抗蓝舌病病毒12型ns1蛋白的单克隆抗体btv12-ns1-1f8及其识别的b细胞表位和应用
【技术领域】
[0001] 本发明一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，特别设及一株分泌抗蓝舌病病 毒12型NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还设及由上 述单克隆抗体所识别的BTV12型NSl蛋白的线性B细胞表位W及上述杂交瘤细胞株、单克 隆抗体W及线性B细胞表位在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的相关试 剂与药物中的应用，本发明属于蓝舌病的防治领域。
【背景技术】
[0002] 蓝舌病度luetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒度Iuetongue Virus,BTV)引起的反当动物虫媒（如库朦、伊蚊等）传染病。其临诊特征为发热、黏膜水肿 和糜烂等炎症变化。世界动物卫生组织（01巧将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为 一类动物疫病。本病于19世纪在南非的绵羊中首次发现，1905年被命名为"蓝舌病"，由于 BTV中存在大量的基因变异和抗原变异，到目前为止世界上已经发现26种BTV血清型，且各 个血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护作用，运给BT的检测和防控带来了极大的困难。因 此，尽早鉴别诊断爆发的BT血清型并在该病流行区域接种相应的疫苗是防治本病的关键。 我国于1979年在云南首次发现BT流行，之后在湖北（1983年）、安徽（1985年）、四川（1989 年）、山西（1991年）相继爆发本病；同时内蒙古、河北、广东、广西等10个省有BTV血清学 阳性畜检出。在我国已经检测出BTV-1，2,3,4,12,15,16屯个血清型，其中1型和16型是 主要的致病血清型。因此，制备出特异性针对BTV12的Mab,针对BTV12建立一套行之有效 的检测方法就显得十分必要。
[0003] 蓝舌病病毒度TV)与茨城病毒、鹿流行性出血病病毒、非洲马攝病毒同属环状病 毒属。蓝舌病病毒为双股RNA病毒，呈20面体对称，直径为70-80nm，具有双层衣壳。基因 组由10个大小不同的双股RNA组成，分别编码7种结构蛋白（VP1~VP7)和4种非结构蛋 白（NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)。外壳蛋白包含VP2和VP5,诱导产生型特异性中和抗体。非 结构蛋白（N巧负责控制BTV复制，成熟和出芽，其中NSl蛋白由S5基因编码，核巧酸长 1689bp，编码552个氨基酸，蛋白大小为64kDa。S5基因在BTV感染宿主过程中具有遗传 和和抗原稳定性。NSl蛋白是在BTV复制周期中表达量最高的细胞质蛋白，其多聚体能够在 感染细胞内中形成大量的病毒特异性微管（直径52. 3nm，1000 nm)，上调包括NSl蛋白的所 有病毒蛋白的合成，形成NSl表达的正反馈，进而迅速增加所有病毒蛋白的合成，使BTV感 染哺乳动物后，病毒蛋白的合成能够迅速取代细胞蛋白的合成，在BTV引起细胞病变的过 程中起重要作用。所W可W通过制备BTV12-NS1蛋白特异性的单克隆抗体并鉴定NSl蛋白 的B细胞表位W建立BTV12的快速准确的鉴别诊断方法并进一步研究预防与治疗措施。
【发明内容】
[0004] 本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒12型度TV12)NSl蛋白的单克隆抗 体的杂交瘤细胞株；
[0005] 本发明目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体 可与BTV12NS1蛋白发生特异性反应；
[0006] 本发明目的之S是提供一种BTV12NS1蛋白的线性B细胞表位。
[0007] 本发明的上述目的是通过W下技术方案来实现的：
[0008] 本发明利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12NS1蛋白作为 免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，W祀T-30a原 核系统表达纯化的重组NSl蛋白作为包被抗原建立的间接化ISA方法筛选阳性杂交瘤 细胞，最终获得一株能够稳定分泌抗BTV12NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 BTV12-NS1-IF8,分类命名为分泌抗BTV12-NS1-IF8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中 国普通微生物菌种保藏管理中屯、，其微生物保藏号是：CGMCCNo. 10207 ;保藏时间为2014 年12月23日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
[0009] 此外，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，命名为 BTV12-NS1-1F8,IFA检测结果表明该单克隆抗体与重组BTV12NS1蛋白及感染BTV12的 BHK-21细胞发生特异性反应，而与感染BTV1-1LBTV13-24的BHK-21细胞及相应阴性对照 均不发生反应。
[0010] 进一步的，本发明利用肤扫描技术对BTV12-NS1-1F8所识别的BTV12NS1蛋白的线 性B细胞表位进行了鉴定，结果表明：BTV12-NS1-1F8所识别的BTV12NS1蛋白的线性B细 胞表位的氨基酸序列为Sip服AFQLVELAKEAMY?(SEQIDNO. 1所示）。
[0011] 综上所述，本发明制备并鉴定出了一株能够稳定分泌特异性针对BTV12-NS1蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞，实验证明由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体W及该单克隆抗 体所识别的针对12型BTV的线性B细胞表位可用于制备鉴别或诊断BTV12感染的的试剂 W及预防或治疗BTV12型感染的相关药物，本发明的提出为建立BTV12型的鉴别诊断方法 W及进一步研究BTV12型的防治措施奠定了基础。
【附图说明】
[0012] 图1为祀T-30a原核系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的SDS-PAGE与Western blot鉴定；
[0013] 1 :pET-30a空载体；2 :重组BTV12-NS1蛋白超声后沉淀；3 :重组BT:12-NS1蛋白 超声后上清；4 :重组BTV12-NS1蛋白诱导后；5 :重组BTV12-NS1蛋白诱导前；6 :纯化后的 重组BTV12-NS1蛋白（SDS-PAGE) ;7:纯化的重组BTV12-NS1蛋白（WB) ;8:未纯化的重组 BTV12-NS1 蛋白（WB);M:标准蛋白Marker。
[0014] 图2为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的 SDS-PAGE与Westernblot鉴定；
[0015] 1 :重组杆状病毒感染S巧细胞的裂解产物；2 :重组杆状病毒感染S巧细胞的裂 解产物上清；3 :重组杆状病毒感染S巧细胞的裂解产物沉淀；4 :纯化的BTV12NS1蛋白 (SDS-PAGE) ;5 :野生型杆状病毒感染的S巧昆虫细胞；6 :纯化的BTV12NS1蛋白（WB);M:标 准蛋白Marker。
[0016] 图3为应用IFA检测单克隆抗体BTV12-NS1-1F8与BTV1-24型病毒感染的BHK-21 细胞、未接毒的BHK-21细胞的反应性结果；
[0017] 1-24 :感染BTV1-24 ;25 :鼠的阳性血清；26 :阴性血清。
[0018] 图4为应用Westernblot检测单克隆抗体BTV12-NS1-1F8与真核重组重组NSl 蛋白的反应性结果；
[0019] 1 :感染12型BTV的BHK-21细胞沉淀；2:未感染BTV的BHK-21细胞沉淀；3:真 核重组NSl蛋白；M:蛋白marker
[0020] 图5为原核表达的55条16氨基酸短肤SDS-PAGE分析； 阳02UM:蛋白质分子量标准；1-55 :表达的55条短肤pNSl-1~pNSl-55。
[0022] 图6为利用间接ELISA法鉴定BTVNSl蛋白的线性B细胞表位分析；
[0023] 图7为原核表达的pNSl-7与BTV12-NS1-1F8反应性的Westernblot鉴定。
[0024] M:标准蛋白Marker;1 :BTV12-NS1-1F8与真核表达的重组NSl蛋白的反应；2 : BTV12-NS1-1F8 与空载体pMAkc4x的反应；3 :BTV12-NS1-1F8 与pNSl-7 的反应。
【具体实施方式】
[00巧]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但运些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但运些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 阳0%] 主要实验材料和来源
[0027] 1、蛋白、细胞、毒种
[0028] pET-30a原核系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白、Bac-to-Bac杆状病毒表达系 统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白，SP2/0细胞、Sf21细胞，NSl蛋白截短表达的55条短肤 均由本实验室保存。
[0029] 2、主要试剂和药品
[0030] 胎牛血清（FB巧购自HY化0肥公司、DMEM购自GIB(X)L公司；弗氏佐剂、50 %阳G、 50XHAT、50XHT和8