一种百合种球综合性脱毒方法
【技术领域】
[0001]本发明属于在播种或种植前测试或处理种子的方法，具体涉及一种百合种球脱毒的方法。
【背景技术】
[0002]东方百合是百合杂种类中花朵最大而又最美丽的一大类，能散发出怡人的香味，故又称之为香水百合，深受人们的喜爱，是世界上广泛栽培的一大类百合杂种系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖，但长期的无性繁殖使病毒在体内积累，引发各种病毒病，严重影响种球和切花的产品品质，近年来，随着我国百合引种数量和种植面积的迅速增力口，以及不规范的种球自繁，病毒病开始在我国各百合种植区发生流行，病毒病一般发病率在40?60%，二代种球带毒率有的达到90%以上，严重地制约了我国百合产业的提质增效。
[0003]目前，国内外有关百合的脱毒处理主要是单独采用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒及相互间的组合脱毒，这些方法单独使用时效率低，脱毒效果差，其普遍采用较好的是茎尖培养脱毒法，其常规的步骤是；通过植物顶端分生组织切取0.2?0.3mm茎尖，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织分化产生鳞茎芽，长成小植株得到脱毒苗。例如，专利号为200410079613.2的中国专利公开了一种“东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法”，是米用茎尖作为外植体，经灭菌，诱导培养后获得东方百合脱毒鳞茎；该脱毒组织培养法存在的
问题是:切取很小的茎尖分生组织，在添加6-BA 1.0?2.0 mg / L和NAA 0.2?0.6mg / L的MS基本培养基上培养20?26d，茎尖会同时形成愈伤组织和不定芽，但从愈伤组织分化的不定芽易发生遗传变异；且未对病毒进行进一步的检测和监控，难于了解脱毒情况。
[0004]也有如专利号为200910091972.6的中国专利公开了 “一种百合种球病毒的脱除方法”，是采用暗培养，对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒，茎尖的脱毒方式为茎尖热处理结合化学药剂脱毒，变温处理种球球芯3?6周，温度范围为26?38°C，同时用病毒唑脱毒，浓度为6?7mg/ml，茎尖大小为0.4?1.2mm。该方法是对组培苗进行脱毒，组培苗需在无菌条件下获取，获取环境要求严格。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的百合种球综合性脱毒方法，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。
[0006]本发明通过以下技术方案实现:百合种球综合性脱毒方法，包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球，用浓度为20?40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为46?66%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20?26个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭46?66%的水分；在温度为21?23°C，湿度为70?80%，光照强度1600?2000Lx，光照时间8?12h/d的条件下，经过6?7天后，芽长到6?6cm时进行热处理脱毒。
[0007]B、热处理脱毒:将温度控制在36?38°C之间，湿度为70?86%，光照强度1600Lx，光照时间8?12h/d的环境条件下，经过7?16天培养，芽长高并绽开成莲座状。
[0008]C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗6分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为76%的酒精浸泡8?16秒；④吐温80无菌水浸泡2?3分钟；⑤再用无菌水洗6?7遍至无泡沫。
[0009]D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.3?0.6 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21?23°C，光照强度1600?3000Lx，光照时间8?12h/d，培养40?60天后，生长点膨大成直径2?3cm的叶丛。
[0010]其中，诱导培养基为:1/ 2MS+BA2.6 ?6mg/L+ ΝΑΑ0.26 mg/L+ 糖 40g/l+ 琼脂 6.6g/L。
[0011]E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.6cm小块，接种于脱毒培养基中，脱毒培养基为:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖+活性炭0.6%+病毒唑6 mg/L+琼脂6.0 g/L，在温度为21?23°C，光照时间为8?12h/d，光照强度为2000?3000Lx的环境条件下，经过40?60天培养,形成带球的瓶苗。
[0012]其中,病毒唑的添加方法如下:
a.用无菌蒸懼水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液。
[0013].将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。
[0014]c.将高温灭菌后的培养基:MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4%糖+活性炭0.6%+琼脂
6.0g/L，冷至36?40°C时，吸取病毒唑母液，按6mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。
[0015]F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒病毒，即为百合脱毒种苗。
[0016]优选的，步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。
[0017]步骤D是采集长度为0.3?0.4 _的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。
[0018]有益效果
①本发明采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法，有效解决了单独使用一种方法存在的不足，缩短了培养周期，减少病毒交叉感染，植株成活率高，脱毒率明显提高，百合脱毒率达到80%以上，脱毒率较只采用高温处理提高了 26?70%。
[0019]②本发明的脱毒方法，采用了 36?38°C的高温，在该高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖，该期间生产的嫩梢带病毒较少，且该温度能保证植株的成活率。
[0020]③本发明脱毒培养基内添加病毒唑的方法能使脱毒更彻底。
[0021]④热处理后剥取0.3?0.6 mm的茎尖生长点进行培养，此操作简单，易于操作，脱毒效果好。
具体实施例
[0022]实施例1:百合种球综合性脱毒方法，包括以下步骤:
A、外植体生长点的剥取:选优质种球，用浓度为20%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为46%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭46%的水分；在温度为21°C，湿度为70%，光照强度1600LX，光照时间8h/d的条件下，经过6?7天后，芽长到6cm时进行热处理脱毒。
[0023]B、热处理脱毒:将温度控制在36°C之间，湿度为70%，光照强度1600Lx，光照时间8h/d的环境条件下，经过7?16天培养，芽长高并绽开成莲座状。
[0024]C、外植体清洗消毒:①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗6分钟，用纱布包好,清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为76%的酒精浸泡8秒；④吐温80无菌水浸泡2分钟；?再用无菌水洗6遍至无泡沫。
[0025]D、生长点采集诱导培养:采集长度为0.3 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21°C，光照强度1600Lx，光照时间8h/d，培养40?60天后，生长点膨大成直径2cm的叶丛。
[0026]E、脱毒培养:将诱导出的叶丛切成0.6cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为21°C,光照时间为8h/d，光照强度为2000LX的环境条件下，经过40?60天培养，形成带球的瓶苗。
[0027]F、病毒检测:将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。
[0028]实施例2:百合种球综合性脱毒方法，包括以下步骤:
A、外植体生长点的