专利名称：一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物农药领域，具体涉及一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制 备方法和用途。
背景技术：
植物病毒病害种类繁多、分布广泛，且防治困难，每年都给农业生产造成
严重损失(杜春梅等，2004)，是仅次于真菌的第二大类植物病害。烟草花叶病 毒(7bZ acco历ossic i^ms1, TMV)为烟草花叶病毒属(7b6柳ow'/7/s1 fr。〃/ ) 的模式种，自苗床至大田皆可发生，田间发病率一般在5 20%，幼苗期或大田 期感染损失可达30 50%，严重者绝收。
目前已有多类化学农药在防治植物病毒病害方面应用，但其效果并不理想， 且随着人们对生态环境的重视，化学农药的发展和应用受到了限制。而生物农 药由于其有效成分多为天然物质，施用后在自然界有其顺畅的降解途径，对环 境污染小、对人、畜毒性低等特点日益受到人们的青睐。
不同种类的外源抗病毒活性蛋白分别从植物、动物和微生物中得到分离。 1925年Duggar从美洲商陆(州j^c^3ccs J顶erica朋)中发现了具有抗植物病毒 的活性物质(Duggar， 1925)，食用真菌来源的抗植物病毒蛋白的发现要相对晚 一些，迄今从食用菌中分离纯化出抗植物病毒蛋白还很少。1987年，由 Kobayashi等人首次报道了香菇(Ze/7"/ ^ 子实体中植物病毒侵染抑 制剂，即FBP(fruiting body protein, FBP)蛋白。孙慧等(2001年，2003年) 公开了一种抑制TMV侵染的杨树菇(^rocj^es塔erite)蛋白AAVP (^rocWe aegen'ta antiviral protein, AAVP)。付鸣佳等(2003年)公开了一种抗TMV 侵染的金针菇(/^3顺"^'/ a ^^;"/ m)蛋白，命名其为Zb蛋白。
黑平菇是平菇(Z^ei/ro"so5^e"ws)的一个菌种，生活力强，进行生料 或熟料栽培，栽培方法简便、管理粗放，生长周期短、产量高。专利申请《一 种黑平菇提取物及其制备方法与应用》(申请号为200810223438.0)公开了一 种具有抗植物病毒作用的黑平菇蛋白提取物，但是没有明确蛋白提取物中哪种活性物质具有抗植物病毒的作用，有待进一步的研究和探索。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗植物病毒的黑平菇蛋白。 本发明另一目的在于提供上述黑平菇蛋白的制备方法。
本发明还一 目的是提供上述黑平菇蛋白在抗烟草花叶病毒病上的应用。 实现本发明的技术方案如下
本发明一种抗植物病毒的黑平菇蛋白，所述黑平菇蛋白来自黑平菇
(尸2e,o^9oWres^ ),其N端氨基酸序列为DAATGYRSVAYFVNWAIYGR (SEQ ID No:l)。
上述抗植物病毒的黑平菇蛋白，按照如下方法制备
(1) 将黑平菇菌丝干粉与PH7. 0 9. 0的磷酸缓冲液混合，在2 6。C浸提 1 3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；
(2) 向所得黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铰至饱和度为40%,于2 6。C放 置6 12小时，离心，收集上清液；
(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于2 6"C放 置6 12小时，离心，收集沉淀，得黑平燕蛋白粗提物；
(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 pH6. 0 9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析8 16小时；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
按照通用的命名方法，将上述所得黑平菇蛋白命名为PoAP (We"r^ZAs ostreattAS Antivirus Protein)。
上述黑平菇蛋白步骤(1)中所述的黑平菇菌丝干粉与磷酸缓冲液之间的混 合比例为lg: 10 20ml。
上述黑平菇蛋白步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的pH值为8.0。
上述黑平菇蛋白步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
上述黑平菇蛋白步骤(1)、 (2)或步骤(3)中所述的离心的时间为25min。
所述的黑平恭菌丝干粉可于市场上购买得到。
上述黑平菇蛋白的制备方法，包括如下步骤(1) 将黑平菇菌丝干粉与pH值为7. 0 9. 0的磷酸缓冲液的混合，在2 6。C浸提l 3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；
(2) 向黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于2 6。C放置6 12小时，离心，收集上清液；
(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于2 6。C放 置6 12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；
(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 pH6. 0 9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析8 16小时；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
上述制备方法步骤(1)中所述的黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混 合比例为lg: 10 20ml。
上述制备方法步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的PH值为8.0。 上述制备方法步骤(1)、 (2)或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。 上述制备方法步骤(1)、 (2)或步骤(3)中所述的离心的时间为25min。 上述制备方法中如无特别说明，均为常规方法。
本发明黑平菇蛋白可用于防治植物病毒，如烟草花叶病毒等。具体方法为 将本发明黑平菇蛋白用水稀释至蛋白总浓度为100 200ug/mL，喷施于3 4叶
、'本发明具有的优点和有益效果(1)本发明将抗植物病毒的黑平菇蛋白具 体为一种单一的蛋白，从为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础，
进而为遗传工程应用该蛋白提供了可能；(2)本发明黑平菇蛋白对植物病毒的 抑制效果好，如在黑平菇蛋白浓度为200ug/mL，喷施烟草72小时后，对烟草 花叶病毒的抑制率达到77. 49%; (3)本发明黑平菇蛋白为天然提取物，对人类 和环境均无害，使用安全；(4)本发明黑平菇蛋白制备方法简单，原料易得， 成本较低，适于大规模的生产和应用。
图1本发明黑平燕蛋白PoAP电泳鉴定图谱；其中1为标准 子量，2为本 发明黑平菇蛋白。图2a为用分子筛(Gel filtration)鉴定蛋白分子量的标准曲线图， 其中A为牛血清白蛋白、B为鸡卵清蛋白、C为胰蛋白酶。
图2b为用分子筛(Gel filtration)鉴定黑平菇蛋白分子量的层析图。
具体实施例方式
下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中 所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 实施例l本发明黑平菇蛋白的制备
按照如下方法进行
(1) 将黑平菇菌丝干粉(购于宜昌森源食用菌有限责任公司)2g与pH值 为8.0的磷酸缓冲液20mL的混合，在4'C浸提2小时，10000rpm离心25min;
弃沉淀，上清即为黑平菇菌丝粗提液。
(2) 向所得黑平燕菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于4'C放置 8小时，然后在10000rpm下离心25rain，收集上清液。
(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于4"C放置8 小时，10000rpm离心25min，收集沉淀得到黑平燕蛋白粗提物；
(4) 用0.03mol/L、 pH9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解， 然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析12小时；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；
(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min，
所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
实施例2本发明黑平燕蛋白的制备
按照如下方法进行 (1 )将黑平菇菌丝千粉2g与pH值为7. 0的磷酸缓冲液20ml的混合，在4°C 浸提2小时，10000rpm离心25min，上清即为黑平菇菌丝粗提掖；
(2) 向所得黑平燕菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于4"C放置 8小时，10000rpm离心25min，收集上清液；
(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于4'C放置8 小时，10000rpm离心25min，收集沉淀得到黑平菇蛋白粗提物；
(4) 用0.01mol/L、 pH8.0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解，然后在2倍重量的重蒸馏水中透析16小时；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱时收集洗脱峰；
(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min，
所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
实施例3本发明黑平燕蛋白的制备用下述方法提取
(1) 按黑平菇菌丝干粉的质量与pH值为9. 0的磷酸缓冲液的混合比例为lg: 20mL，在4。C浸提2小时，10000rpm离心25min，取上清液，得黑平菇的菌丝粗提液；
(2) 在所得黑平菇的菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于4'C放置6小时，然后在10000rpm下离心25min，取上清液；
(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于4。C放置6小时，然后在10000rpm下离心25rain，收集沉淀，得到黑平菇蛋白粗提物；
(4) 用0.02mol/L、 pH7. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解，然后在2倍重量的重蒸馏水中透析10小时；
(5) 透析后的黑平燕蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱时收集洗脱峰；
(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min，
所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
实施例4本发明黑平菇蛋白PoAP的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定按照如下方法进行
(1) 配制分离胶和浓縮胶按照通常的方法配制，分离胶浓度12% (每5mL凝胶中含1. 6mL去离子水，2. OmL 30%Acrylamide， 1. 3mL 1. 5M pH8. 8 Tris-HCl，50uL 10%SDS， 50uL 10%过硫酸铵，2uL TEMED)，浓縮胶浓度5% (每3mL凝胶中含2. lmL去离子水，0. 5mL 30%Acrylamide， 0. 38mL 1. 5M pH8. 8 Tris-HCl，30 uL 10%SDS， 30 uL 10%过硫酸铵，3uL TEMED)。
(2) 用微量进样器取实施例l所制备的黑平菇蛋白，每孔进样15yL。浓縮胶30V/cm，分离胶20V/cm,待指示剂距离凝胶底端lcm时停止电泳。
(3) 染色及脱色固定(30min) -致敏(30min)-水洗(3次，每次10min)-银染(20min)-水洗(2次，每次lmin)-显色(视情况而定)-终止(10min)-保存(1%冰醋酸中，4"C保存)。
结果(如图1)电泳显示只有一条蛋白条带，无其他杂带，说明实施例1中所得黑平菇蛋白为一种单一的蛋白质，通过迁移率计算本发明黑平菇蛋白
PoAP的分子量为32. 0kDa。
实施例5本发明黑平菇蛋白PoAP的凝胶层析测定按照如下方法进行
(1) 凝胶层析过程于4r进行，所用试剂均经过滤和脱气处理。凝胶层析
采用S印hacrylTM S-200 (1. 6cmX60cm)预装层析柱，去离子水充分平衡至280nm
紫外吸光值不再变化。
(2) 用实施例l所制备的黑平菇蛋白上样，去离子水O. 5mL/min洗脱，280nm检测其紫外吸光值。标准蛋白分别采用牛血清白蛋白(66.0kDa)、鸡卵清蛋白
(44.28kDa)和胰蛋白酶(25.0kDa)(购于Merck公司)，以相同条件洗脱。分别记录PoAP及标准蛋白的洗脱体积，绘制标准曲线，计算PoAP的分子量。
(3) 结果根据标准蛋白分子量和洗脱体积(牛血清白蛋白(66.0kDa)、鸡卵清蛋白(44.28kDa)、胰蛋白酶(25,OkDa)和实施例1所制备的黑平菇蛋白的洗脱体积分别为32. 46mL、 37. 07mL、 109. 91mL和36. 95mL)绘制标准曲线
(见图2a和图2b)，得到回归方程，通过黑平菇蛋白的洗脱体积计算出本发明黑平菇蛋白PoAP的分子量为34. 7kDa，结合其SDS-PAGE分子量，推测黑平菇蛋白PoAP为一个单亚基蛋白。
实施例6本发明黑平菇蛋白PoAP的N-端氨基酸序列测定按照如下方法进行
(1) 取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。
(2) 取出实施例4所得的电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5 10分钟。
(3) 在50V恒压条件下(100-170mA)于室温下进行电印迹转移2小时。
(4) 取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色。
(5) 考马斯亮蓝染色，可将0. 1%考马斯亮蓝R-250溶于40%甲醇/1%乙酸，染色30-50秒，用50%甲醇脱色，并用去离子水充分洗涤，然后将剪下待测序的条带经北京大学生命科学中心进行N端氨基酸序列分析。
(6) 结果所测得本发明黑平菇蛋白PoAP的N端氨基酸序列为DAATGYRSVAYFV腿IYGR (SEQ ID No:l)。实施例7黑平菇蛋白PoAP抑制烟草花叶病毒试验1、实验步骤
1) 喷雾防治处理将实施例l得到的PoAP分别用水稀释到不同的蛋白浓
度(见表l)，分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾，每个处理三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生
烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。
2) 病毒接种液的制备病毒来源为本研究室保存的TMV普通株系(以普通烟为寄主，活体保存)，其获取方法是将感染烟草花叶病毒TMV普通株系的普通烟的叶片去除主脉，与pH8. 0的0. 01 mol/L的PBS按lg/20ml混合，每20mlPBS加0.015g金刚砂，将叶片充分研磨，得到接种液。
3) 接种将按步骤l)的方法喷雾72小时后得到的枯斑三生烟植株，用步骤2)得到的接种液进行摩擦接种(植病研究方法(第三版)，方中达，中国农业出版社)接种后立即用清水冲洗，于温室中培养，培养条件为28。C光照12小时，18C无光照12小时，交替进行。
表1实施例1的PoAP蛋白抗TMV试验结果
浓度ng/mL枯斑抑制率％平均值％方差分析标准偏差
重复一重复二重复三2523.2639.0232.9131.73b7.95
5028.3725.4049.1534.30b12.94
10055.4765.9154.0058.466.50
20065.9869.6561.9665.863.85
30049.7154.9861.5155.405.91
40056.4058.6970.1561.7437.37
4)抑制率计算接种72小时后观察枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，按下
式计算出枯斑抑制率。
X= (CK-Y) /CKX100 (式I)
式I中，X为枯斑抑制率，单位％; CK为清水对照叶片的平均枯斑个数，单位个；Y为经实施例l制备的PoAP诱导处理后叶片的平均枯斑个数，单
位个。
10结果从表1可以看出，本发明黑平菇蛋白PoAP有较高的抗TMV活性，效果 可达60%以上，其中PoAP在浓度》100Pg/mL时，其抗TMV活性较高，在此浓度 以上其抗TMV活性随PoAP浓度变化不明显。序列表 〈110>北京市农林科学院
〈120〉 一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制备方法和用途 <160> 1
<170〉 Patentln version 3. 5 <210> 1 <211〉 20 <212> PRT
<213> Pleurotus ostreatus <400〉 1
Asp Ala Ala Thr Gly Tyr Arg Ser Val Ala Tyr Phe Val Asn Trp Ala 15 10 15
lie Tyr Gly Arg
20
权利要求
1、一种抗植物病毒的黑平菇蛋白，其特征在于所述的黑平菇蛋白来自黑平菇(Pleurotus ostreatus)，其N端氨基酸序列为DAATGYRSVAYFVNWAIYGR。
2、 按照权利要求l所述的黑平菇蛋白，按照如下方法制备(1) 将黑平燕菌丝干粉与pH值为7. 0 9. 0的磷酸缓冲液混合，在2 6°C 浸提1 3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；(2) 向黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40l于2 6'C放置6 12小时，离心，收集上清液；(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于2 6。C放 置6 12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 p服.0 9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析8 16小时；(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
3、 按照权利要求2所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步骤(1)中所述的 黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混合比例为lg: 10 20ml。
4、 按照权利要求2或3所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步骤(1)、 (2) 或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
5、 按照权利要求4所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步骤(1)、 (2)或 步骤(3)中所述的离心的时间为25min。
6、 权利要求1 5任一所述的黑平菇蛋白的制备方法，包括如下步骤-(1) 将黑平菇菌丝干粉与pH值为7. 0 9. 0的磷酸缓冲液的混合，在2 6"浸提1 3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；(2) 向黑平凝菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于2 6"放置6 12小时，离心，收集上清液；(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70°/。，于2 6"C放 置6 12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 p朋.0 9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析8 16小时；(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min，所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。
7、 按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的黑 平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混合比例为lg: 10 20ml。
8、 按照权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)、 (2)或 步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。
9、 按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)、 (2)或步骤 (3)中所述的离心的时间为25min。
10、 权利要求1 5任一所述的黑平菇蛋白在防治烟草花叶病毒病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黑平菇蛋白PoAP及其制备方法，首先将黑平菇菌丝干粉在磷酸缓冲液中浸提1～3小时，离心，收集上清液；然后分别向所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为40％和70％，2～6℃放置6～12小时，离心，收集沉淀；用磷酸缓冲液溶解沉淀，接着用重蒸馏水进行透析；再经阴离子交换柱分离，用0.5M NaCl洗脱，收集洗脱峰；然后经30KD超滤管超滤，5000rpm离心超虑40min，所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。本发明黑平菇蛋白PoAP为单一蛋白，可进行遗传工程应用；其次，对烟草花叶病毒抑制效果好；且为天然提取物，对人类和环境均无害；另外，黑平菇蛋白制备方法简单，原料易得，成本较低。
文档编号C07K7/08GK101665530SQ200910093038
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者红 严, 刘建华, 莹 周, 琳 朱, 李兴红, 燕继晔 申请人:北京市农林科学院