专利名称：一种松材线虫m型和r型株系的pcr-rflp鉴别方法
技术领域：
本发明涉及松材线虫的PCR-RFLP鉴别技术；具体涉及一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法。
背景技术：
松材线虫Bursaphelenchus xylophilus是世界各国关注的重要危险性线虫，是松林的“头号杀手”，目前中国、韩国、欧盟、澳大利亚、新西兰等许多国家都将松材线虫列为检疫对象。拟松材线虫B. mucronatus与松材线虫十分相似，主要形态区别是一般认为雌虫尾端指状，尾尖突长达3.5μπι以上的为拟松材线虫；雌虫尾端宽圆，无尾尖突或尾端指状， 尾尖突长Ιμπι左右(不超过2μπι)的为松材线虫。1983年，Wingfield等报道从美国明尼苏达和威斯康辛州的冷杉中发现松材线虫M型株系(mucronate form of B. xylophilus), 其雌虫有明显的尾尖突，形态特征更接近拟松材线虫。目前研究表明松材线虫种内可分为 M型株系和R型株系(round-tailed form of B. xylophilus) ；R型株系群体内总有一些雌虫尾部钝圆，无尾尖突；而M型株系群体内所有雌虫均有明显的尾尖突，与拟松材线虫很难区分。如果单纯使用形态学鉴定方法，松材线虫M型株系很可能被鉴定为拟松材线虫，导致漏检，从而可能导致松材线虫的传播与扩散，对林业生产造成巨大威胁。PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)鉴定技术是利用生物体内线粒体、核糖体等标记基因特征进行分子生物学区分，如斑潜蝇和巨蛎属牡蛎PCR-RFLP鉴别技术。而线虫核糖体DNA内部转录间隔区 (ITS)序列进化速率较快，已用于线虫种及种内分类鉴别研究，目前公开的松材线虫及其近似种的PCR-RFLP鉴别，是选用Rsa I、Hae III、Msp I、HinfI和Alu I这5种限制性内切酶酶切，虽然能区分松材线虫和拟松材线虫，但不能区分松材线虫M型和R型株系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能区分鉴别松材线虫M型和R型株系的 PCR-RFLP鉴别方法，为检疫鉴定及处理提供了保障。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种松材线虫M型和R型株系的 PCR-RFLP鉴别方法，通过对大量不同来源松材线虫和拟松材线虫株系的ITS区序列测定， 通过DNAstar中的MapDraw软件分析，通过大量的对比试验，选取出区对松材线虫株系区分明显的限制性内切酶组合；随后进行线虫基因组DNA提取和目的片段的PCR扩增，最后利用选取的内切酶对PCR产物进行酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，其特征在于包括下述步骤a、DNA提取将单条松材线虫挑入含有1 μ 1 10XPCR Buffer溶液(购自TaKaRa 公司)的PCR管中，先13000rpm离心lmin，再置于液氮中速冷lmin，取出后立即在85°C条件下恒温2min，再立即将PCR管的温度速降至56°C，恒温30sec，在PCR管中加入浓度为Img/ mL的蛋白酶K溶液1 μ 1 (购自TaKaRa公司)，PCR管先在56°C下恒温15min，再在95°C条件下恒温lOmin，得到DNA提取液，-20°C保存备用；PCR Buffer溶液(Mg2+free)包括pH8. 3 的 Tris-HCl 溶液 lOOmM，KCl 溶液 500mM ；
b、PCR扩增PCR扩增为50 μ 1反应体系，包含10XPCR buffer溶液缓冲液5 μ 1、 浓度为50mmol/L的MgCl2溶液5 μ 1、浓度为10mmol/L的dNTP溶液4 μ 1 (购自TaKaRa公司)、浓度为40 μ mol/L的上游引物3 μ 1、浓度为40 μ mol/L的下游引物3 μ 1、上述DNA提取液10 μ l、ddH2019. 4 μ 1和Taq聚合酶0. 6U (购自TaKafci公司)；扩增反应条件为94°C 预变性:3min ；94°C变性40S，55°C退火50S，72°C延伸2min，共35个循环；最后一个循环结束后，72°C延伸lOmin，得到PCR产物；所述上游引物为通用引物5' -CGT AAC AAG GTAGCT GTA G-3'，下游引物为通用引物5' -TTT CAC TCG CCG TTA CTAAGG-3'；C、酶切反应将上述PCR产物6μ 1U0XPCR Buffer溶液1 μ 1、去离子水2. 5 μ 1、 HhaI酶0. 5 μ 1 (购自TaKaRa公司)置于PCR管中，放入PCR仪，37°C保温条件下酶切反应池，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP带谱；d、带谱鉴别上述PCR-RFLP带谱中若最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系 II，若最大条带为357bp或35^ρ，则用Hpyl88I酶(购自TaKaRa公司)替换HhaI酶再重复上述酶切反应，若PCR-RFLP带谱中最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I，带谱中最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系。与现有技术相比，本发明的优点在于一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，通过DNA提取、PCR扩增、HhaI酶或和Hpyl88I酶酶切反应及带谱鉴别，若HhaI酶酶切反应获得PCR-RFLP带谱最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，最大条带为357bp 或358bp，则再用HpylSSI酶酶切反应，若带谱最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I ； 若带谱最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系；这样就能很明显区分松材线虫 M型株系和松材线虫R型株系，为检疫鉴定及处理提供了保障。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1、DNA提取在灭菌的洁净载玻片上加适量灭菌的双蒸水，用灭菌的0号针将单条松材线虫(分别为M型株系I、II和R型株系I、II)挑入水滴中，再将松材线虫挑入内含 8μ1 双蒸水和 Ιμ 10 X PCRBuffer 灭菌的 200 μ 1 PCR 管中，13000rpm 离心 lmin，然后置于液氮中速冷lmin，取出，立即在85°C下恒温放置2min，迅速降温至56°C ；然后向PCR 管中加入浓度为lmg/mL的蛋白酶K溶液1μ 1，PCR管在56°C下恒温15min，再在95°C恒温 lOmin，得到DNA提取液；2、PCR扩增采用50 μ 1反应体系，上游引物为5' -CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3‘，下游引物为5 ‘ -TTT CAC TCG CCG TTACTAAGG-3 ‘(上下游引物购自TaKaRa公司)， 扩增反应体系为10XPCR-buffer溶液5 μ 1、浓度为50mmol/L的MgCl2溶液5 μ 1、浓度为 IOmmol/L的dNTP溶液4 μ 1、浓度为40 μ mol/L的上游引物3 μ 1、浓度为40 μ mol/L的下游引物3 μ 1、上述DNA提取液10 μ 1、ddH2019. 4 μ 1和Taq聚合酶0. 6U ；扩增反应条件为 94°C预变性:3min ；94°C变性40S，55°C退火50S，72°C延伸2min，共35个循环；最后一个循环结束后，72°C延伸IOmin ；获得的PCR产物，松材线虫的片段长度为920bp_930bp ；3、酶切反应将上述PCR产物6μ 1U0XPCR Buffer溶液1 μ 1、去离子水2. 5 μ 1 置于 PCR 管中共 7 管，分别用 0. 5μ 1 Rsa I、HaeIII、Msp I、HinfI、Alu I、HhaI 和 Hpyl88ICN 102229993 A
说明书
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酶酶切，放入PCR仪，37°C保温条件下酶切反应池，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP带谱，琼脂糖凝胶电泳条件10μ 1酶解液与2 μ 1的6Χ上样缓冲液混勻，上样2. 5%琼脂糖凝胶中，于75V稳压下电泳，电泳缓冲液为1 ΧΤΑΕ，电泳时间约为2. 5h(2-3h)，电泳结束后，于0. 的EB溶液中染色10-15min，之后在紫外灯下观察、拍照。4、带谱鉴别如表1所示，若未知为松材线虫或判断不清，应首先观察Rsa I、 HaeIIKMsp I、HinfI和Alu I的酶切带谱，是否与表1中一致，以确定为松材线虫。再看HhaI酶切带谱和HpylSSI酶酶切带谱，HhaI酶切带谱若最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II ；若最大条带为357bp或358bp，可以初步鉴别当200bp(201bp)与 357bp (358bp)之间有223bp或的条带，则为R型株系(其中有的条带为R型株系I，有22!3bp的条带为R型株系II)；当200bp(201bp)与357bp (358bp)之间无任何条带，则为M型株系I。为了准确鉴别，再观察HpylSSI酶酶切带谱，若最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I，其带谱为492bp+252bp+l 10bp+72bp ；若最大条带为743bp或741bp， 则为松材线虫R型株系，其中带谱为74;3bp+110bp+72bp是松材线虫R型株系I，带谱为 741bp+110bp+71bp是松材线虫R型株系II，这样松材线虫M型株系与R型株系的最大条带差异较大，区分明显，不会出现混同现象，达到准确鉴别目的。而从表1中可以看出Rsa I、 Haelll.MspI,Hinfl.Alu I酶酶切带谱中松材线虫M型株系和松材线虫R型株系之间差异极小，无法鉴别M型和R型株系，因此本发明的方法能准确鉴别松材线虫M型株系和R型株系。表1松材线虫M型和R型株系各限制性内切酶酶切带谱对比表(bp)
Rsa IHaelllMsp IΗ ηΓ IAlu IHha IHpyl88iR型株系 I483+420+ 22728+197562+363263+232+ 142+139+ 125+24433-256+ 142-96357+262+ 200+106743+110+ 72R型株系 II483+417+ 22725+197562+360263+232+ 141+139+ 122+25432-238+ 143-96+13357+223+ 200+107+ 35741+110+ 71M型株系 I486+417+ 23728+198566+360266+232+ 142+138+ 123+25437-237+ 142-96+14358+200+ 140+121+ 107492+252+ 110+72M型株系 II484+420+ 22728+198563+363263+232+ 142+139+ 125+25433-241+ 143-96+13467+258+ 201744+110+ 72 总之在实际检测中，若未知是松材线虫还是拟松材线虫等，就可以先用形态学或 RsaI,HaeIIKMsp I.Hinf I、Alu I等酶先鉴别是不是松材线虫，再用本发明的方法鉴别是不是松材线虫M型或R型株系，若已知是松材线虫，就用本发明的方法直接鉴别株系。
权利要求
1. 一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，其特征在于包括下述步骤 a、DNA提取将单条松材线虫挑入含有1μ 1 10XPCR Buffer溶液的PCR管中，先13000 rpm离心1 min，再置于液氮中速冷1 min，取出后立即在85°C条件下恒温2 min，再立即将 PCR管的温度速降至56°C，恒温30 sec，在PCR管中加入浓度为1 mg/mL的蛋白酶K溶液 1μ 1，PCR管先在56°C下恒温15 min，再在95°C条件下恒温10 min，得到DNA提取液，_20°C 保存备用；b、PCR扩增PCR扩增为50 μ 1反应体系，包含10XPCR buffer溶液缓冲液5 μ 1、 浓度为50 mmol/L的MgCl2溶液5μ 1、浓度为10 mmol/L的dNTP溶液4 μ 1、浓度为40 μ mol/L的上游引物3 μ 1、浓度为40 μ mol/L的下游引物3 μ 1、上述DNA提取液10 μ 1、 ddH2019. 4 μ 1和Taq聚合酶0. 6 U ；扩增反应条件为94°C预变性3 min ；94°C变性40 S， 55°C退火50 S，72°C延伸2 min，共；35个循环；最后一个循环结束后，72°C延伸10 min，得到PCR产物；所述上游引物为通用引物5'- CGT AAC AAG GTA GCT GTA G _3'，下游引物为通用引物5' - TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG -3，；c、酶切反应将上述PCR产物6μ 1、10XPCR Buffer溶液1 μ 1、去离子水2. 5 μ 1、猫aI 酶0. 5 μ 1置于PCR管中，放入PCR仪，37°C保温条件下酶切反应3 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP带谱；d、带谱鉴别上述PCR-RFLP带谱中若最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，若最大条带为357bp或358bp，则用母y488I酶替换猫al酶再重复上述酶切反应，若PCR-RFLP 带谱中最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I，若带谱中最大条带为743bp或741bp， 则为松材线虫R型株系。
全文摘要
本发明公开了一种松材线虫M型和R型株系的PCR-RFLP鉴别方法，通过DNA提取、PCR扩增、HhaI酶或和Hpy188I酶酶切反应及带谱鉴别，若HhaI酶酶切反应获得PCR-RFLP带谱最大条带为467bp，则为松材线虫M型株系II，最大条带为357bp或358bp，则再用Hpy188I酶酶切反应，若带谱最大条带为492bp，则为松材线虫M型株系I；若带谱最大条带为743bp或741bp，则为松材线虫R型株系；这样就能很明显区分松材线虫M型株系和松材线虫R型株系，为检疫鉴定及处理提供了保障。
文档编号C12Q1/68GK102229993SQ201110141018
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者王江岭, 顾建锋 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院