一种松材线虫的快速制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于线虫制备技术领域，尤其涉及一种松材线虫的快速制备方法。
【背景技术】
[0002]我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病，此后，该病在我国境内迅速扩散蔓延，危害日趋严重，现已在江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、陕西、香港及台湾等地区发生，发生面积达8.7万公顷，累计致死松树3，500多万株，因松材线虫病造成的直接经济损失已达25亿元，间接损失达250亿，使我国的松木资源、自然景观和生态环境遭受严重影响。
【发明内容】
[0003]本发明就是针对上述问题，提供一种灵敏、快速的松材线虫的快速制备方法。
[0004]为实现上述目的，本发明包括以下步骤。
[0005](I)将葡萄孢接种于PDA培养基上，25°C恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25°C恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4°C储存备用。
[0006](2)松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约1cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h ;由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用。
[0007](3)将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。
[0008]作为一种优选方案，本发明所述消毒处理方法包括以下步骤。
[0009]I)收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心Imin。
[0010]2)用1%的硫柳萊溶液消毒，无菌水洗涤3次。
[0011]3)用硫酸链霉素和放线菌酮，4°C消毒过夜。
[0012]4)无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。
[0013]5)将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心lmin。
[0014]6)重复步骤2)。
[0015]7)将6)中消毒的线虫放在装有无菌的生理盐水的培养皿中，25°C生化培养箱中培养，待大量虫卵产生后收集虫卵。
[0016]8)用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。
[0017]9 )用吐温和NaOH溶液收集虫卵。
[0018]10)无菌水冲洗。
[0019]11)将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。
[0020]作为另一种优选方案，所述消毒处理方法包括以下步骤。
[0021 ] I)收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心lmin。
[0022]2)用1%的硫柳萊溶液消毒30min，无菌水洗涤3次。
[0023]3)用0.1%的硫酸链霉素和0.02%的放线菌酮，4°C消毒过夜。
[0024]4)无菌水冲洗3次后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。
[0025]5)将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心lmin。
[0026]6)重复步骤2)。
[0027]7)将6)中消毒的线虫放在装有无菌的0.9%的生理盐水的培养皿中，25°C生化培养箱中培养12_24h，待大量虫卵产生后收集虫卵。
[0028]8)用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。
[0029]9 )用0.05%的吐温和8mM的NaOH溶液收集虫卵。
[0030]10)无菌水冲洗5次。
[0031]11)将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。
[0032]本发明有益效果。
[0033]本实验采用PCR方法检测消毒效果可弥补传统培养方法的缺点，结合对线虫和虫卵进行多步消毒的方法，建立了获得无菌线虫的技术。与传统培养检测的方法相比，PCR方法检测细菌污染更灵敏更快速。
【具体实施方式】
[0034]本发明包括以下步骤。
[0035](I)将葡萄孢接种于PDA培养基上，25°C恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25°C恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4°C储存备用。
[0036](2)松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法。其装置是将直径10_15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约1cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹。在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上。加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h。由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中。关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用。
[0037](3)将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。
[0038]所述消毒处理方法包括以下步骤。
[0039]I)收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心lmin。
[0040]2)用1%的硫柳萊溶液消毒，无菌水洗涤3次。
[0041]3)用硫酸链霉素和放线菌酮，4°C消毒过夜。
[0042]4)无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。
[0043]5)将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心lmin。
[0044]6)重复步骤2)。
[0045]7)将6)中消毒的线虫放在装有无菌的生理盐水的培养皿中，25°C生化培养箱中培养，待大量虫卵产生后收集虫卵。
[0046]8)用无菌水