专利名称：一种地西泮人工抗原的制备方法
技术领域：
一种地西泮人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
地西泮(Diazepam)为苯二氮卓类镇静安眠药，化学名称为l-甲基-5-苯 基-7-氯-l,3-二氢-2H-l,4-苯并二氮卓-2-酮。其曾被用作动物饲料添加剂，作为生 长促进剂，具有使动物嗜睡少动，生长快且有改变肉质的作用。也用在屠宰和动 物检疫之前，或将动物转移屠宰之前，起镇静作用，以减轻动物紧张状态，降低 动物伤害和死亡率。此类药物常见嗜睡，可见无力、头痛、晕眩、恶心、便秘，偶 见皮疹、肝损害、骨髓抑制等不良反应。若随意在词料中添加此类药物，蓄积的 药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将此类药物列入禁 用药物名单。目前，国内外有关地西泮的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、 气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC -MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要 进一步的提纯处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的 要求。近年来，国外已经开展了关于苯二氮卓类免疫分析方法的研究，但国内 目前在这方面还是一片空白。为了加强对国内肉制品的监督力度和保障人民的 身体健康，有必要展开关于苯二氮卓类免疫分析方法的研究，有必要提供一种 有效的地西泮人工抗原的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种地西泮人工抗原的制备方法，所制备的产品可用 于苯二氮卓类免疫分析方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案 一种地西泮人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的 制备及检测以地西泮，丁二酸酐为原料，利用付-克酰化反应在地西泮的5位 苯环上引入羧基；第二步为人工抗原的制备及检测利用混合酸酐法使之与牛 血清蛋白结合制备地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白。其反应方程式为
COC^COOH—BSA 地西泮 地西泮-3'-琥珀酸半酯 地西泮-牛血清蛋白工艺步骤为1) 人工半抗原的制备地西泮和丁二酸酐配料摩尔比为1:1,分别称取无水氯化铝2.5mmol和丁 二酸酐lmmol于50mL圆底烧瓶中，加入10mL硝基苯，4(TC条件下搅拌至固 体完全溶解；另称取地西泮lmmol，分3次加入上述的反应液中，反应温度逐 渐提高至70。C，反应过夜；在剧烈搅拌下，将反应液倾入适量冰水中，静置分 层后，取有机层进行减压蒸馏，得到的残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出 沉淀，过滤、干燥得到0.8mmol半抗原备用；反应终点监测采用薄层层析法进行监测，硅胶薄板下端lcm处作一水平 线，吸取反应液lpL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析 液为甲苯:乙醚:乙酸:甲醇，体积比为60:30:9:1，展开至薄板0.35-0.4cm处，取 板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53 处观察到显色点作为反应终点；2) 人工抗原的制备制备A液称取O.lmmol半抗原于20mL烧杯中，加入5mL 二氧六环和0.2mL 的三乙胺，冷却至5t:;然后加入0.15mL氯甲酸异丁酯，低温下搅拌lh，此液 为A液；制备B液称取0.003mmo1的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL 二氧六环的 溶液中，并用1N的氢氧化钠调节pH8-9，低温保存，此液为B液；在4'C低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氢氧化钠溶液调 节pH，使pH保持在8-9; 4'C条件下，搅拌保存过夜，即得到人工抗原混合液; 将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2X2L 的去离子水透析4-6天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗 原地西泮-牛血清蛋白。3) 地西泮人工抗原的鉴定偶联比测定估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法<formula>formula see original document page 4</formula>
虽很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原 理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理 分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有 各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸收系数s:配制地西泮浓度为0， 10， 20， 30 iig'mL-1的20°/。乙醇溶 液，通过紫外扫描可知地西泮的最大吸收波长为253nm，在253nm处测吸光值， 每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为「吸光值/摩尔浓度。本发明计算得 s=8732.44 L，r1偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mL" 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30'C水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白 浓度为QJSmg'mL^偶联比测定配制150收mL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到lSOpg.mL-1,在242nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出 的吸光值为Al， A2,则偶联比率为Y: y = ["-4)/f]/(150x10-3/65000)，本发明 计算得Y"17。其中s为摩尔吸光系数(L'mor1)， 65000为牛血清蛋白的分子量，150xl(T3 为牛血清蛋白浓度(吗'ml/1)。本发明的有益效果本发明合成了地西泮的人工抗原，合成步骤简洁，有 效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足 国内对其研究的需要。
图l地西泮人工半抗原的液相色谱图。 图2地西泮人工半抗原的质谱图。 图3地西泮人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
(1)人工半抗原的制备分别称取2.5mmo1无水氯化铝和lmmol 丁二酸酐于50mL圆底烧瓶中，加入 lOmL硝基苯，4(TC条件下搅拌至固体完全溶解。另称取地西泮lmmol，分3次 加入上述的反应液当中，反应温度逐渐提高至70°C，反应过夜。在剧烈搅拌下， 将反应液倾入一定量冰水中，静置分层后，取有机层进行减压蒸馏，得到的残 留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出沉淀，过滤、干燥得到0.8mmo1半抗原备 用。
反应终点监测硅胶薄层板的制作，称取硅胶12g，溶解在40rnL 0.5%质量 浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡l分钟， 均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中备用。
薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液lpL点于 线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲苯乙醚乙酸 甲醇，体积比为60 : 30 : 9 : 1，展开至薄板0.35-0.4cm处，取板，吹干溶剂。 将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53处观察到显色点 作为反应终点。
(2) 人工抗原的制备
制备A液称取O.lmmol半抗原于20mL烧杯中，加入5mL 二氧六环和0.2mL 的三乙胺，冷却至5。C。然后加入0.15mL氯甲酸异丁酯，低温下搅拌lh，此液 为A液。
制备B液称取0.003mmo1的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL 二氧六环组 成的溶液中，并用1N的氢氧化钠调节pH8-9，低温保存，此液为B液。
在4-C低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氢氧化钠溶液 调节pH，使pH保持在8-9。 4'C条件下，搅拌保存过夜，即得到人工抗原混合 液。
透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2 X2L的去离子水透析4-6天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即 得到地西泮人工抗原地西泮-牛血清蛋白。
(3) 地西泮人工抗原的鉴定
偶联比测定估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，
虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量) 的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的 原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子 均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数s:配制地西泮浓度为O， 10， 20， 30吗'mL"的20。/。乙醇溶 液，通过紫外扫描可知地西泮的最大吸收波长为253nm，在253nm处测吸光值， 每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为s-吸光值/摩尔浓度。本发明计算得 s=8732.44 L，r1
偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200 ixg'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30。C水浴
温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nrn处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白 浓度为9.33mg'mL"。
偶联比测定配制150吗TIlL"牛血清蛋白的20。/。乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到lSO^ig'mL-1,在242nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，测出 的吸光值为A1， A2,则偶联比率Y为"=[(4-乓)/^/(150><10—3/65000)，本发明
计算得Y"17。
其中s为摩尔吸光系数(L.mor1)， 65000为牛血清蛋白的分子量，150x10—3 为牛血清蛋白浓度(吸mU1)。
权利要求
1.一种地西泮人工抗原的制备方法，其特征是以地西泮，丁二酸酐为原料，利用付-克酰化反应在地西泮的5位苯环上引入羧基；利用混合酸酐法使之与牛血清蛋白结合制备地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白；步骤为1)人工半抗原的制备地西泮和丁二酸酐配料摩尔比为1∶1，分别称取无水氯化铝2.5mmol和丁二酸酐1mmol于50mL圆底烧瓶中，加入10mL硝基苯，40℃条件下搅拌至固体完全溶解；另称取地西泮1mmol，分3次加入上述的反应液中，反应温度逐渐提高至70℃，反应过夜；在剧烈搅拌下，将反应液倾入适量冰水中，静置分层后，取有机层进行减压蒸馏，得到的残留用少量热甲醇溶液溶解，低温析出沉淀，过滤、干燥得到0.8mmol半抗原备用；反应终点监测采用薄层层析法进行监测，硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲苯∶乙醚∶乙酸∶甲醇，体积比为60∶30∶9∶1，展开至薄板0.35-0.4cm处，取板，吹干溶剂；将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.53处观察到显色点作为反应终点；2)人工抗原的制备制备A液称取0.1mmol半抗原于20mL烧杯中，加入5mL二氧六环和0.2mL的三乙胺，冷却至5℃；然后加入0.15mL氯甲酸异丁酯，低温下搅拌1h，此液为A液；制备B液称取0.003mmol的牛血清蛋白溶于10mL水和8mL二氧六环的溶液中，并用1N的氢氧化钠调节pH8-9，低温保存，此液为B液；在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，并用1N的氢氧化钠溶液调节pH，使pH保持在8-9；4℃条件下，搅拌保存过夜，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氢钠溶液和2×2L的去离子水透析4-6天，使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原地西泮-牛血清蛋白。
全文摘要
一种地西泮人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。本发明第一步为半抗原的制备及检测以地西泮，丁二酸酐为原料，利用付-克酰化反应在地西泮的5位苯环上引入羧基；第二步为人工抗原的制备及检测利用混合酸酐法使之与牛血清蛋白结合制备地西泮的人工抗原即地西泮-牛血清蛋白。本发明合成了地西泮的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
文档编号C07K14/765GK101161678SQ200710135000
公开日2008年4月16日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者彭池方, 徐一平, 李秋生, 昉 秦, 胡拥民, 胥传来, 媛 袁, 伟 陈, 陶冠军 申请人:江南大学