专利名称：一种双氟米松人工抗原的制备方法
一种双氟米松人工抗原的制备方法技术领域一种双氟米松人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。
技术背景双氟米松(Flumethasone，FLM)属人工合成类糖皮质激素，化学名称为6a，9a-双氟孕甾-16a-甲基-lip， 17a， 21-三羟基-1， 4-二烯-3， 20二酮。具有抗过敏、 抗炎的作用，其具有蓄积毒性，许多国家将此药物列入禁用药物名单，尤其是 牛肉制品及牛奶中不得检出。当今国际上常用的双氟米松残留的检测方法有 薄层色谱(TLC)、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材 的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早已经开展了对 双氟米松免疫分析方法的研究，但国内目前在这方面还是一片空白。为了加强 对国内肉制品的监督力度和保障人民的身体健康，有必要展开对双氟米松免疫 分析方法的研究，有必要提供一种有效的双氟米松人工抗原的制备方法。 发明内容本发明的目的是提供一种双氟米松人工抗原的制备方法，所制备的产品可 用于糖皮质激素类免疫方法的研究，为今后人们的研究提供了方便的途径。本发明的技术方案 一种双氟米松人工抗原的制备方法，以双氟米松为原 料，利用丁二酸酐与双氟米松反应生成双氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原; 利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制 备双氟米松的人工抗原即双氟米松-牛血清蛋白。其反应方程式为双氟米松一牛血清蛋白 工艺步骤为-(1) 人工半抗原的制备双氟米松和丁二酸酐配料摩尔比为1 : 3，称取双氟米松0.4mmol和丁二酸 酐1.2mmol置于50mL圆底烧瓶中，加入2.5mL无水吡啶，在6(TC下加热搅拌 6h,将反应物转入10mL含10%盐酸的4卩冰水中，有白色沉淀析出，离心除去 吡啶及过量的丁二酸酐，滤饼用去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后得到 双氟米松半抗原，置于4'C保存；硅胶薄层板的制作称取硅胶12g，溶解在40mL0.5M质量浓度的羟甲基纤 维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻 璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh，最后放入干燥 箱中备用；薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液1^L点于 线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇氯仿氨水体 积比为21 : 78 : 1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外 分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点；(2) 人工抗原的制备制备A液称取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)， 0.099mmol N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的 二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；磷酸盐缓冲液(PBS):配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠71.64g 加水至1000mL。配制0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液磷酸二氢钠35.61g加水至 lOOOmL。将0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液94.7mL与0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液 5.3mL混合即为pH8.0的磷酸盐缓冲液；制备B液称取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲 液中，4'C低温搅拌半小时，此液为B液；在4'C低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅 拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4T:去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2x2L的超纯水透析3天，最后使用冻干 法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原双氟米松-牛血清蛋白。 (3)双氟米松人工抗原的鉴定估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很 多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建 立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别 测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有 各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗-ml/1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白 浓度为3.20mg，mL—1。偶联比测定配制双氟米松浓度为50吗TIlL"的20%乙醇溶液，通过紫外 扫描可知双氟米松的最大吸收波长为241nm.配制200吗.ml/1牛血清蛋白的水溶液，将偶联产物用去离牛水稀释到约 200吗'mL'1，在241nm处测吸光值，以去离子水为空白，测出吸光值。将FLM，FLM 一BSA,BAS的质量浓度根据其相对分子质量转换为摩尔浓度，然后根据公式(1) 算出各自的摩尔消光系数摩尔消光系数￡=| (1)其中，A为吸光度，C为摩尔浓度。 再根据公式(2)估算交联率Mdex: Mbas=(Sflm-bsa - ^bas )/ sflm (2) 本发明计算得交联率约为17。本发明的有益效果本发明合成了双氟米松的人工抗原，所制备的产品可 用于糖皮质激素类免疫方法的研究，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分 析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
图l双氟米松人工半抗原的液相色谱图。图2双氟米松人工半抗原的质谱图。 图3双氟米松人工抗原制备前后的紫外扫描图具体实施方式
(1)人工半抗原的制备称取0.16g双氟米松和0.12g 丁二酸酑于50mL圆底烧瓶中，加入2.5mL无 水吡啶，混合物在6(TC下加热搅拌6h，将反应物转入含10X盐酸(v/v)的冰水 (4°C)中，有白色沉淀析出，离心出去吡啶及过量的丁二酸酐，去离子水洗涤 数次，离心，干燥箱干燥后保存。反应终点监测硅胶薄层板的制作，称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5%质量 浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡l分钟，
均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105'C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中备用。薄层层析法检测硅胶薄板下端lcm处作一水平线，吸取反应液lpL点于 线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇氯仿氨水， 体积比为21 : 78 : 1，展开至薄板3/4处，取板，吹干溶剂。将薄板置于紫外分 析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点。(2) 人工抗原的制备制备A液称取45.93mg (0.09mmo1)半抗原，10.35mg (0.09mmol)N-羟基琥 珀酰亚胺(NHS) ,20.4mg(0.099mmol)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)于20mL 烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液 为活性酯中间体,为A液。磷酸盐缓冲液0.2mol/L磷酸氢二钠液磷酸氢二钠71.64g加水至1000mL。 配0.2mol/L的磷酸二氢钠液磷酸二氢钠35.61g加水至1000mL。将94.7mL的 磷酸氢二钠液与5.3mL的磷酸二氢钠液混合即为pH8.0的磷酸盐缓冲液。制备B液称取120.6mg的BSA溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中， 低温搅拌半小时，此液为B液。在低温(4°C)搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液，全部滴完后，混合液 搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的超纯水透析3天。最后使用 冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原双氟米松-牛血清蛋白。(3) 双氟米松人工抗原的鉴定 估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建 立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别 测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自 不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200吗'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，3(TC水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光 值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白 浓度为3.20mg'mU1。偶联比测定配制双氟米松浓度为50吗TIlL"的20。/。乙醇溶液，通过紫外扫
描可知双氟米松的最大吸收波长为241nm。配制200吸ml/1牛血清蛋白的水溶液，将偶联产物用去离子水稀释到约 200吗'mL'1，在241nm处测吸光值，以去离子水为空白，测出吸光值。将 FLM,FLM—BSA，BAS的质量浓度根据其相对分子质量转换为摩尔浓度，然后根 据公式(1)算出各自的摩尔消光系数摩尔消光系数￡=* (1)其中，A为吸光度，C为摩尔浓度。 再根据公式(2)估算交联率Mdex: Mbas=(Sflm-bsa - Sbas )/ Sflm (2) 本发明计算得交联率约为17。
权利要求
1.一种双氟米松人工抗原的制备方法，其特征是以双氟米松为原料，利用丁二酸酐与双氟米松反应生成双氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备双氟米松的人工抗原即双氟米松-牛血清蛋白；步骤为(1)人工半抗原的制备双氟米松和丁二酸酐配料摩尔比为1∶3，称取双氟米松0.4mmol和丁二酸酐1.2mmol置于50mL圆底烧瓶中，加入2.5mL无水吡啶，在60℃下加热搅拌6h，将反应物转入10mL含10％盐酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，离心除去吡啶及过量的丁二酸酐，滤饼用去离子水洗涤数次，离心，干燥箱干燥后得到双氟米松半抗原，置于4℃保存；硅胶薄层板的制作称取硅胶12g，溶解在40mL 0.5％质量浓度的羟甲基纤维素钠溶液中，用玻璃棒充分搅拌成糊状，超声波振荡1分钟，均匀涂布在玻璃板上，置于阴凉处自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中备用；薄层层析法检测硅胶薄板下端1cm处作一水平线，吸取反应液1μL点于线上，点样结束后吹干，将薄板放入层析缸中，层析液为甲醇∶氯仿∶氨水体积比为21∶78∶1，展开至薄板3.5-4cm处，取板，吹干溶剂，将薄板置于紫外分析仪中，在254nm波长观察，在Rf为0.21处观察到显色点作为反应终点；(2)人工抗原的制备制备A液称取0.09mmol半抗原，0.09mmol N-羟基琥珀酰亚胺，0.099mmol N，N-二环己基碳二亚胺于20mL烧杯中，溶解于1.8mL的二氧六环中，室温下搅拌过夜，离心后弃沉淀，清液为活性酯中间体，为A液；磷酸盐缓冲液将0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液94.7mL与0.2mol/L的磷酸二氢钠溶液5.3mL混合即为pH8.0的磷酸盐缓冲液；制备B液称取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，4℃低温搅拌半小时，此液为B液；在4℃低温搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液搅拌1小时恢复至室温，即得到人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超纯水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原双氟米松-牛血清蛋白。
全文摘要
一种双氟米松人工抗原的制备方法，属于生物化工领域。本发明是以双氟米松为原料，利用丁二酸酐与双氟米松反应生成双氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原转变为活性酯中间体，然后使之与牛血清蛋白结合，制备双氟米松的人工抗原即双氟米松-牛血清蛋白。本发明合成了双氟米松的人工抗原，所制备的产品可用于糖皮质激素类免疫方法的研究，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
文档编号C07K14/765GK101161681SQ20071013524
公开日2008年4月16日 申请日期2007年11月1日 优先权日2007年11月1日
发明者彭池方, 李秋生, 胥传来, 媛 袁, 谢会玲 申请人:江南大学