效不够理想、毒副作用大等缺点，限制了其在临床中的广泛应用。这主要原因是由于HBV主要在肝细胞内寄生和复制，治疗时IFN a 2b在体内容易扩散降解，导致相对平均的组织分布，未能在肝脏形成有效的抗病毒作用浓度。为了达到抗病毒效果，药物剂量常要加大几倍、几十倍，药物剂量的加大也加重了其不良反应，又容易产生耐药性HBV，从而影响疗效。
重组肝靶向干扰素是将来源于疟原虫环子孢子蛋白的肝靶向肽CSP I-plus与 IFNa 2b进行融合，利用CSP I-plus高效特异的肝细胞靶向性将IFN a 2b导向肝脏，使其在肝脏富集，从而提高了干扰素治疗慢性HBV感染的特异性，减少全身用量，降低毒副反应， 提高量效比，具有重大的开发应用潜力。但如何低成本、大量获得肝靶向干扰素以满足其开发与应用的需求目前未见报道。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，应用最为广泛的经典表达系统， 是生物技术研究和生物药物产业化进程中的重要工具，目前用于临床的干扰素多来源于大肠杆菌原核系统。但在采用大肠杆菌原核表达系统表达时，表达出来的目的蛋白氨基酸序列上一般会多出蛋氨酸和限制性内切酶位点序列，增加了未知的用药风险。另外，通过原核表达系统表达目的蛋白，多数以包涵体的形式表达，包涵体为蛋白折叠中间体聚集形成的非活性蛋白，必须通过变复性的方式获得活性蛋白，由于复性效率低下，蛋白得率少等原因使的蛋白药物制备成本居高不下、推广应用受到限制。现有技术中生产的重组人干扰素原液是采用单克隆抗体亲合层析纯化，单抗的制备烦琐，成本很高，且配体容易脱落，对产品造成异源鼠IgG的污染。发明内容
为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明提供一种重组肝靶向干扰素的制备工艺。本发明创造性地探索了重组肝靶向干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达以及表达产物的纯化工艺，通过简便的步骤制备得到高纯度高活性的符合药用标准的重组肝靶向干扰素。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现一种重组肝靶向干扰素的制备工艺，包括如下步骤(1)将含有重组肝靶向干扰素融合蛋白基因的原核工程菌进行发酵；(2)提取包涵体；(3)用洗涤液洗涤包涵体；(4)变性用溶解液溶解洗涤后的包涵体获得包涵体溶出液；(5)复性采用对倍稀释加梯度透析的方法去除变性剂；(6)重组Enterokinase 酶切；(7)HisTrap HP 柱和 HiTrap Heparin HP 柱组合纯化；步骤(3)中所述洗涤液为含有2%脱氧胆酸钠、2M尿素、5mM EDTA、50mM Tris-HCl的缓冲液；步骤(4)中所述溶解液为含有6M盐酸胍、2. 5mM DTT、5mM EDTA、50mM Tris-HCl pH8. O 的缓冲液；步骤(5)中所述对倍稀释是采用含有4M盐酸胍、2. 5mM DTT、5%甘油、IOOmM精氨酸、 50mM Tris-HCl pH8. O的稀释液,稀释至蛋白浓度为100ng/ml ；步骤(5)中所述梯度透析是采用含O. 5 3 M盐酸胍、0.2mM MGSH、2mM GSH、50mM Tris-HCl pH8. 0的缓冲液对包涵体稀释液进行梯度透析，透析外液的换液间隔最少5小时。
作为一种优选方案，步骤(2)所述提取包涵体采用高渗蔗糖溶液联合超声破菌的方法；所述高渗蔗糖溶液联合超声破菌采用30%蔗糖、50mM Tris-HCl按1:10 (g/ml)的比例重悬菌体，37°C和-20°C之间反复冻融3次，置冰浴中超声破碎，2s/次，间歇2s，超声30 分钟；作为一种优选方案，上述制备工艺中，步骤(6)中所述Enterokinase酶切条件为10°C 用I. OU的重组Enterokinase酶切5天；作为一种优选方案，上述制备工艺中，步骤(7 )中所述Hi sTrap HP柱纯化用Tri s-HCl 缓冲体系在PH8.0的条件下进行，收集穿透样品得到目的蛋白，再用500 mM咪唑洗脱杂蛋白；作为一种优选方案，上述制备工艺中，步骤(7)中所述HiTrap Heparin HP柱纯化用 Tris-HCl缓冲体系在pH7. 5的条件下进行，先用O. IM氯化钠冲洗，再用O. 4M的氯化钠洗脱目的蛋白。
与现有技术相比，本发明提供的重组肝靶向干扰素的制备方法，具有如下有益效果(I)通过融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的方式表达，将标签蛋白切除后最终获得的肝靶向干扰素完全忠实于原始设计，保持了与目的蛋白氨基酸序列完全一致的序列，不同于现有其它表达方式通常会多出的不必要的蛋氨酸和限制性内切酶位点序列，有助于减少未知的用药风险。
(2)通过变性、透析复性后所得的融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的纯度可达到95%以上，无需融合蛋白的过柱纯化过程，减少处理步骤中可能的污染与损失。
(3)以融合蛋白方式表达，融合蛋白中Trx标签有助于蛋白的闻效表达，提闻蛋白复性效率，保护融合蛋白免受蛋白酶降解；而His标签可特异性结合Ni柱，酶切后进行亲和层析，一步纯化所得的IFN-CSP可达到85%以上。通过肝素亲和层析再次纯化，精纯后获得 IFN-CSP的纯度可达98%以上。内毒素检测结果小于〈O. 25 Eu/4X107 IU，无需去内毒素过程，简化了工艺，减少了损失。同时获得高效复性，IFN-CSP的生物学活性达到2. 5 X IO8 IU/mg以上。
图I为正交实验16个实验号的SDS-PAGE分析图，其中M为蛋白分子量marker，I 为未诱导的全菌蛋白，2-17为16个正交实验号的全菌蛋白；图2诱导表达和破菌的SDS-PAGE分析，其中，M为蛋白分子量marker，I为未诱导的全菌蛋白，2为诱导后的全菌蛋白，3为超声破菌上清，4为超声破菌沉淀；图3包涵体洗涤的SDS-PAGE分析，其中，M为蛋白分子量marker，I为包涵体，2为洗涤上清，3为洗涤后的包涵体；图4包涵体溶解的SDS-PAGE分析，其中，M为蛋白分子量marker，I为洗涤后的包涵体，2为不溶解的蛋白，3为溶解上清；图5复性的SDS-PAGE分析，其中，M为蛋白分子量marker，I为溶解上清，2为透析聚沉蛋白，3为复性后蛋白；图6重组Enterokinase酶切的SDS-PAGE分析，图A为室温条件下，使用重组 Enterokinase酶切重组肝祀向干扰素,其中，M为蛋白分子量marker, I为经复性的融合蛋白，2-8为酶切用量分别为O. 1U、0. 2U、0. 4U、0. 6U、0. 8U、1. 0U、1. 2U ;图B为4°C条件下，使用重组Enterokinase酶切重组肝靶向干扰素，其中，M为蛋白分子量marker，I为经复性的融合蛋白，2-8为酶切用量分别为O. 1U、0. 2U、0. 4U、0. 6U、0. 8U、1. 0U、1. 2U ;图C为10。。条件下，使用重组Enterokinase酶切重组肝祀向干扰素,其中，M为蛋白分子量marker, I为经复性的融合蛋白；2-7为酶切用量分别为O. 1U、0. 2U、0. 4U、0. 6U、0. 8U、1. OU ；图7 HisTrap HP柱纯化和HiTrap Heparin HP柱纯化的SDS-PAGE分析，其中，M 为蛋白分子量marker，I为复性后的重组肝靶向干扰素，2为酶切后的重组肝靶向干扰素，3 为HisTrap HP柱穿透蛋白，4为HisTrap HP柱洗脱蛋白5为HiTrap Heparin HP柱穿透蛋白，6为HiTrap Heparin HP柱洗脱蛋白；图8 HPLC检测重组肝靶向干扰素纯度；图9 Wish-VSV系统测定重组肝靶向干扰素活性；具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法，可参照本领域常规方法条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的方法和条件，或按照制造产品厂商所建议的条件进行。本发明所使用的含有重组肝靶向干扰素融合蛋白基因的原核工程菌是专利申请号201110175065. 6 一种肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白及其制备方法和应用中所述含有IFN-CSP/pET32a重组质粒的大肠杆菌BL21 (DE3 )。实施例中使用的Hi sTrap HP 柱(GE healthcare)、HiTrap Heparin HP 柱(GE healthcare)、重组 Enterokinase 购自Novagen公司。
实施例I工程菌发酵条件的优化用正交设计软件正交设计助手II设计L16 (45)正交表(正交表见表I)。选取温度(A)、 诱导时间(B)、起始菌体浓度(C)、诱导剂IPTG浓度⑶及培养基pH (E)五个因素作为观察因素，每个因素各选取4个水平，分16个组进行诱导表达，各实验组的发酵液经离心收集菌细胞，加入 I X SDS-PAGE Buffer (50mM Tris-HCl ρΗ6· 8，IOOmM DTT，2%SDS，0. 1% 溴酚蓝， 10%甘油)，煮沸8min，离心，取上清加样。制作5%的浓缩胶，15 %的分离胶，电泳电压浓缩胶80V，分离胶120V。电泳结束后，凝胶进行考马斯亮蓝染色、脱色、扫描分析(结果见图I)。 进而对结果进行直观分析及方差分析，以确定诱导的最优表达条件。极差分析可知(结果见表1)，C>A>D>B>E,即对IFN-CSP表达量影响的因素为起始菌体浓度 > 诱导温度 > 诱导剂浓度 > 诱导时间>pH。在实验条件下优化水平的最佳组合为A3B1C3D1E1，即将含100 μ g/ ml氨苄青霉素的LB培养基(1%蛋白胨、O. 5%酵母抽提粉、1%氯化钠)的pH调为6. 0，按 I 100接种活化工程菌液，置振荡培养箱37°C培养，待菌体密度0D600达到O. 8时，加入终浓度为O. 4 mM的IPTG诱导培养6 h，高速离心收集菌体。在此诱导条件下，融合蛋白的表达比例高达74. 3%，是非优化条件下的I. 2倍。
表I L16 (45)正交设计及实验结果与分析权利要求
1.一种重组肝靶向干扰素的制备工艺，其特征在于包括如下步骤 (1)将含有重组肝靶向干扰素融合蛋白基因的原核工程菌进行发酵； (2)提取包涵体； (3)用洗涤液洗涤包涵体； (4)变性用溶解液溶解洗涤后的包涵体获得包涵体溶出液； (5)复性采用对倍稀释加梯度透析的方法去除变性剂； (6)重组Enterokinase 酶切； (7)HisTrap HP 柱和 HiTrap Heparin HP 柱组合纯化； 步骤(3)中所述洗涤液为含有2%脱氧胆酸钠、2M尿素、5mM EDTA、50mM Tris-HCl的缓冲液； 步骤(4)中所述溶解液为含有6M盐酸胍、2. 5mM DTT、5mM EDTA、50mM Tris-HCl pH8. O的缓冲液； 步骤(5)中所述对倍稀释是采用含有4M盐酸胍、2. 5mM DTT、5%甘油、IOOmM精氨酸、50mM Tris-HCl pH8. O的稀释液,稀释至蛋白浓度为100ng/ml ； 步骤(5)中所述梯度透析是采用含0.5 3 M盐酸胍、0.2mM MGSH、2mM GSH、50mMTris-HCl pH8. 0的缓冲液对包涵体稀释液进行梯度透析，透析外液的换液间隔最少5小时。
2.如权利要求I所述的重组肝靶向干扰素的制备方法，其特征在于步骤(2)所述提取包涵体采用高渗蔗糖溶液联合超声破菌的方法。
3.如权利要求2所述的重组肝靶向干扰素的制备方法，其特征在于所述高渗蔗糖溶液联合超声破菌采用30%蔗糖、50mM Tris-HCl按1:10(g/ml)的比例重悬菌体，37°C和_20°C之间反复冻融3次，置冰浴中超声破碎，2s/次，间歇2s，超声30分钟。
4.如权利要求I所述的重组肝靶向干扰素的制备方法，其特征在于步骤(6)中所述Enterokinase酶切条件为10°C用I. OU的重组Enterokinase酶切5天。
5.如权利要求I所述的重组肝靶向干扰素的制备方法，其特征在于步骤(7)中所述HisTrap HP柱纯化用Tris-HCl缓冲体系在pH8. O的条件下进行，收集穿透样品得到目的蛋白，再用500 mM咪唑洗脱杂蛋白。
6.如权利要求I所述的重组肝靶向干扰素的制备方法，其特征在于步骤(7)中所述HiTrap Heparin HP柱纯化用Tris-HCl缓冲体系在ρΗ7· 5的条件下进行，先用O. IM氯化钠去除杂蛋白，再用O. 4Μ的氯化钠洗脱目的蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种重组肝靶向干扰素的制备工艺。本发明对整合有重组肝靶向干扰素基因的原核工程菌发酵条件进行优化，然后破菌提取包涵体、洗涤、变性溶解、梯度透析复性、重组Enterokinase酶切、HisTrap HP柱和HiTrap HeparinHP柱组合纯化，制备得到药用重组肝靶向干扰素。本发明通过变性、透析复性后得到的融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的纯度可达到95%以上，无需融合蛋白的过柱纯化过程，减少处理步骤中可能的污染与损失；另外，本发明将标签蛋白切除后得到的重组肝靶向干扰素完全忠实于原始设计，有助于减少未知的用药风险；最后，通过肝素亲和层析再次纯化，无需去内毒素过程，简化了工艺，减少了损失。
文档编号C07K1/22GK102925519SQ20121045615
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者朱家勇, 卢雪梅, 黄演婷, 金小宝, 汪洁 申请人:广东药学院