专利名称：家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法。
背景技术：
蚕蛹蛋白是一种优质的蛋白质资源，含有18种氨基酸，其中8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量的40%，其蛋白极易水解被人体消化吸收，是一种比较理想的蛋白来源。研究表明，蚕蛹蛋白质与氨基酸具有特殊的生理活性，其多肽具有降低血清胆固醇和抗氧化作用。据报道，蚕蛹复合氨基酸具有明显促进幼年雄性大鼠体重增长和血液运输氧气和营养物质能力、促进机体蛋白质合成，加速新陈代谢、提高机体免疫能力和肾上腺机能等多种生理活性，可为生化制药及食用蛋白提供廉价的原料。 家蚕蚕蛹中存在70%左右的30kD蛋白群，这一蛋白群具有载脂蛋白功能，参与抑制家蚕的细胞程序性死亡，并且可以抑制人类细胞的程序性死亡。目前对于30kD蛋白群的纯化方法都较为繁琐，而且纯化效率也不是很高。中国专利申请(公开号102424701)公开了一种蚕蛹中人生长激素类似脂蛋白的纯化方法，需要经过匀浆、离心、硫酸铵沉淀、蛋白纯化仪纯化、亲和层析纯化、超滤浓缩等必需步骤。
发明内容
为了解决现有技术中30kD蛋白群纯化步骤复杂繁琐，成本较高，纯化效率低的缺陷，本发明提供了一种新的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，主要依据蛋白分子量大小，通过简单的硫酸铵分级沉淀，离心和超滤膜包超滤方法，获得的30kD蛋白群。本发明提供的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，纯化步骤为取家蚕蚕蛹进行破碎细胞，细胞破碎液离心后取上清进行硫酸铵分级沉淀，沉淀重悬后经过SOldTlOOkD超滤膜超滤，流出液再经过30kD 50kD超滤膜超滤，收集截留液，最终获得30kD蛋白群。家蚕蚕蛹可以使用新鲜蚕蛹、经过干燥或冷冻干燥等处理的蚕蛹产品。优选地，纯化在(T4°C的温度条件下进行。30kD蛋白群为具有生物活性的蛋白群，提纯过程中最好能够保持在低温条件下进行以避免被降解，确保最终提纯的蛋白质仍然具有生物活性且保持较高的纯度。优选地，所述破碎细胞使用匀浆的方法，用的PBS与家蚕蚕蛹混合匀浆。PBS为磷酸盐缓冲液，配方如下137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH7. 4 7. 6。优选使用预冷的PBS，预冷是指在实验前先进行降温，例如放在4°C冰箱降温。PBS体积优选为蚕蛹体积的十倍，可以充分溶解蚕蛹中的蛋白。细胞破碎方法较多使用超声波破碎法、捣碎机破碎法、反复冻融法和化学法等，就本发明的30kD蛋白群来说，使用匀浆法既能满足破碎充分且不致蛋白失活的要求，也能最大程度地节约成本，该方法通过简单的实验装置和操作就能大量获得含有目的蛋白的优化原料，且价格便宜有利于大规模纯化工艺的建立。
优选地，所述离心的速率为8000rpm以上。更优选为800(Tl2000rpm。30kD蛋白群为分子量较小的蛋白群，如果转速过低，则无法分离出这一蛋白群。
优选地，所述硫酸铵分级沉淀的步骤之前还包括将细胞破碎液离心后的上清用9 层纱布过滤的步骤。该步骤主要用于除去上清液中的不溶物质和油脂等成分，便于后续纯化的顺利进行，该步骤也可以在后续的步骤中按需要添加。
优选地，所述硫酸铵分级沉淀是用饱和度为25%的(NH4) 2S04盐溶，用饱和度为65% 的(NH4)2SO4盐析。在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为 100%。硫酸铵的盐溶和盐析浓度为最适宜30kD蛋白群的浓度，最大限度地提高了 30kD蛋白群的纯化率。且对硫酸铵溶液的PH值无任何限制，便于溶液配制，简化了提纯步骤。
优选地，沉淀重悬后经过IOOkD超滤膜超滤，流出液再经过30kD超滤膜超滤。经过多次试验发现，使用IOOkD和30kD超滤膜，能够提高30kD蛋白群的纯化率。
优选地，所述收集截留液是使用截留液体积3 10倍的PBS反复冲洗超滤系统，收集洗出液。这样能够获得最大量的目的蛋白。PBS体积最佳为截留液体积的10倍。
本发明具有以下有益效果
本发明的纯化方法减少了对目的蛋白的损伤及损耗，能够利用最简单的步骤获得大量较纯的目的蛋白，既简单又节省大量人力物力。本发明能够为30kD蛋白群功能的进一步研究提供纯化方法上的便利，并为其他类似蛋白的分离纯化提供借鉴。
图I是实施例I的30kD蛋白群纯化图，M :蛋白分子量标准；1 :80kD超滤膜包流出液；2 50kD超滤膜包截留液。
图2是实施例2的30 kD蛋白群纯化图，M :蛋白分子量标准；1 :蚕蛹冻干粉；2 :蚕蛹冻干粉离心后上清溶液；3 :45%饱和度硫酸铵沉淀下蛋白；4和5 :65%饱和度硫酸铵沉淀下蛋白；6 80%饱和度硫酸铵沉淀下蛋白。
图3是实施例3的30kD蛋白群纯化图，M :蛋白分子量标准；1 :超滤膜包超滤前上清；2: IOOkD超滤膜包截留液；3 =IOOkD超滤膜包流出液；4 30kD超滤膜包截留液；5 30kD超滤膜包流出液。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例IPBS 配方137mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7· 4 7· 6。
I.匀浆及离心取IOOg蚕蛹，IOOOmL预冷的PBS匀浆；匀浆液于0 2°C，12000rpm,离心30min，收集上清。
2.硫酸铵分级沉淀(O上清定容，根据硫酸铵饱和度计算器，上清中加入一定量的固体(NH4)2SO4，至溶液(NH4)2SO4饱和度为25%，4°C磁力搅拌器上搅拌30min，4°C静止90min。4°C，12000rpm，离心 30min,收集上清。
(2)上清定容，根据硫酸铵饱和度计算器，称取一定量的固体(NH4)2SO4，至溶液 (NH4)2SO4饱和度为65%，4°C磁力搅拌器上搅拌30min，4°C静止90min。4°C，12000rpm，离心30min，收集沉淀，5倍体积的PBS (例如Ig沉淀5mL的PBS重悬)，4°C磁力搅拌器上搅拌 30min后，4°C, 12000rpm,离心60min,弃沉淀留上清。
3.超滤膜包超滤根据超滤膜包 Sartocube I Sartocon I Sartocon Slice Sartocon Slice 200 Cassettes操作手册(购于Sartorius Stedim Biotech公司)装好超滤膜包,上清过80kD 超滤膜包，用3倍体积的预冷PBS反复冲洗(例如IOOmL上清用500mL体积的预冷PBS)，收集流出液。
50kD超滤膜包超滤流出液，至截留液体积是原来体积的八分之一(例如800mL流出液浓缩至截留液体积为lOOmL)。所得截留液中为30kD蛋白群，截留液送去冻干制成冻干粉。纯化蛋白电泳结果见图I。
实施例2本实施例设置三个不同的硫酸铵盐析饱和度进行三组对比试验，每组试验分别进行以下操作PBS 配方137mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7· 4 7· 6。
I.匀浆及离心取IOOg蚕蛹冻干粉(浙江中奇生物医药股份有限公司提供)，IOOOmL预冷的PBS匀浆； 勻衆液于O 2°C, 12000rpm,离心30min,收集上清。
2.硫酸铵分级沉淀(O上清定容，根据硫酸铵饱和度计算器，上清中加入一定量的固体(NH4)2SO4，至溶液 (NH4)2SO4饱和度为25%，4°C磁力搅拌器上搅拌30min，4°C静止90min。4°C，12000rpm，离心 30min,收集上清。
(2)上清定容，根据硫酸铵饱和度计算器，称取一定量的固体(NH4)2SO4，至溶液 (NH4)2SO4饱和度为45% (另外两组分别调整为65%和80%)，4°C磁力搅拌器上搅拌30min， 4°C静止90min。4°C，12000rpm,离心30min,收集沉淀，5倍体积的PBS (例如Ig沉淀5mL 的PBS重悬),4°C磁力搅拌器上搅拌30min后，4°C, 12000rpm,离心60min,弃沉淀留上清。
3.超滤膜包超滤根据超滤膜包 Sartocube I Sartocon I Sartocon Slice Sartocon Slice 200 Cassettes操作手册(购于Sartorius Stedim Biotech公司)装好超滤膜包,上清过80kD 超滤膜包，用10倍体积的预冷PBS反复冲洗(例如IOOmL上清用500mL体积的预冷PBS)，收集流出液。
50kD超滤膜包超滤流出液，至截留液体积是原来体积的八分之一(例如800mL流出液浓缩至截留液体积为100mL)。所得截留液中为30kD蛋白群，截留液送去冻干制成冻干粉。三组纯化蛋白电泳结果见图2。
实施例3PBS 配方137mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7· 4 7· 6。
I.匀浆及离心取IOOg蚕蛹冻干粉(浙江中奇生物医药股份有限公司提供)，IOOOmL预冷(4°C冰箱降温)的PBS勻衆三次,每次Imin,中间勻衆杯冰上降温Imin ;勻衆液于4°C,8000rpm,离心 30min,上清液用9层纱布过滤，重复三次，收集上清。
2.硫酸铵分级沉淀(O上清定容，根据硫酸铵饱和度计算器，上清中加入一定量的固体(NH4)2SO4，至溶液 (NH4)2SO4饱和度为25%，4°C磁力搅拌器上搅拌30min，4°C静止90min。4°C,8000rpm,离心 30min,9层纱布过滤,收集上清。
(2)上清定容，根据硫酸铵饱和度计算器，称取一定量的固体(NH4)2SO4，至溶液 (NH4)2SO4饱和度为65%，4°C磁力搅拌器上搅拌30min，4°C静止90min。4°C,8000rpm,离心 30min,收集沉淀，5倍体积的PBS (例如Ig沉淀5mL的PBS重悬)，4°C磁力搅拌器上搅拌 30min后，4°C, 8000rpm,离心60min,弃沉淀留上清。
3.超滤膜包超滤根据 Sartocube I Sartocon I Sartocon Slice Sartocon Slice 200 Cassettes 操作手册(购于Sartorius Stedim Biotech公司)装好超滤膜包,上清过IOOkD超滤膜包,用 5倍体积的预冷PBS反复冲洗(例如IOOmL上清用500mL体积的预冷PBS)，收集流出液。
30kD超滤膜包超滤流出液，至截留液体积是原来体积的十分之一(例如IOOOmL流出液浓缩至截留液体积为100mL)。所得截留液中为30kD蛋白群，截留液送去冻干制成冻干粉。各步骤的电泳结果见图3。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
权利要求
1.一种家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，纯化步骤为取家蚕蚕蛹进行破碎细胞，细胞破碎液离心后取上清进行硫酸铵分级沉淀，沉淀重悬后经过SOldTlOOkD超滤膜超滤，流出液再经过30kD 50kD超滤膜超滤，收集截留液，最终获得30kD蛋白群。
2.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，纯化在(T4°C的温度条件下进行。
3.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，所述破碎细胞使用匀浆的方法，用PBS与家蚕蚕蛹混合匀浆。
4.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，所述离心的速率为8000rpm以上。
5.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，所述硫酸铵分级沉淀的步骤之前还包括将细胞破碎液离心后的上清用9层纱布过滤的步骤。
6.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，所述硫酸铵分级沉淀是用饱和度为25%的(NH4)2SO4盐溶，用饱和度为65%的(NH4)2SO4盐析。
7.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，沉淀重悬后经过IOOkD超滤膜超滤，流出液再经过30kD超滤膜超滤。
8.根据权利要求I所述的家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，其特征在于，所述收集截留液是使用截留液体积3 10倍的PBS反复冲洗超滤系统，收集洗出液。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法，属于蛋白纯化技术领域，该方法的纯化步骤为取家蚕蚕蛹进行破碎细胞，细胞破碎液离心后取上清进行硫酸铵分级沉淀，沉淀重悬后经过80kD~100kD超滤膜超滤，流出液再经过30kD~50kD超滤膜超滤，收集截留液，最终获得30kD蛋白群。本发明的纯化方法减少了对目的蛋白的损伤及损耗，能够利用最简单的步骤获得大量较纯的目的蛋白，操作简单且成本低廉。
文档编号C07K1/30GK102977184SQ20121045281
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者张耀洲, 王鉴, 杜瑶瑶, 陈剑清, 舒特俊 申请人:天津耀宇生物技术有限公司