专利名称：构建以甘露糖作为筛选标记的转基因黄瓜的方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域中转基因植物的构建方法，特别是涉及以甘露糖作为筛选标记的转基因黄瓜的构建方法。
背景技术：
在植物遗传转化过程中，仅有少数细胞的基因组整合了外源DNA片段，绝大部分细胞仍未被转化。因此，一个有效的转化筛选标记系统对植物的遗传转化极为重要。现在通常采用的方法是将抗生素或除草剂抗性基因连同目的基因共同导入植物细胞，使非转化细胞因缺乏抗性被杀死，而转化细胞因获得抗性得以生存，该种转化筛选标记系统称为负向选择标记系统(Joersbo M，Okkels F T.A novel principle for theselection of transgenic plant cellsPositive selection.Plant Cell Rep，1996，16219-221.)。
利用负向选择标记系统进行植物遗传转化选择的方法经大量事实证明是行之有效的，但随着转基因植物商品化步伐的加快，尽管现在还没有确凿的科学证据表明抗生素以及除草剂抗性基因作为选择标记基因用来转化农作物具有危害性，但全世界针对其对人体及环境存在潜在危害的争论从未停息过，并引起了媒体及公众的广泛关注，使得转基因作物的市场化行为大为延缓。
研究表明，多种外植体都无法利用甘露糖以维持其生长(Malca I，Endo RM，LongMR.Mechanism of glucose counteraction of inhibition of root elongation bygalactose，mannose and glucosamine.Phytopathology，1967，57272-278)。将甘露糖用于植物细胞培养时，它会被植物细胞内源的己糖激酶转化为6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖不能被进一步代谢利用而积累，导致细胞生长得到抑制(Sheu-Hwa C S，Lewis D H，Walker D A.Stimulation of photosynthetic starch formation bysequestration of cytoplasmic orthophosphate.New Phytol，1975，74383-392.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种以甘露糖作为筛选标记的转基因黄瓜的构建方法。
本发明所提供的以甘露糖为筛选标记的转基因黄瓜的构建方法，是利用植物表达载体将6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(manA)导入黄瓜的外植体，经在含甘露糖的培养基上筛选和分化，获得转基因植株。
所述6-磷酸甘露糖异构酶基因在Genbank中的登记号为M15380。
所述植物表达载体可为任意一种可在黄瓜中表达外源基因的植物表达载体，如pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1301等，其中，pCAMBIA1300为优选的植物双元表达载体。
所述筛选和分化培养基中的甘露糖可为纯的甘露糖或甘露糖与其它糖类的组合，所述甘露糖可为任一构型的甘露糖。
所述筛选和分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了甘露糖10g/L，BA1mg/L，ABA 1mg/L，蔗糖3％和琼脂0.62％，pH5.8。
携带有6-磷酸甘露糖异构酶基因的植物表达载体可通过使用农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法或脂质体融合法等方法转化黄瓜的外植体，优选为农杆菌介导法；所述农杆菌可为任意一种根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌EHA105。
所述外植体可为黄瓜的子叶、子叶节、上胚轴或下胚轴，优选为子叶。
所述黄瓜的品种可以是多种多样的，如津研四号、津研七号、津春三号或长春密刺等，优选为津研七号。
和传统的遗传转化选择方法相比，使用甘露糖选择标记系统时，非转化细胞处于饥饿状态，而并非被杀死，所以选择培养过程中较少出现坏死组织，更有利于转基因组织的生长和再生。该选择标记系统具有产物安全(编码的酶已被广泛应用于食品工业)、选择剂价格低廉、选择程序简单，而且不影响转化植物的代谢平衡，转基因植株生长旺盛，筛选效果显著等优点，在转基因植物研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景，有望发展成为植物转化中主导选择标记系统。此外，本发明为利用黄瓜作为植物生物反应器表达口服疫苗等提供了良好的技术平台。
图1为载体pMAN1300 T-DNA区的示意2A为经农杆菌感染的叶片在含甘露糖的分化培养基上进行转基因植株的筛选和分化图2B为分化出的转基因黄瓜小苗图2C为在生根培养基上生长的转基因植株图3为转基因黄瓜的PCR检测结果图4为转基因黄瓜的Southern杂交检测结果图5为转基因黄瓜叶片中PMI活性的检测结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物由上海博亚公司购买和合成。
实施例1、带筛选标记的转基因黄瓜的构建一、磷酸甘露糖异构酶基因manA的克隆磷酸甘露糖异构酶基因manA的克隆参照文献(Paola Lucca，Xudong Ye & IngoPotrykus。Effective selection and regeneration of transgenic rice plants withmannose as selective agent。Molecular Breeding，2001(7)43-49)进行。
二、含有manA的植物双元表达载体pMAN1300的构建将步骤一克隆的基因manA替代质粒载体pCAMBIA1300上的基因hpt得到一双元表达载体，命名为pMAN1300，其T-DNA区的示意图如图1所示(LBT-DNA区左边界；RBT-DNA区右边界；35S花椰菜花叶病毒35S启动子；NOS胭脂碱合成酶终止序列；manA磷酸甘露糖异构酶基因)。
三、转基因黄瓜的获得1、植物材料的消毒及预培养将黄瓜品种津研七号的种子用70％的酒精浸泡15-30秒，用0.1％的升汞消毒5分钟后用灭菌水冲洗3-5次，再用无菌滤纸吸干种子表面的水珠。将经消毒的种子转到1/2MS培养基上，再置于28℃的恒温箱中催芽，出芽后在25℃，光照条件1600lux下进行培养，约4天后，将无菌苗在无菌条件下剪下长度为4-6mm的下胚轴，子叶顶端及其边缘剪成0.4cm2的小块作为外植体，将它们接种于MS基本培养基上进行预培养(注将子叶的叶背接触培养基)。
2、转基因黄瓜的筛选及培育将步骤二构建的载体pMAN1300用冻融法转化农杆菌EHA105，将转化菌株接种子YM固体培养基(含卡那霉素50mg/L)上筛选重组子，用金属匙收集在抗性平板上长出的农杆菌菌体，将其悬浮于MS液体培养基中，调整至菌液的OD值约为0.6，加入100uL 100mM的乙酰丁香酮(AS)和100mL MS液体培养基，静置备用。将步骤1中预培养1-2天的外植体投入上述转化有载体pMAN1300的农杆菌菌液中，不时摇动，使外植体与农杆菌充分接触，侵染20-30分钟。再取出外植体将其置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，风干，转入表面铺有一层滤纸的不含甘露糖的分化培养基上(以未经重组农杆菌浸染的外植体为对照)，暗处共培养3-4天后，将其转移至含甘露糖10g/L和头孢霉素500mg/L的分化培养基培养基上进行分化培养(图2A)，光照条件为16小时/天。结果，未经农杆菌浸染的外植体在含甘露糖的分化培养基上生长约2周后变黄，叶片死亡，伤口处无愈伤组织长出。经农杆菌浸染的外植体，2-3周后叶缘出现绿色芽点，5-6周后分化出小植株(图2B)，当分化植株生长至2-3cm高时，将其转移至1/2MS生根培养基上生根(图2C)。
3、转基因黄瓜的分子检测取步骤2获得的黄瓜再生植株的幼嫩叶片0.2g，用CTAB法提取叶片的基因组DNA并以此为模板，引物序列为15’-GGTCCACCATGTGAAGGCA-3’和引物25’-CCATCGGAATACTTGCGGC-3’，PCR扩增manA，PCR反应条件为先94℃ 4min；然后94℃ 30sec，再55℃ 40sec，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，扩增出约550bp DNA片段的为转基因植株。选取PCR检测为阳性的转基因植株，大量提取植物的基因组DNA，以非转基因植株DNA为阴性对照，以质粒载体pMAN1300 DNA为阳性对照。分别用限制性内切酶XhoI和HindIII酶切植物基因组DNA，再以地高辛标记的manA为探针进行Southern blot分析，结果如图4所示(1-9为转基因再生植株，10为质粒载体pMAN1300，11为非转基因黄瓜对照)，图4中A为用XhoI酶切，用manA PCR扩增产物作探针进行杂交的结果，检测所插入的外源基因的完整性，检测结果表明目的基因已完整整合进黄瓜的基因组中；图4中B为用HindIII酶切，manA PCR扩增产物作探针进行的杂交的结果，检测所插入的外源基因的拷贝数，检测结果表明不同株系中整合位点以及目的基因拷贝数存在较大差异，一定程度上影响了manA在黄瓜中的表达水平。
4、转基因植株的PMI活性检测选取步骤3中经PCR检测为阳性的转基因植株及非转基因对照植株的叶片各250mg，加入250mL 50mM的Tris-HCl(pH7.5)充分研磨，14000rpm离心20分钟，取上清液50uL加入100uL 50mM的Tris-HCl(pH7.5)，然后与100uL显色底物(包括25uL磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(10mM)，25uL磷酸葡糖异构酶(10U/mL)，12.5uL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(10U/mL)，5uL 6-磷酸甘露糖(50mM)和32.5uL Tris-HCl(50mM，pH7.5))混和反应，用分光光度计在340nm波长下检测其OD值，检测结果如图5所示，表明除有一株转基因植株未检测到PMI活性外，其余转基因黄瓜叶片中均可检测到PMI活性，但每个株系PMI活性并不相同，分析是受到染色体插入位点、甲基化以及拷贝数等因素的影响。
权利要求
1.以甘露糖作为筛选标记的转基因黄瓜的构建方法，是利用植物表达载体将6-磷酸甘露糖异构酶基因导入黄瓜的外植体，经在含甘露糖的培养基上筛选和分化，得到转基因植株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述植物双元表达载体为pCAMBIA1300、pBI121或pCAMBIA1301。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述植物表达载体为pCAMBIA1300。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述筛选和分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了甘露糖10g/L，BA 1mg/L，ABA 1mg/L，蔗糖3％和琼脂0.62％，pH5.8。
5.根据权利要求1或2或4所述的构建方法，其特征在于所述携带有6-磷酸甘露糖异构酶基因的植物表达载体转化黄瓜外植体的方法为农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法或脂质体融合法。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述携带有6-磷酸甘露糖异构酶基因的植物表达载体转化黄瓜外植体的方法为农杆菌介导法。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于所述农杆菌为为根癌农杆菌EHA105。
9.根据权利要求1或2或4所述的构建方法，其特征在于所述外植体为黄瓜的子叶、子叶节、上胚轴或下胚轴。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于所述外植体为子叶。
全文摘要
本发明公开了一种以甘露糖作为筛选标记的转基因黄瓜的构建方法。该构建方法是利用植物表达载体将6－磷酸甘露糖异构酶基因导入黄瓜的外植体，经在含甘露糖的培养基上筛选和分化，得到转基因植株。使用甘露糖选择标记系统时，非转化细胞处于饥饿状态，而并非被杀死，所以选择培养过程中较少出现坏死组织，更有利于转基因组织的生长和再生。该选择标记系统具有产物安全、选择剂价格低廉、选择程序简单，而且不影响转化植物的代谢平衡，转基因植株生长旺盛，筛选效果显著等优点，在转基因植物研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景，有望发展成为植物转化中主导选择标记系统。本发明为利用黄瓜作为植物生物反应器表达口服疫苗等提供了良好的技术平台。
文档编号C12N5/10GK1657630SQ20051005930
公开日2005年8月24日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者何正权, 段真珍, 梁薇, 陈凡, 戴建武, 陈发菊, 乐超银, 姚伟, 梁宏伟 申请人:三峡大学, 何正权