专利名称：用维生素b12和干扰素联合治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的方法
发明领域
本发明提供了使用维生素B12类化合物与干扰素化合物结合治疗病毒性、炎性和/或增殖性疾病的药物组合物和方法。
背景技术：
病毒性、炎性和增殖性疾病的回顾
具有炎性、病毒性和/或增殖性成分的疾病和病症广为传播，影响着世界上数百万人。炎性、病毒性和/或增殖性疾病地选择性实例包括多发性硬化、糖尿病、再狭窄、癌症、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV/AIDS和生殖器疣。这些类型的疾病都具有共同的疾病过程，因此经常拥有或具有相关联的/共同的疗法。
病毒性疾病
病毒是很强的感染性病源体，它引发被入侵细胞的重要功能性改变，常导致细胞死亡。人们公认，病毒性疾病的细胞损伤不仅包括病毒增殖加害的直接损伤，还包括由病毒感染引起的各种免疫学反应。病毒性疾病的后果取决于数种病毒和宿主因素，例如感染的病毒颗粒的数量、病毒复制和传播的速度、对细胞功能的影响、宿主对细胞损伤的继发性反应以及宿主的免疫学和非特异性防御。通常，病毒性疾病的影响包括无症状性感染、急慢性临床疾病和各类癌症的诱发。公知的病毒性疾病的一个实例是病毒性肝炎感染，该感染导致慢性或急性肝脏炎症并且在某些情况下可导致肝细胞癌。至今，已经鉴别出数种类型的肝炎病毒，包括甲、乙、丙、丁、戊和庚(A、B、C、D、E和G)型肝炎病毒，这些病毒普遍存在于人群。例如，据国际肝脏基金会(the Liver Foundation International)估计，全世界有高于5亿2千万人患有乙型肝炎或丙型肝炎。
炎性疾病
炎性疾病是一类疾病和病症，它们以某些类型的细胞和介质的汇聚为特征，汇聚的存在可导致组织损伤，在某些时候还可导致死亡。炎性疾病引发已知的炎性级联反应，该反映是一种复杂过程，其包括引发免疫学反应，激活细胞释放趋化因子、细胞因子和毒性物质，上调细胞表面粘附分子和跨越内皮细胞的迁移。通常，炎性作为一种对付外来物质、细菌入侵宿主或对机械损伤、毒素和瘤形成的防御性反应而发生。内源性刺激的自身免疫反应也可引发炎性反应。
炎性疾病的一个实例是多发性硬化(“MS”)。MS是人中枢神经系统的多因素炎性疾病，该疾病导致沿神经的电传导变慢。据估计，在美国，每百万人中有接近三分之一的人患有MS。据认为，MS由围绕中枢神经系统的神经纤维的髓磷脂的炎症和分解所致。该疾病的特征为炎性细胞的浸润增加、少突胶质细胞减少和神经胶质过多症(星状胶质细胞过度生长和增殖)加重。(其综述参见，Amit等人，1999；Pouly等人，1999；Steinman等人，1993；Miller，1994)。
增殖性疾病
癌症是最公知的增殖性疾病。具体而言，癌症是通用术语，其代表了由调节细胞增殖、入侵和转移的关键性分子的突变引起的各类疾病的统称。肿瘤细胞进行转移的能力包括通过基因的过度生产或突变而失控，这种失控使细胞侵入原始组织之外，以接触依赖性方式存活，逃避免疫识别，驻扎在遥远的部位，然后入侵新组织的适当位置并在其中生长。一般认为与肿瘤发生、发展和转移有关的分子包括粘附分子、生长因子受体、调节细胞骨架的因子、调节细胞周期的主要转换器、增殖阻抑物基因、蛋白酶和转录因子。大多数肿瘤被杀灭的能力与其侵入并最终发生转移的能力直接相关。
病毒性、炎性和增殖性疾病具有共同的疾病过程
对于病毒性、炎性和增殖性疾病，都共同存在数种类型的分子和疾病过程。这些包括粘附分子、细胞因子和间质金属蛋白酶的表达增加，细胞增殖和迁移增加，炎性细胞的活动和浸润增加，血管生成增加以及组织破坏和机能不良性间质改造增加。结果，用于治疗这些疾病的化合物的目标都瞄准改变免疫系统、细胞增殖、细胞粘附和迁移、细胞因子水平或活性或者病毒复制。
干扰素
干扰素是多功能细胞因子，它们对细胞能产生多效(pleitrophic)作用，例如抑制病毒复制(抗病毒作用)、抑制细胞增殖(抗增殖作用)和抑制炎症(抗炎作用)。由于这些细胞对干扰素类物质的反应，已经发现α-干扰素和β-干扰素在临床上用于治疗病毒性、增殖性和炎性疾病，例如多发性硬化、乙/丙型肝炎和多种癌症。干扰素治疗还可用于治疗其它炎性疾病、病毒性疾病和增殖性疾病。
对于增进降低副作用的化合物的需求
虽然干扰素化合物已经或可用于治疗炎性、病毒性和增殖性疾病，但这些化合物具有许多副作用，这些副作用随剂量增加而加重。这些副作用包括局部注射反应、流感样综合征和抑郁。因此，某些患者不能忍受获得治疗效果所需的剂量。
此外，虽然许多抗病毒、抗炎或抗增殖化合物在体外对抗炎性、病毒性或增殖性疾病已经表现出前景，但在体内则需要很高的剂量；该剂量常常是毒性的或引起严重副作用。因此，在使用足够水平的化合物以获得最大功效、但不存在副作用时，这些疗法受到限制。
因此，需要可与抗病毒、抗增殖或抗炎化合物联合以提高治疗炎性、病毒性或增殖性疾病的效果的化合物。此外，还需要可降低剂量和/或减少给药频度以减小副作用、同时维持或改善疗效的化合物。
例如，可改善β-干扰素的MS治疗效果的化合物将潜在地降低β-干扰素给药的量和/或频度、减轻由β-干扰素产生的副作用并可减少MS患者中中和β-干扰素抗体反应的发生。
大约三分之一的使用β-干扰素治疗的MS患者中发生中和β-干扰素抗体的反应，这无疑与β-干扰素疗效的损失有关(Deisenhammer等人，1999)。
此外，所述化合物不仅会增强目前或潜在的抗病毒、抗增殖或抗炎治疗的效果，还将拓宽这些治疗在许多其它炎性、增殖性和病毒性疾病中的应用。
已经有关于试验抗炎剂联合治疗炎性疾病，例如多发性硬化的报道。但是，这些联合疗法产生有限的功效或者没有减轻副作用。例如，包括copaxone和α-干扰素的联合治疗没有提高用EAE治疗的小鼠的临床评分(Brod等人，2000)。抗增殖药诺消灵目前处于与β-干扰素的联合治疗临床试验之中，但诺消灵具有明显的副作用，包括严重的心脏毒性。由于累积剂量增高心脏病的危险性，因此诺消灵的应用受到限制。按照食品和药品管理局(the Food and Drug Administration)的规定，MS患者一般不应接受高于8-12剂量的诺消灵(服用2或3年)。
因此，需要开发治疗病毒性、炎性或增殖性疾病的方法，这些方法导致足够水平的抗病毒、抗炎和抗增殖化合物以获得最大功效，同时具有最小的副作用。需要开发用于治疗病毒性、炎性或增殖性疾病的抗病毒、抗炎和抗增殖联合疗法，其中的联合因素具有增进疗效、同时使副作用降至最小的作用。
维生素B12
维生素B12是含钴的B族维生素复合物，其对体内生物学过程具有多种作用。维生素B12具有一组易于阐明的类似物和共轭物。已知维生素B12化合物参与代谢过程；维生素B12的缺乏引起恶性贫血和神经障碍。它是导致DNA合成、细胞分化以及细胞代谢的代谢途径所必需的辅助因子。生化证据表明，维生素B12化合物可上调基因转录，由此上调蛋白质合成(Watanabe等人，1994)。另外认为，维生素B12化合物在免疫系统调节中起着重要作用(Tamura等人，1999，Sakane等人，1982)。
具体而言，据认为，维生素B12化合物本身具有某些或有限的抗病毒(Weinberg等人，1995，1998，Lott等人，2001，Poydock，1979，Tsao等人，1990)、抗增殖(Nishizawa等人，1997，Shimizu，1987，Poydock等人，1979，1985)和抗炎活性(美国专利5,508,271，美国专利5,964,224，美国专利5,716,941)。维生素B12还被尝试与其它治疗剂联合(欧洲专利0835660，美国专利6,096,737)治疗特定的炎性疾病或增殖性疾病。但至今没有科学证据表明维生素B12与干扰素化合物联合治疗病毒性、炎性或增殖性疾病的增效作用。
因此，本发明的目的是提供使用维生素B12类化合物与干扰素化合物联合治疗病毒性、炎性或增殖性疾病的方法。
发明概述
本发明包括用于治疗疾病的药物组合物，所述疾病选自病毒性疾病；增殖性疾病；炎性疾病；增殖性和炎性疾病；增殖性和病毒性疾病；病毒性和炎性疾病；以及增殖性、病毒性和炎性疾病；该组合物包含(1)至少一种维生素B12化合物；和(2)至少一种干扰素化合物。
本发明的另一个实施方案包括用于治疗增殖性疾病，例如癌症的药物组合物，该组合物包含至少一种维生素B12化合物和至少一种干扰素化合物。
本发明的另一个实施方案包括用于治疗病毒性疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹或者水泡性口炎的药物组合物，该组合物包含至少一种维生素B12化合物和至少一种干扰素化合物。
本发明的另一个实施方案包括用于治疗炎性疾病的药物组合物，该组合物包含至少一种维生素B12化合物和至少一种干扰素化合物。
本发明的另一个实施方案包括用于治疗星状细胞瘤和神经胶质瘤的药物组合物，该组合物包含至少一种维生素B12化合物和至少一种干扰素化合物。
本发明的另一实施方案包括用于治疗多发性硬化的药物组合物，该组合物包含至少一种维生素B12化合物和至少一种干扰素化合物，例如α-干扰素或β-干扰素。
本发明的另一方面是用于治疗乙型肝炎的药物组合物，该组合物包含维生素B12和α-干扰素或β-干扰素。
本发明的另一方面是用于治疗丙型肝炎的药物组合物，该组合物包含维生素B12和α-干扰素或β-干扰素。
依据上面所述任一方面，本发明另一方面是，其中维生素B12化合物与第二化合物轭合(conjugated)。
本发明的另一方面是治疗病毒性、增殖性或炎性疾病包括MS、乙型肝炎和丙型肝炎的方法，该方法包括给患者施用上述任一种药物组合物的步骤。
本发明另一方面是治疗病毒性、增殖性或炎性疾病包括MS、乙型用维生素B12化合物每日一次以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一次以上和每月一次；和以选自下列的频度施用第二化合物每日一次以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一次以上和每月一次。
本发明另一方面是治疗病毒性、增殖性或炎性疾病包括MS、乙型肝炎和丙型肝炎的方法，该方法包括给患者一起或单独施用一种或多种维生素B12化合物以及一种或多种干扰素化合物。
本发明包括任何上述的治疗方法，其中维生素B12化合物的剂量为10-2500mg，和/或干扰素化合物的剂量类似于或小于常用的干扰素治疗剂量。
本发明另一方面是上述复合物治疗病毒性、增殖性或炎性疾病的用途。
定义
描述本发明之前，首先对下文中将要用到的某些术语进行定义将有助于对本发明的理解。
“CFA”是指完全氟氏佐剂。
“DM20”是指同工蛋白质蛋白脂类蛋白质。它是中枢神经系统(CNS)的一种主要膜内在蛋白。DM20一般在生长的早期(出生后)阶段表达。
“EAE”或“实验性自身免疫性脑脊髓炎”是指小鼠模型，尤其是多发性硬化的免疫抑制性小鼠模型。
本文，例如“增强效果”中使用的“增强的”、“增进的”或“增强”是指增强疗效，包括协同作用。
“炎性疾病”是指一类多种多样的疾病和病症，它们具有下列任一特征引发炎性反应；上调任何的炎性级联反应；下调任何的炎性级联反应。炎性疾病包括糖尿病、动脉硬化、炎性主动脉瘤、再狭窄、缺血/再灌注损伤、肾小球肾炎、癌性结节病(sacoidosis cancer)、再狭窄、再灌注损伤、风湿热、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Reiter综合症、银屑病关节炎、强直性脊椎炎、髋关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、局限性肠炎、盆腔炎、多发性硬化、糖尿病、骨髓炎、粘连性关节囊炎、oligoarthritis、骨关节炎、关节周炎、多关节炎、银屑病、Still病、滑膜炎、阿耳茨海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化、骨质疏松症、炎性皮肤病和创伤愈合。单数形式的“炎性疾病”包括选自炎性疾病类的任意一种或多种疾病，并且包括任何混合的或复杂的疾病状态，其中的病态成分包括选自炎性疾病类的疾病。
“干扰素化合物”是指α-干扰素、α-干扰素类似物、α-干扰素衍生物、α-干扰素轭合物、β-干扰素、β-干扰素类似物、β-干扰素衍生物、β-干扰素轭合物及其混合物。α-干扰素和β-干扰素基因可通过例如指向突变的寡核苷酸改变，产生其β-干扰素类似物，例如人重组半胱氨酸缺失的或半胱氨酸置换的类似物。此外，一个以上氨基酸的识别或定位也可通过靶向突变而变化。蛋白质的基本氨基酸序列可通过糖基化或通过其它补充性分子，如脂类、磷酸和乙酰基来增长。此外，链中的单个氨基酸残基可通过氧化、还原或其它衍化作用进行修饰。α-干扰素或β-干扰素蛋白质可裂解获得保持活性的片断。整个蛋白质或其片断可与其它肽和蛋白质，例如免疫球蛋白和其它细胞因子融合。α-干扰素和β-干扰素轭合物可表示，例如包括与非天然存在的含聚亚烷基二醇部分的聚合物偶合的β-干扰素的组分。优选的干扰素化合物包括Roferon、Intron、Alferon、Infergen、Omniferon、Alfacon-1、α-干扰素、α-干扰素类似物、PEG化的α-干扰素、聚合的α-干扰素、二聚的α-干扰素、与载体轭合的α-干扰素、口腔吸入剂形式的α-干扰素、注射组合物形式的α-干扰素、局部组合物形式的α-干扰素、Roferon类似物、Intron类似物、Alferon类似物和Infergen类似物、Omniferon类似物、Alfacon-1类似物、β-干扰素、AvonexTM、BetaseronTM、BetaferonTM、RebifTM、β-干扰素类似物、PEG化的β-干扰素、聚合的β-干扰素、二聚的β-干扰素、与载体轭合的β-干扰素、口腔吸入剂形式的β-干扰素、注射组合物形式的β-干扰素、局部组合物形式的β-干扰素、AvonexTM类似物、BetaseronTM、BetaferonTM类似物和ReifTM类似物。或者，也可使用诱发α-干扰素或β-干扰素产生或者模拟α-干扰素或β-干扰素作用的物质。单数形式的“干扰素化合物”可以指干扰素化合物类的任何一种或多种化合物。
“MBP”是指髓磷脂碱蛋白。
“模拟肽”是指生物模拟针对激素、细胞因子、酶底物、病毒或其它生物分子的活性决定物的肽，它们可刺激、拮抗或调节天然配体的生理活性。
“ND4小鼠模型”是指通过用DM20的多发性拷贝转化的多发性硬化的转基因小鼠模型；多发性硬化的遗传性小鼠模型。
“PBS”或“磷酸盐缓冲盐水”是指用作阴性对照的注射液，它不具有任何生理或治疗作用。
“PLP”是指同工蛋白质蛋白脂类蛋白质。PLP在成人中占主导优势。
“增殖性疾病”是指一类变化多样的疾病和病症，它们的特征为细胞分化或增殖缺乏控制或控制很差。增殖性疾病包括肛门癌、胆管癌、结肠癌、食管癌、胆囊癌、胰腺癌、小肠癌、胃癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、妊娠期滋养层肿瘤、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、卵巢干细胞肿瘤、软组织肉瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓样白血病、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、咽下癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌、副甲状腺癌、唾液腺癌、脑肿瘤、神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、肾上腺皮质癌、脑垂体肿瘤、胰岛细胞癌、膀胱癌、肾癌、阴茎癌、维耳姆斯肿瘤、AIDS-有关的淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、尤因肉瘤、慢性骨髓性白血病、婴儿和儿童的血管瘤、瞳孔散大、多毛细胞白血病、卡波济肉瘤、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、恶性黑素瘤、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾细胞癌、成神经细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、多发性骨髓瘤、睾丸癌、眼癌、结肠直肠癌、口腔癌、直肠癌、前列腺癌、再狭窄、动脉硬化、增殖性糖尿病性视网膜病。单数形式的“增殖性疾病”包括选自增殖性疾病的任意一种或多种疾病，并且包括任何混合的或复杂的疾病状态，其中病态成分包括选自增殖性疾病类的疾病。
“PTX”或“百日咳毒素”是指由引起百日咳的微生物-百日咳博得特氏菌(Bordetella pertussis)的强毒株产生的主要蛋白毒素。PTX是一种有效引发巨噬细胞的辅剂，巨噬细胞常引发数种不同的自身免疫疾病，包括EAE。
“SJL/J”是指小鼠模型。具体而言，雌性SJL/J小鼠对于自身免疫疾病的发展具有增高的敏感性。SJL/J转基因小鼠种系容易引发EAE(与大多数其它小鼠种系相比，更易发展为EAE)。该小鼠中肿瘤发展以及自身免疫性可以由有效放大的免疫反应导致。
“协同”是指使用维生素B12与抗炎、抗增殖和/或抗病毒化合物的联合治疗的抗炎、抗增殖和/或抗病毒效果优于单独使用任何的这些治疗性化合物。协同作用可以通过类似的或不同的作用机制或途径发生。具有协同作用的联合疗法的一个优点是使用标准剂量产生的疗效优于单独服用任一种化合物的作用之和的预期效果；或者使用较低的剂量或减少给药治疗化合物的频度可获得较好的疗效。
“病毒性疾病”是指一类由病毒或者认为是由病毒引起的多种多样的疾病和病症。病毒性疾病的类型包括生殖器疣(HPV)、HIV/AIDS、疱疹、流行性感冒、麻疹、脊髓灰质炎、水痘-带状疱疹、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、脑膜炎、生殖器疣(HPV)、水泡性口炎病毒性感染和登革热。单数形式的“病毒性疾病”包括选自病毒性疾病类的任何一种或多种疾病，并且包括任何混合的或复杂的疾病状态，其中的病态成分包括选自病毒性疾病类的疾病。
“维生素B12类化合物”是指一类包括维生素B12及其类似物、衍生物或轭合物的化合物。维生素B12类化合物包括氰钴胺(CN-Cbl)、水钴胺、腺苷钴胺、甲钴胺、羟钴胺(HC)、氰钴维他命二苯脲和5-o-甲基苄基钴胺[(5-OmeB-za)CN-Cbl]以及所有上述化合物的脱二甲基、一乙基酰胺和甲基酰胺类似物。还包括钴胺的各种类似物和同系物，例如辅酶B12和5-脱氧腺苷钴胺。其它类似物包括氯钴胺、硫酸钴胺素、硝基钴胺素、氰硫基钴胺素、苯并咪唑衍生物，例如5，6-二氯苯并咪唑、5-羟基苯并咪唑、三甲基苯并咪唑，以及腺苷基氰钴胺[(Ade)CN-Cbl]、钴胺素内酯、钴胺素内酰胺和酰基苯胺、维生素B12或其类似物的乙基酰胺、一羧酸和二羧酸衍生物。优选的维生素B12衍生物包括维生素B12的一-、二-和三-羧酸衍生物或丙酰胺衍生物。此外，还包括与其它分子轭合的或包囊的这些类似物或维生素B12的聚合物的组分。单数形式的“维生素B12化合物”可以指维生素B12类化合物中的一种或多种化合物。
附图描述
附
图1显示了维生素B12、β-干扰素与联合的维生素B12和β-干扰素对ND4小鼠模型的临床评分的影响。
附图2显示了维生素B12、β-干扰素与联合的维生素B12和β-干扰素对EAE小鼠模型的临床评分的影响。
附图3显示了正常的、未处理的ND4动物、β-干扰素处理的ND4动物和β-干扰素/维生素B12处理的ND4动物的大脑切片中的GFAP染色。
发明详述
本发明公开了维生素B12化合物单独以及其与干扰素化合物联合用于治疗病毒性、炎性或增殖性疾病的效果。对于治疗病毒性、炎性和增殖性疾病，维生素B12化合物单独显示出治疗功效并且其与干扰素化合物联合清楚地显示出增效或协同作用。
药物组合物
本发明提供了用于增强抗病毒、抗增殖和抗炎效果的药物组合物，以及用于治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的药物组合物。药物组合物包含第一化合物和第二化合物，所述第一化合物是至少一种维生素B12化合物，第二化合物是干扰素化合物。
赋形剂
本发明的药物组合物优选包含适于使化合物或混合物可以以下列方式给药的可药用载体或赋形剂口服、鼻内或者经非胃肠途径(静脉内、真皮内、肌内或皮下)、直肠、经吸入或通过颊给药，或者经透皮方式。可将活性成分与任何常用的可药用载体或赋形剂混合或复合。本领域专业技术人员应该清楚，任何给药方式、常用的赋形剂或载体并且只要它们对于活性物质是惰性的，就可用于制备和施用本发明的药物组合物。例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，4th ed.(1970)中描述列举了这类方法、赋形剂和载体。已经接触了本发明原理的那些本领域专业技术人员将容易确定适合的和恰当的介质、赋形剂和载体或者将活性成分与它们复合形成本发明的药物组合物。
本发明的组合物还可以与优先靶向接受细胞的转运分子、单克隆抗体或转运形式，如囊或微胶粒共轭。
给药
所述剂量的本发明化合物以口服、鼻内或经吸入、腹膜内、皮下、肌内、透皮、舌下或静脉内方式给药。对于口服给药，本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法制成，例如片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂、咀嚼口胶等形式。此类治疗用组合物或制剂中的活性化合物的量是将获要得到适宜剂量的量。
在每种情形下，本发明的药物组合物中包括的化合物的治疗有效量取决于数种因素，例如被治疗患者的种类、大小和一般状况，预期的给药方式，患者接受预期剂型的能力，疾病发展的严重程度等。
对于每种干扰素化合物使用的剂量与本领域专业技术人员已知的以及临床前和临床研究中及商业应用中使用的那些剂量类似。由于这些化合物与维生素B12化合物的联合增强了这些化合物的疗效，因此浓度可低于一般使用的剂量。的确，维生素B12化合物与干扰素化合物联合给药的目的在于降低干扰素化合物的给药剂量，以获得有效的治疗，同时减轻干扰素化合物的副作用。
α-干扰素和β-干扰素的剂量是本领域已知的。例如，β-干扰素的剂量典型地是30μg-250μg。AvonexTM、BetaseronTM和RebifTM的主要区别是给定的β-干扰素的量、以及给药的途径和频率不同。AvonexTM优选以30μg剂量每周一次肌内注射给药；BetaseronTM优选以250μg的剂量隔天皮下注射给药；RebifTM优选以44μg的剂量每周三次皮下注射给药。在多发性硬化的治疗中，有数项临床研究都使用了高达9MIU的重组干扰素α-2a，隔天一次或每周三次(Durelli等人，1996，Nyland等人，1996)。用于丙型肝炎临床适应症的非PEG化的或PEG化的干扰素α-2a或2b的剂量一般为3MIU-10MIU，每周三次(对于非PEG化形式)和～70μg-180μg，每周一次(komanduri和Cotler，2002)。用于治疗增殖性疾病例如毛细胞白血病的干扰素剂量为1-36MIU，每日一次或每周两次。
对于本发明，维生素B12化合物的优选剂量是患者需要获得最佳增效作用的最大剂量，这种受到维生素B12剂量的绝对上限限制的最大剂量是患者可忍受并且不发展为严重并发症的最大剂量。维生素B12类化合物作为注射治疗恶性贫血的药物，已经使用了许多年，其典型的剂量为1000μcg。维生素B12类化合物作为一般口服的保健品也具有悠久的历史，其剂量也在“μcg”范围。羟钴胺，一种维生素B12化合物，作为氰化物中毒的解毒剂使用，被称为Cyanokit(美国专利5,834,448)。Cyanokit是一种应急的一次性给药5克剂量的羟钴胺，用于紧急情况。虽然维生素B12已被建议用于治疗性治疗数种炎性疾病，但没有人证实高剂量的B12与干扰素化合物联合将获得增强的治疗效果。经我们实验研究，没有发现对动物的毒性，即使是在小鼠中达15mg/kg维生素B12的浓度下。在先前的急性毒性研究中，在分别高达1g/kg和100mg/kg体重维生素B12(羟钴胺)的剂量下，在小鼠和兔子中均未观察到毒性(Mizoule，1966)。用于本发明的维生素B12化合物的剂量为每日10mg-2.5g。
本领域专业技术人员将清楚，按照本发明对患者施用的本发明组合物中各种成分的量将取决于上述的这些因素。
方法与使用
本发明提供了增进或增强干扰素化合物产生的抗病毒、抗增殖和抗炎作用的方法以及治疗患者的病毒性、增殖性或炎性疾病的方法，所述方法包括联合施用一定量的维生素B12化合物与干扰素化合物。维生素B12化合物可以与干扰素化合物同时、单独或联合地以不同剂量和给药途径治疗方案进行给药，以增强干扰素化合物治疗患者的病毒性、增殖性或炎性疾病的效果(与单独施用这些化合物时相比)。
第一种治疗方法是施用同时包括维生素B12化合物与干扰素化合物的药物组合物。另一种治疗方法包括施用包括维生素B12的药物组合物的步骤，然后是施用包括至少一种干扰素化合物的第二药物组合物的步骤。任选地，施用维生素B12化合物可在施用至少一种干扰素化合物之后进行。任选地，所述药物组合物的施用可单独或同时进行。
下面是可采用的治疗方案的实例
1.每日一次以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一
次以上或每月一次地联合施用维生素B12化合物的混合物与
干扰素化合物，用于病毒性、增殖性和炎性疾病的有效治疗；
2.每日一次以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一
次以上或每月一次地同时施用维生素B12化合物的混合物与
干扰素化合物，用于病毒性、增殖性和炎性疾病的有效治疗；
3.每日一次以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一
次以上或每月一次地用干扰素化合物进行治疗并且每日一次
以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一次以上或
每月一次地单独施用维生素B12类化合物；
4.每日一次以上、每日一次、每周一次以上、每周一次、每月一
次以上或每月一次地施用干扰素化合物与维生素B12类化合
物的混合物，以及每日一次以上、每日一次、每周一次以上、
每周一次、每月一次以上或每月一次地辅助施用维生素B12类
化合物。
本领域专业技术人员容易理解，本文描述的病原体或疾病状况是非限制性的。更为恰当地是，本发明化合物可用于治疗特征在于炎性、增殖性或病毒性反应的疾病。
实施例
下列实施例举例说明本发明的实施方案。
(A)证明维生素B12类化合物与基于干扰素的联合疗法的抗炎作用的
实施例
实施例1ND4小鼠模型中维生素B12、β-干扰素和联合的维生素B12与β-干扰素的作用
基本理论
将维生素B12和β-干扰素应用于脱髓鞘的转基因小鼠模型，来证明当维生素B12与干扰素联合用于治疗这类疾病时的协同作用(与单独使用干扰素或维生素B12的治疗进行比较)。
实验方案
使用ND4模型作为缓慢发展的脱髓鞘转基因小鼠模型，其中动物表现出约3月龄的年轻成年鼠的症状。在该模型中，临床表征的严重程度增加，到约6月龄时，表征最为严重，在约8-9月龄时，动物死亡。评价的临床表征包括全身震颤、癫痫发作、头部痉挛、后肢和尾巴的颤抖、摇晃的步态和跛行的尾部。对于每种临床表征采用零(不存在)至四级(时常的和不可控制的运动)的评分。
将小鼠(每组4只动物)单独用15mg/kg剂量的维生素B12(氰钴胺)进行治疗；每周一次并将其与干扰素β-1a(RebifTM)联合施用。以5000IU干扰素β-1a的剂量单独施用干扰素β-1a并将其与维生素B12联合施用，每周三次(tri-weekly)。当小鼠达3月龄时，开始所有的治疗，此时脱髓鞘疾病的症状已明显表现出来。处死时停止治疗。
结果与结论
使用β-干扰素或维生素B12治疗的ND4小鼠表现出炎性疾病MS的临床症状的减轻(附图1)，但与单独使用β-干扰素或维生素B12的治疗相比，β-干扰素与维生素B12的联合治疗在减轻该炎性疾病的临床症状方面具有协同作用。
实施例2EAE小鼠模型中维生素B12、β-干扰素和联合的维生素B12与β-干扰素的作用
基本理论
将维生素B12和β-干扰素用于自身免疫EAE模型，来证明当维生素B12与干扰素联合用于治疗这类疾病时的增效作用(与单独使用干扰素或维生素B12的治疗相比)。
实验方案
在7-8周龄雌性SJL小鼠中诱发实验性变应性脑脊髓炎(EAE)。在第1天，将每只小鼠的尾静脉内注射总体积为100μl的200ng百日咳毒素(PT)。48小时后，第二次注射200ngPT。用30.5标准规格的针头施行尾静脉注射。PT注射后是一次MBP/CFA(BectonDickinson)乳液注射。对每只小鼠在尾根处用27.5标准规格的针头皮下注射在50μl完全氟氏佐剂(CFA)中乳化的200μg/50μl的MBP。总注射体积为100μl。在第一次注射后每天观察小鼠并记录疾病的临床症状。这些包括摇摆的步态、震颤、尾部下垂、体重减轻等。从第7天开始，隔日评价临床评分，然后进行免疫。对动物治疗11天。
将小鼠(每组4只动物)单独用10mg/kg剂量的维生素B12(氰钴胺)进行治疗；每周一次并将其与干扰素β-1a联合施用。以5000IU干扰素β-1a的剂量单独施用干扰素β-1a(RebifTM)并将其与维生素B12联合施用，每日一次；在第一次免疫的当天开始，以分开注射的形式施用维生素B12与β-干扰素。处死时停止治疗。从免疫后第7天开始监测小鼠并对EAE临床症状以0-5级的分数进行打分。0表示没有症状，对濒死的动物给予5分。
结果与结论
单独使用β-干扰素治疗EAE小鼠表现出该炎性疾病的临床症状减轻(附图2)，但β-干扰素与维生素B12的联合治疗更有效地减轻了该炎性疾病的临床症状，表明β-干扰素与维生素B12的联合增强了β-干扰素的抗炎活性。
实施例3干扰素浓度对B12协同作用的影响
基本理论
将维生素B12(氰钴胺)和不同浓度的β-干扰素应用于上述的ND4转基因模型，来证明干扰素的浓度对B12协同作用的影响。
实验方案
将ND4小鼠不作处理(a)或者单独用干扰素β-1a(RebifTM)(5000IU)(b)或用1000IU干扰素β-1a和B12(15mg/kg)(c)，或者用2500单位的干扰素β-1a和B12(15mg/kg)(d)或用5000IU的干扰素β-1a和B12(15mg/kg)(e)进行处理，在实验期间每周治疗三次。处理在动物3月龄时开始并持续11周。一周对动物评价两次临床症状并以一周为基础计算平均分。对更进一步的实验细节，参见实施例1。
结果与结论
结果证明，联合治疗的有效性取决于β-干扰素的浓度，其临床评分显著降低(5000IU的β-干扰素浓度下)。因此，通过联合应用维生素B12和β-干扰素，需要较低水平的干扰素就可获得药理作用(表1)。
表1.β-干扰素浓度对维生素B12针对6月龄转基因小鼠的临床表征
和症状的协同作用的影响
处理 临床评分之和(+/-SD)
未处理的ND4 22+/-2
β-干扰素(5000IU) 21+/-4
β-干扰素(1000IU)+维生素B12(15mg/kg) 18+/-1
β-干扰素(2500IU)+维生素B12(15mg/kg) 16+/-1
β-干扰素(5000IU)+维生素B12(15mg/kg) 13+/-2
(B)证明结合了维生素B12类化合物的联合治疗的抗增殖作用的实施例
实施例4维生素B12、干扰素和联合的维生素B12与干扰素抑制体外细胞增殖的作用
基本理论
干扰素是报道用于有效治疗增殖性疾病例如卡波济肉瘤、黑素瘤、纤维肉瘤和高级星状细胞瘤(Fine等人，1997)的治疗剂。进行下列实验以测定维生素B12是否能增强干扰素对星状细胞瘤细胞系的抗增殖作用。
实验方案
将小鼠的腹水星状细胞瘤细胞接种到96孔培养板并使其在标准生长条件下生长至60％融合。处理之前，将细胞洗涤并用包含(a)单独的β-干扰素(500IU/ml)，(b)单独的维生素B12(甲钴胺)(25μg/ml)，或者(c)联合的β-干扰素(500IU/ml)与维生素B12(25μg/ml)的培养基置换培养基，并且培养过夜。
使用CellTiter96AQueous单溶液细胞增殖测定法(OneSolutionCell Proliferation Assay)作为测定增殖中存活细胞数量的比色法。如下进行细胞增殖测定将少量CellTiter 96AQueous OneSolution Reagent直接加到培养孔中，培养1-4小时后，用96孔培养板阅读器记录于490nm处的吸光度。本领域已知通过490nm吸光度的量测定的甲(formazan)产物的量与培养物中活细胞的数量成正比。
结果与结论
与未处理的细胞相比，单独使用小鼠β-干扰素或维生素B12(甲钴胺)处理导致增殖活性降低。但与单独使用维生素B12或β-干扰素的处理相比，当使用维生素B12和β-干扰素联合处理细胞时，抗增殖活性明显降低(下表2)。
表2.联合治疗对小鼠星状细胞瘤细胞系的细胞增殖的影响
处理 增殖活性的测定值
(490nm处的吸光度)
未处理 0.8955
用小鼠β-干扰素(500IU/ml)处理 0.3855
用维生素B12(25μg/ml)处理 0.2985
用小鼠β-干扰素(500IU/ml)和 0.1435
维生素B12(25μg/ml)处理
实施例5维生素B12、干扰素、联合的维生素B12与干扰素对星状细胞神经胶质过多的作用
基本理论
星状细胞神经胶质过多是指中枢神经系统中星状细胞的增高的反应性和增殖，据认为该病症在大脑损伤的发展中起着主要作用。具体而言，已经观察到星状细胞神经胶质过多在人脑和GFAP中的血原性转移，用于反应性星状细胞的蛋白质标记物也已被用作化学方法诱发的癌症的早期检测的生物医学标记物。下面同时使用ND4和EAE小鼠模型说明联合疗法对于星状细胞神经胶质过多的作用。ND4转基因小鼠正常发育到三个月，之后脱髓鞘逐渐发展。随着最初的脱髓鞘作用，星状细胞神经胶质增至大约三个月时正常水平的两倍，达到成年阶段的广泛的星状细胞神经胶质过多。同样，诱发EAE的小鼠也显示出证实的广泛的星状细胞神经胶质过多。
(a)ND4模型
实验方案
如前面实施例1所述处理ND4小鼠。在各种处理后，处死小鼠并取出脑组织切片进行GFAT染色并进行定量。与齿状回脑相邻的大脑海马区域用福尔马林固定，用石蜡包埋并以5μm切片。用使用抗GFAT抗体的免疫组织化学对GFAP进行染色。神经胶质原纤维酸性蛋白是一种星状细胞(特别是反应性星状细胞)表达的蛋白质，其被用作这些细胞的标记物。
此外，对正常的、未处理的ND4小鼠和处理过的ND4小鼠大脑中的GFAP进行定量提供了更精确的蛋白质表达水平。通过狭缝印迹测定全脑匀化物中的GFAP。在含50mM Tris-HCl(pH7.6)、0.5mM DTT、1mM EDTA和0.43mM PMSF的缓冲液中匀化脑组织。4℃下，将匀化物在11000rpm下离心30分钟。分离沉淀物并将其再悬浮于含10mM磷酸钠(pH7.5)、2mM DTT、6M脲和1mM EDTA的缓冲液中。真空下，将样品加载到狭缝印迹装置(BioDot，Biorad)中。该印迹与抗GFAP抗体反应，然后与次级抗体反应。使印迹呈色并定量各谱带的相对量。
结果与结论
与正常动物相比，未处理的ND4动物的GFAP染色明显增强(附图3)，这表明了广泛的星状细胞神经胶质过多。在β-干扰素处理的动物中，这种高水平的GFAP染色减弱。使用干扰素的处理略微减少了活化的纤维星状细胞的数量并降低了大脑匀化物中GFAP的水平。β-干扰素与维生素B12的处理抑制活化的星状细胞的水平和GFAP水平，使它们接近正常水平(表3)。这些数据清楚地表明，联合使用以协同方式作用的β-干扰素与维生素B12抑制星状细胞的增殖和活化。
表3.正常的、未处理的ND4动物、维生素B12-处理的、β-干扰素处
理的以及β-干扰素与维生素B12处理的ND4动物的大脑匀化物中GFAP
的相对量
处理 GFAP的相对量(+/-SD)
正常小鼠 1.0
未处理的ND4小鼠 4.4+/-0.2
维生素B12(15mg/kg)2.8+/-0.1
β-干扰素(5000lU/ml) 3.1+/-0.1
β-干扰素(5000IU/ml)+维生素B12(15mg/kg) 1.6+/-0.2
(b)EAE模型
实验方案
如前面实施例2所述处理EAE小鼠。在各种处理后，处死小鼠并取出脑组织切片进行GFAT染色并进行定量。与齿状回脑相邻的大脑海马区域用福尔马林固定，用石蜡包埋并以5μm切片。用使用抗GFAT抗体的免疫组织化学对GFAP进行染色。神经胶质原纤维酸性蛋白是一种星状细胞(特别是反应性星状细胞)表达的蛋白质，其被用作这些细胞的标记物。
此外，对正常的、未处理的EAE小鼠和处理过的EAE小鼠大脑中的GFAP进行定量提供了更精确的蛋白质表达水平。通过狭缝印迹测定全脑匀化物中的GFAP。在含50mM Tris-HCl(pH7.6)、0.5mM DTT、1mM EDTA和0.43mM PMSF的缓冲液中匀化脑组织。4℃下，将匀化物在11000rpm下离心30分钟。分离沉淀物并将其再悬浮于含10mM磷酸钠(pH7.5)、2mM DTT、6M脲和1mM EDTA的缓冲液中。真空下，将样品加载到狭缝印迹装置(BioDot，Biorad)中。该印迹与抗GFAP抗体反应，然后与次级抗体反应。使印迹呈色并定量各谱带的相对量。
结果与结论
使用维生素B12的处理没有降低GFAP的水平，但β-干扰素的处理可使GFAP的量降低～50％。但β-干扰素与维生素B12的处理是所有处理组中最有效的。这种联合治疗抑制活化的星状细胞的水平和GFAP水平，使它们接近正常水平(表4)。这些数据清楚地表明，联合使用以协同方式作用的β-干扰素与维生素B12抑制星状细胞的增殖和活化。
表4.正常的、未处理的EAE动物、维生素B12-处理的、β-干扰素处
理的以及β-干扰素与维生素B12处理的EAE动物的大脑匀化物中GFAP
的相对量
处理 GFAP的相对量(+/-SD)
正常小鼠 1.0
未处理的EAE小鼠 4.4+/-0.2
维生素B12(15mg/kg)4.2+/-0.2
β-干扰素(5000lU/ml) 2.0+/-0.5
β-干扰素(5000IU/ml)+维生素B12(15mg/kg) 1.4+/-0.2
(C)证明与维生素B12的联合疗法的抗病毒作用的实施例
实施例6证明干扰素化合物与维生素B12类化合物治疗人乙肝病毒(HBV)的增效作用的体外研究
基本理论
使用Hep G2.2.15作为HepG2细胞系，该细胞系是用HBV基因组稳定转染的并且持续将HBV病毒颗粒分泌到细胞生长介质中。该细胞系广泛地用于研究抗HBV感染的抗病毒剂的活性，并在该研究中用于评价维生素B12类化合物与干扰素对于治疗HBV感染的增效作用。使用干扰素作为抗病毒剂的实例，因为在临床上它被用于治疗乙型和丙型肝炎。
实验方案
将用HBV基因组稳定转染的细胞系-HepG2.2.15细胞在包含终浓度为2或4％的胎牛血清、但不加入抗生素的RPMI-1640中进行培养。将细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板上并使之生长过夜。然后弃去培养基并用100μl仅含羟钴胺(一种维生素B12)(不同浓度的)、仅含β-干扰素(不同国际单位的)以及含不同剂量的羟钴胺(HC)和相对于HC的不同剂量的β-干扰素的混合物的培养基替代。对于每种浓度测定三份样品。将细胞在37℃培养9天。每日更换药物/培养基。在第9天，捕获含释放的HBV病毒颗粒的培养基并用其提取HBVDNA。
按照制造商的说明，用QIAamp DNA迷你试剂盒-血液和血流旋转柱，从药物处理的HepG2.2.15细胞培养基中提取HBV DNA。概括地说，将10μl QIAGEN蛋白酶K加到1.5ml Eppendorf管中。将50μl细胞上清液和50μl AL缓冲液加到管中。将样品在56℃的水浴中保温3小时。保温结束时，将50μl乙醇加到样品中。将该混合物转移到QIAamp旋转柱并在14000rpm下离心1分钟。弃去滤液，然后向柱中加入50μl缓冲液AW1，并在14000rpm下离心1小时。洗涤和再次离心后，用50μl dH2O洗脱DNA。
通过实时PCR，使用Lightcycler测定法测定HBV DNA。反应在包含下列物质的20μl介质中进行6.4/4.8μl dH2O、2μl 25mMMgCl2、1μl 10M有义引物、1μl 10μM反义引物、8/1.6μlLightCycler Probe(荧光标记的，5μM)、0.8/1.6μl LightCyclerProbe2(LC Red 640-标记的，10μM)、2μl LC FastStart DNA MasterHyb Probes、1μl尿嘧啶DNA糖基酶。
将PCR混合物等分到毛细玻璃管中，然后将5μl DNA模板加到该PCR混合物中。使用不同的HBV质粒DNA(1×108、1×107、1×106、......、1×102、25份拷贝)作为定量分析的标准。循环条件如表4中所示。
表4.用于Lightcycler测定的循环条件
程序#循环 目标温度保温时间 温度变化 获得模式
变性1 95℃9分钟 20℃/秒无
PCR 4595℃5秒20℃/秒无
54℃10秒 20℃/秒单一
72℃17秒 20℃/秒无
Melt1 98℃0秒20℃/秒无
45℃15秒 20℃ /秒 无
70℃0秒0.2℃/秒 连续
Cool1 40℃30秒 20℃/秒无
用DNA拷贝数作为终点计算试验化合物的抗病毒作用。具体而言，根据下式计算抗病毒活性
抗病毒作用＝(C对照-C试验)/C对照，其中C对照是对照孔(没有药物)中的HBV DNA拷贝数；C试验是具有给定浓度的试验化合物的试验孔中HBV DNA拷贝数。
通过计算机软件CalcuSyn(Biosoft，St Louis)，使用中值效应方程(median effect equation，Chou和Talalay，1984)以数学方法计算增效或协同作用。下表5说明了联合指数(CI)的范围。
表5.联合指数与协同作用程度之间的关系
结果与结论
表6.使用Lightcycler测定法，通过HBV DNA拷贝测定试验化合物
单独或联合对HBV的抗病毒作用
浓度(μg/ml) 01 10 100 500
HC 00.001 0.0010.0010.112
浓度(IU/ml)050 100 500 1000
β-干扰素 00.569 0.7460.7730.823
浓度(μg/ml)/(IU/ml) 01/5010/100 100/500 500/1000
HC/β-干扰素 00.571 0.7720.9120.851
表7.羟钴胺(HC)与β-干扰素的联合对HBV的CI值
HC(μg/ml) β-干扰素(IU/ml) CI
1501.908
10 100 0.258
100 500 0.051
500 1000 0.572
当细胞用β-干扰素，但不用维生素B12进行处理时，病毒活性降低。与单独使用这些化合物相比，维生素B12与β-干扰素的联合治疗更有效地降低病毒活性。当维生素B12与干扰素联合治疗乙型肝炎感染时存在增效作用。细节参见表6。
具体而言，在高于10μg/ml的HC和100IU/ml的β-干扰素的浓度下分别测定到HC对于β-干扰素对抗HBV的强增效和中等增效作用。根据联合指数分析结果，β-干扰素与维生素B12具有协同抗病毒作用。上表7概括了该结果。
实施例7证明干扰素与维生素B12对2型单纯性疱疹病毒(HSV-2)和水泡性口炎病毒(VSV)的抗病毒活性的增效作用的体外研究
基本理论
MRC-5(人纤维原细胞)是HSV和VSV敏感细胞系，它们被广泛地用于研究抗病毒剂对抗VSV和HSV感染的活性。在该研究中使用这种细胞系评价维生素B12化合物与α-干扰素和β-干扰素对于治疗VSV和HSV的增效作用。
实验方案
进行CPE(致细胞病变效应)抑制分析。该分析测定了药物或物质使细胞免受病毒融解的能力。概括地说，将96孔培养板中的融合的MRC-5细胞与不同浓度的单独的羟钴胺(HC)、单独的α-干扰素、单独的β-干扰素以及不同剂量的HC和不同剂量的α-干扰素或β-干扰素的混合物一起培养。HC的试验浓度为0、1、10、100、500和1000μg/ml，α-干扰素和β-干扰素的试验浓度为0、5、10、50、100和500IU/ml。对于每种浓度，都在96孔培养板中测试三份样品。MRC-5细胞的培养基是由ATCC建议的(含2mM L-谷氨酰胺的Eagle极限必需培养基和调整的Earle′s BSS，其中包含1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠、10％胎牛血清)。
培养过夜后，在37℃下，将细胞用moi(感染复数)为0.5pfu/细胞的VSV或moi为0.2pfu/细胞的HSV-2感染1小时。然后除去病毒接种物，将感染的细胞用PBS细胞洗涤，并在37℃下用不含或含有如上的浓度逐渐增高的试验化合物的培养基覆盖2-3天，直至对照孔的CPE为100％。采用中性红摄取分析法测定免受CPE的细胞。具体而言，用泵从96孔培养板中取出细胞。然后将细胞用200μl PBS洗涤一次。随后将100μl 0.01％的中性红(PBS中的)加到每个孔中并在37℃保温30分钟。然后取出染料并将细胞洗涤两次，每孔每次用200μlPBS进行洗涤。将100μl 50％乙醇/1％冰醋酸的PBS溶液加到每孔中并在室温下培养15分钟，同时以120-150rpm速率轻轻振摇。在ELISA阅读器上读取550nm处的吸光度。
根据下式计算抗病毒作用
抗病毒作用＝(OD试验-OD0)/(OD对照-OD0)，其中OD试验是在给定浓度的试验化合物下测定的光学密度；OD0是在药物浓度为零时测定的光学密度；OD对照是未感染细胞的光学密度。
通过计算机程序CalcuSyn(Biosoft，St Louis)采用中值效应方程式(Chou和Talalay，1984)以数学方法计算增效作用。获得的联合指数与协同作用程度之间的关系参见表5。
结果与结论
(a)HSV-2感染
与单独使用这些化合物时相比，维生素B12与α-干扰素或β-干扰素的联合治疗更有效地降低病毒活性(表8)。当维生素B12与干扰素(一种抗病毒剂)联合时，对单纯性疱疹病毒感染的治疗具有增效作用。具体而言，当HC和α-干扰素的浓度分别高于10μg/ml和10IU/ml时，观察到了HC对α-干扰素抗HSV-2活性的强增效作用。在所有的试验浓度下，都观察到了HC对β-干扰素抗HSV-2活性的较强的和中等的增效作用。根据对联合指数分析的结果，α-干扰素或β-干扰素与维生素B12具有协同抗病毒作用(表9)。
表8.通过CPE抑制分析测定试验化合物单独和联合给药对HSV-2的
抗病毒作用
浓度(μg/ml) 01 10 100 500 1000
HC 00.014 0.0320.0560.1660.210
浓度(IU/ml) 05 10 50 100 500
α-干扰素00.093 0.1390.2180.2820.271
β-干扰素00.164 0.1360.3140.2810.265
浓度 01/5 10/10100/50 500/100 1000/500
(μg/ml)(IU/ml)
HC/α-干扰素 00.090 0.2570.3420.7240.999
HC/β-干扰素 00.169 0.3150.3680.6830.748
表9.HC与α-干扰素或β-干扰素联合给药对于HSV-2的CI值
HCα-干扰素CI HC β-干扰素 CI
(μg/ml) (IU/ml) (IU/ml)
1 5 2.29215 0.746
1010 0.07 10 5 0.026
100 50 0.117100 50 0.065
500 1000.009500 1000.012
1000 500＜0.01 1000 5000.013
(b)VSV感染
当细胞用维生素B12或α-干扰素或β-干扰素处理时，抗病毒活性(由免受CPE所反映的)明显增强。与单独使用这些化合物时相比，维生素B12与α-干扰素或β-干扰素的联合治疗更有效地减弱了病毒活性。参见表10。维生素B12与干扰素(一种抗病毒剂)联合给药时，对水泡性病毒性口炎感染的治疗具有增效作用。具体而言，在所有的试验浓度下，都观察到了HC对β-干扰素抗HSV活性的强增效作用，当HC和α-干扰素的浓度分别高于100μg/ml和50IU/ml时，观察到了HC对α-干扰素活性的强增效作用。根据对联合指数分析的结果，α-干扰素或β-干扰素与维生素B12具有协同抗病毒作用(表11)。
表10.通过CPE抑制分析测定试验化合物单独和联合给药对VSV的抗
病毒作用
浓度(μg/ml)01101005001000
HC 00.0010.001 0.039 0.001 0.002
浓度(IU/ml) 051050 100500
α-干扰素 00.2960.387 0.950 0.996 0.942
β-干扰素 00.8260.985 0.758 0.768 0.956
浓度01/5 10/10 100/50 500/1001000/500
(μg/ml)/(IU/ml)
HC/α-干扰素00.2990.450 0.999 0.999 0.999
HC/β-干扰素00.9990.999 0.999 0.999 0.999
表11.HC与α-干扰素或β-干扰素联合给药对VSV的CI值
HC α-干扰素 CI HCβ-干扰素 CI
(μg/ml)(IU/ml) (IU/ml)
1 5 1.61 50 0
10 10 1.766 1050 0
100 50 0.013 100 50 0.002
500 1000.027 500 1000.004
10005000.016 1000 5000.021
实施例小结
总之，这些实施例清楚地证明了维生素B12化合物与干扰素化合物联合治疗能有效地治疗炎性、增殖性和/或病毒性疾病，并且B12增强干扰素对抗所述疾病的效果。
虽然用优选的实施方案描述了本发明，但可以进行修饰对于本领域专业技术人员来说是显而易见的。这种修饰和改变应认为是在本领域的权限和范围之内。
参考文献
Amit B，Olivera E，Anderson D和Hafler D.多发性硬化的分子致病机理(1999).Journal of Neuroimmunology 100252-259.Brod SA，Lindsey JW和Wolinsky JS.格拉太咪尔乙酸盐(共聚物-1和I型干扰素(α-干扰素)联合治疗不改善实验性自身免疫脑脊髓炎(2000).Annals of Neurology 47(1)127-131
Chou TC和Talalay P.剂量-作用关系的定量分析多种药物或酶抑制剂的联合作用(1984).Advances in Enzyme Regulation 2227-55Deisenhammer F，Reindl M，Harvey J，Gasse T，Dilitz E和BergerT.干扰素β-1b在具有或不具有中和抗体的MS患者中的生物利用度(1999).Neurology 52(6)1239-43
Durelli L，Bongioanni MR，Ferrero B，Imperiale D，Verdun E，Oggero A，Gentile E，Bradac GB，Bergui M，Bergamini L和Bergamasco B.长期重组α-干扰素治疗MS-副作用的特殊强调。(1996)Multiple Sclerosis 1(6)366-71
Fine HA，Wen PY，Robertson M，O′Neill A，Kowal J，Loeffler JS和Black，PM.新的重组人β-干扰素(BG9015)治疗复发性神经胶质瘤患者的I期临床试验(1997).Clinical Cancer Research 3(3)381-7
Hall A和Rumack B.作为氰化物解毒剂的羟钴胺/硫代硫酸钠(1987).Journal of Emergency Medicine 5(2)115-121.
Komanduri，S和Cotler，SJ.Hepatitis C.(2002).ClinicalPerspectives in Gestronenterology.March/April 2002 issuep91-99.
Miller DH.监测多发性硬化治疗的核磁共振(1994).Annals ofNeurology 36SupplS91-4.
Mizoule J.Etude de l′Action de l′Hydroxocobalamine a l′Egardde l′Intoxication Cyanhydrique[论文].(1966).FacultedePharmacie de l′Universite de Paris，pp.1-178.被引用于Hall和Rumack.，1987.
Nishizawa Y，Yamamoto T，Terada N，Fushiki S，Matsumoto K和Nishizawa Y.甲钴胺对于培养基中和体内的雄激素敏感性或雌激素敏感性恶性细胞的增殖的作用(1997).International Journal ofVitamin Nutrition Research 67 (3)164-170
Nyland H，Myhr KM，Lillas F，Smievoll AI，Riise T，NortvedtM和Nilsen R.使用重组人干扰素α-2a治疗复发性弛张性多发性硬化在挪威的随机、安慰剂对照、双盲试验。(1996)MultipleSclerosis 1(6)372-5
Pouly S和Antel JP.多发性硬化与中枢神经系统的脱髓鞘作用(1999).Journal of Autoimmunity 13297-306.
Poydock M.维生素C和B12对于腹水肿瘤的有丝分裂活性的影响(1979).Experimental and Cellular Biology 47210-217.
Poydock ME，Harguindey S，Hart T，Takita H和Kelly D.联合使用脱氢抗坏血酸与羟钴胺对于携带L1210白血病小鼠的有丝分裂抑制和存活影响(1985).American Journal of Clinical Oncology 8(3)266-269.
Lott VVB，Takyar SS，Tuppen J，Crawford DH，Harrison M，SlootsTP和Gowans EJ.维生素B12与丙型肝炎分子生物学与人类病理学(2001).Proceedings of National Academy of Sciences 98(9)4916-4921
Sakane T，Takada S，Kotani H和Tsunematsu T.甲基-B12对人T淋巴细胞的体外免疫功能的影响(1982).Journal of ClinicalImmunology 2(2)101-109
Shimizu N，Hamazoe R，Kanayama H，Maeta M和Koga S.甲基-B12的抗肿瘤作用的实验研究(1987).Oncology 44(3)169-173Steinman L，Lindsey JW，Alters S和Hodgkinson S.从实验性变应性脑脊髓炎的治疗到多发性硬化的临床试验(1993).ImmunologySeries 59253-60
Tamura J，Kubota K，Murakami H，Sawamura M，Matsushima T，Tamura T，Saitoh T，Kurabayshi H和Naruse T.维生素B12的免疫调节作用使用甲基-B12治疗的维生素B12缺乏患者中的CD8+T淋巴细胞与自然杀伤(NK)细胞活性(1999).Clinical andExperimental Immunology 116(1)28-32
Tsao C，Miyashita K和Young M.培养的恶性和非恶性细胞中钴胺的细胞毒活性(1990)Pathobiology 58292-296.
Watanabe T，Kaji R，Oka N，Bara W和Kimura J.超高剂量甲钴胺促进实验性丙烯酰胺神经病的神经再生(1994)Journal ofNeurological Sciences 122(2)140-143.
Weinberg JB，Sauls DL，Misukonis MA和Shugars DC.钴胺类对生产性人免疫缺陷性病毒-1感染的抑制作用(1995).Blood.86(4)1281-1287
Weinberg JB，Shugars DC，Sherman PA，Sauls DL和Fyfe JA.钴胺对HIV-1整合酶及HIV-1 DNA整合到细胞DNA中的抑制(1998).Biochemical Biophysical Research Communications 246(2)393-39权利要求
1.一种治疗疾病的药物组合物，所述疾病选自病毒性疾病；增殖性疾病；炎性疾病；增殖性和炎性疾病；增殖性和病毒性疾病；病毒性和炎性疾病；以及增殖性、病毒性和炎性疾病；该组合物包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
2.一种治疗增殖性疾病的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
3.一种治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
4.一种治疗炎性疾病的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
5.一种治疗多发性硬化的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
6.一种治疗选自乙型肝炎、丙型肝炎、2型单纯性疱疹病毒和水泡性口炎病毒的病毒的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
7.一种治疗癌症的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
8.一种治疗星状细胞瘤和神经胶质瘤的药物组合物，其包含
(i)至少一种维生素B12化合物；和
(ii)至少一种干扰素化合物。
9.一种治疗多发性硬化的药物组合物，其包含
(i)维生素B12；和
(ii)β-干扰素。
10.一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其包含
(i)维生素B12；和
(ii)β-干扰素。
11.一种治疗丙型肝炎的药物组合物，其包含
(i)维生素B12；和
(ii)β-干扰素。
12.一种治疗多发性硬化的药物组合物，其包含
(i)维生素B12；和
(ii)α-干扰素。
13.一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其包含
(i)维生素B12；和
(ii)α-干扰素。
14.一种治疗丙型肝炎的药物组合物，其包含
(i)维生素B12；和
(ii)α-干扰素。
15.权利要求1-14任一项的药物组合物，其中第一化合物与第二化合物轭合。
16.一种治疗选自病毒性、增殖性和炎性疾病的疾病的方法，包括给患者施用权利要求1-15任一项的药物组合物的步骤。
17.一种治疗多发性硬化的方法，包括给患者施用权利要求1、4、5、9、12、15、16任一项的药物组合物的步骤。
18.一种治疗乙型肝炎的方法，包括给患者施用权利要求1、3、6、10、13、15、16任一项的药物组合物的步骤。
19.一种治疗丙型肝炎的方法，包括给患者施用权利要求1、3、6、11、14、15、16任一项的药物组合物的步骤。
20.一种选自治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的疾病的方法，包括给患者一起或分开施用下列化合物的步骤
(a)至少一种维生素B12化合物；和
(b)至少一种干扰素化合物。
21.一种治疗多发性硬化的方法，包括给患者一起或分开施用下列化合物的步骤
(a)至少一种维生素B12化合物；和
(b)至少一种干扰素化合物。
22.一种治疗多发性硬化的方法，包括给患者一起或分开施用下列化合物的步骤
(a)维生素B12；和
(b)β-干扰素。
23.权利要求16-21任一项的方法，其中维生素B12化合物的剂量为10-2500mg。
24.权利要求22的方法，其中维生素B12化合物的剂量为10-2500mg。
25.权利要求16-22任一项的方法，其中干扰素化合物的剂量等于所述干扰素化合物单独施用时的治疗剂量范围。
26.权利要求16-22任一项的方法，其中干扰素化合物的剂量低于所述干扰素化合物单独施用时的治疗剂量范围。
27.权利要求1-15任一项的化合物治疗病毒性、增殖性或炎性疾病的用途。
全文摘要
本发明公开了治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的药物组合物，其包含与干扰素化合物联合的一定量的可药用维生素B12化合物。维生素B12化合物与干扰素化合物可单独、同时或联合使用，以增强治疗病毒性、增殖性和炎性疾病的效果。
文档编号A61P29/00GK1541105SQ0281569
公开日2004年10月27日 申请日期2002年6月11日 优先权日2001年6月11日
发明者T·克鲁兹, A·帕斯特拉克, T 克鲁兹, 固乩 申请人:转新疗法公司