专利名称：苏丹红Ⅰ人工抗原的合成方法
技术领域：
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及阳离子化载体蛋白的制备及苏丹红I-阳离子化蛋 白偶联物的合成方法。将合成的偶联物作为免疫原免疫动物，可提高机体的免疫应答水平， 制备髙质量的抗苏丹红I抗体。
背景技术：
苏丹红I(SudanI)是一种人工合成的偶氮类、油溶性的化工染色剂，非食用色素。Sudani 在体内的代谢产物为苯胺和l-氨基-2-萘酚。苯胺一方面可直接作用于肝细胞，引起中毒性肝 病，还可能诱发肝细胞基因发生变异，增加了人体癌变的几率；另一方面，苯胺的代谢物(硝 基苯衍生物等)可将血红蛋白结合的F +氧化为Fe3+，导致血红蛋白无法结合氧而患上高铁血 红蛋白症。而SudanI的另一代谢产物萘酚具有致癌、致畸、致敏、致突变的潜在毒性。基于 上述原因，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer ， IARC)将Sudan I归为第三类致癌物，即动物致癌物。所以自1995年起欧盟等国家已禁止其作为色素在食品 中进行添加，我国也在1996年的《食品添加剂卫生标准》中明令禁止使用Sudan I。但是由 于SudanI价廉易得，稳定性强，特别是添加了 Sudani的辣椒粉等调味品的色泽鲜亮持久， 因此仍有不法食品商贩在食品加工中违规使用Sudanl。近年来国内外一系列的"苏丹红事件" 更是引发了世界各国对食品中苏丹红安全性问题的恐慌，因此建立实用、快捷、准确、可靠 的Sudan I检湖方法至关重要。
目前，国内外对苏丹红的检测大多采用HPLC或HPLC/GC-MS检测方法，配以紫外可见 光检测器、二极管阵列检测器、电喷雾离子化检測器等检測器，实验准确度高重复性好，但 样品前处理过程复杂、仪器昂贵、不适应现场简单快速和大批量样品的分析检测，导致了对 Sudanl的管理处于被动、滞后的局面，难以遏制不法厂家的不轨行为。近年来，以酶联免疫 吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)为代表的免疫学方法，因其灵敏、特异、 快速、操作简便和携带方便等优点而越来越被人们重视和采纳，是食品安全快速检测的发展 方向。文献资料检索表明，利用免疫学方法进行苏丹红检渊的研究在国内外还未见报道，因 此，本发明进行了SudanI人工抗原的合成研究，旨为其免疫学分析方法的建立奠定基础。
为了建立Sudan I的免疫分析方法，必须得到抗Sudan I抗体，Sudan I的分子量为248, 是小分子物质，而无法直接免疫动物得到抗体，必须进行抗原改造，制备人工抗原。Sudani人工抗原的合成是免疫学分析的关键。由于Sudanl本身没有能直接与载体蛋白偶联的羧基或 氨基，本发明利用了阳离子化载体蛋白胺甲基化原理合成了 Sudan I-阳离子化载体蛋白的偶 联物。在Sudani的结构中，由于其酚羟基邻位有活泼氢原子，可通过甲醛的偶联作用，与阳 离子化载体蛋白的胺乙基发生胺甲基化偶联。由于阳离子化载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙 基取代，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白的偶联物，阳离子 化载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体 内的免疫应答，同时，也提高了机体对共价偶联在阳离子化载体蛋白半抗原(Sudani)的识 别和应答水平，即可刺激抗原提呈细胞对半抗原决定簇的提呈、促进T淋巴细胞和B淋巴细 胞的增殖。
本发明从Sudani的结构出发，根据胺甲基化反应的经典理论，发明了用阳离子化载体蛋 白构建Sudan I-载体蛋白偶联物的方法。相关研究国内外尚未见报道。
主要参考文献 Beasley H L, Skerritt J H， Desnwchelier J M. Rapid field tests for the organophosthates， fenitrothion and pirimiphos-methyl-reliable estimates of pesticide residues in stored grain, J. Stored Prod. Res"1993， 29， 357-369 Calbiani F, Careri M, Elviri L. Accurate mass measurements for the confirmation of Sudanazo-dyes in hot
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发明内容
(一) 要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种Sudan I-载体蛋白偶联物的合成方法。
(二) 技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是
酚羟基邻位或对位的活泼氢原子在偶联剂甲醛的作用下，能与伯胺或仲胺进行偶联。 根据该原理，Sudani酚羟基邻位的活泼氢原子就能够在甲醛的偶联作用下与含有胺乙基 的阳离子化蛋白反应，得到Sudan I-阳离子化蛋白的偶联物。阳离子化蛋白相对于简单蛋白 而言，具有较多的胺乙基，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白 的偶联物，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞 识别和刺激机体内的免疫应答。阳离子化蛋白可通过以水溶性碳化二亚胺为偶联剂，载体蛋 白与乙二胺反应制得。 具体步骤
1.阳离子化蛋白的制备
载体蛋白包括牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)、血孔匙蛋白(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)和多聚赖氨酸(Ploy-l-lysine， PLL)。
制备步骤
(1) 将乙二胺(ethylenediamine， EDA)加入到冰浴中的2-乙烷磺酸基(2-(N-mo卬holino) ethane sulfonic acid， MES)缓冲液中，并用HC1调节pH至弱酸性；
(2) 将载体蛋白溶于MES后，与上述EDA溶液混匀；
(3) 滴加偶联剂EDC于(2)所述溶液中，室温反应后，用醋酸终止反应；(4) 将上述反应物用去离子水充分透析；
(5) 将其冻干后，冻干备用。
所用EDA体积在20nL 100pL之间，所用的载体蛋白质量在5mg 100mg之间，EDA与 MES的体积比在1:25 1:5之间，MES缓冲液的pH调节到4~6。
制备得到阳离子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin， cBSA)、阳离子卵清
白蛋白(Cationized ovalbumin, cOVA)、阳离子辣根过氧化物酶(Cationized horseradish
peroxidase, cHRP)、阳离子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin, cKLH)或阳
离子多聚赖氨酸(Cationizedploy-l-lysine， cPLL)。 2. SudanI-阳离子载体蛋白偶联物的制备
Sudan I-阳离子载体蛋白偶联物包括Sudan I-cBSA、 Sudan I-cOVA、 Sudan I-cHRP、 Sudan I-cKLH禾Q Sudan I-cPLL。
制备步骤
(1) 将阳离子载体蛋白和Sudan I分别用去离子水和二甲基甲酰胺溶解后，将Sudan I 溶液逐滴加入到载体蛋白液中混匀；
(2) 在上述反应液中加入偶联剂甲醛，反应后即得到Sudan I-阳离子载体蛋白偶联物；
(3) 用去离子水充分透析后，冻干备用。
其中，阳离子载体蛋白与Siidanl的质量比例在l:l 5:l之间，二甲基甲酰胺和甲醛的体 积比在1:1 5:1之间。 (三)有益效果
本发明以Sudan I为半抗原，利用阳离子化蛋白合成了 Sudan I —载体蛋白偶联物，该方 法操作步骤简单、实际可行。
下面结合附图和实施例对本发明专利做进一歩详细阐述。
图l Sudani的结构
图2载体蛋白的阳离子化
图3 Sudani与阳离子化载体蛋白的偶联机理
8
具体实施例方式
实施例1 Sudan I-cBSA偶联物的制备
1 cBSA的制备
将50 100nLEDA加入到500 冰浴MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgBSA溶解于50^iL的MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混 合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透 析48 72h，冻干备用。
2 Sudan I-cBSA偶联物的制备
将5~100mg的cBSA与2mg Sudan I分别用500~10000nL去离子水和50~1000^iL 二甲基 甲酰胺溶解后，再将上述Sudan I溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 50 1000nL甲醛，37'C下轻摇24h，用去离子水充分透析72h后，冻干备用。
实施例2 Sudan I-cOVA偶联物的的制备
1 cOVA的制备
将50~100pL EDA加入到500 冰浴MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgOVA溶解于IOO^iL的上述缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混 合液中添加2 50mg的EDC,室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透 析48 72h，冻干备用。
2 Sudan I-cOVA偶联物的制备
将5~100mg的cOVA与l 50mg Sudan I分别用500~10000nL去离子水和50~1000nL 二 甲基甲酰胺溶解后，再将上述Sudani溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 50 1000pL甲醛，37"C下轻摇24h，用去离子水充分透析72h后，冻干备用。
实施例3 Sudan I-cHRP偶联物的制备 1 CHRP的制备
将50 100pLEDA加入到冰浴的500 pLMES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgHRP溶解于500^iL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上 述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充 分透析48 72h，冻干备用。2 Sudan I-cHRP偶联物的制备
将5~100mg的cHRP与l~50mg Sudan I分别用500 10000|xL去离子水和50 1000pL 二 甲基甲酰胺溶解后，再将上述Sudan I溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀后，迅速加入 50 1000pL甲醛，37。C下轻摇24h，用去离子水充分透析72h后，冻干备用。
实施例4 Sudan I-cKLH偶联物的制备
1 cKLH的制备
将50~100pLEDA加入到冰浴的500 pLMES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mg KLH溶解于800nL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在 上述混合液中添加2 50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水 充分透析48 72h，冻干备用。
2 Sudan I-cKLH偶联物的制备
将5 100mg的cKLH与l~50mg Sudan I分别用500~10000pL去离子水和50~1000fiL 二 甲基甲酰胺溶解后，再将上述Sudani溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 5(M000^iL甲醛，37'C下轻摇24h，用去离子水充分透析72h后，冻干备用。
实施例5 Sudan I-cPLL偶联物的制备
1 cPLL的制备
将50~100^L EDA加入到冰浴的500 MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgPLL溶解于1000pL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在 上述混合液中添加》50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水 充分透析48 72h，冻干备用。
2 Sudan I-cPLL偶联物的制备
将5~100mg的cPLL与l~50mg Sudan I分别用500~1000(VL去离子水和50~1000nL 二甲 基甲酰胺溶解后，再将上述Sudan I溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 50 1000pL甲醛，37。C下轻摇24h，用去离子水充分透析72h后，冻干备用。
上述所用MES缓冲液浓度均为O.lmol/L， HC1均为lmol/L，醋酸均为4mol/L。 SudanI-阳离子蛋白偶联物的鉴定
采用紫外分光光度计对阳离子载体蛋白、Sudanl标品及偶联物进行扫描，根据其特征吸收峰来确定偶联是否成功。
结果显示，Sudan I-阳离子化载体蛋白偶联物在可见光区有明显吸收峰出现，与Sudan I 的最大吸收峰(476nm)相比有红移现象。根据可见分光光度法，按以下公式，可以计算出 Sudan I与阳离子化载体蛋白的偶联比。
载476,
公式-=-
'C载^偶278扁X ￡"Su476 m 一 J偶476扁X ￡"Su278 m
其中C&:偶联物中Sudani的摩尔质量； C载偶联物中载体蛋白的摩尔质量；
爿偶476腦偶联物在476nm处的吸光度； j偶，鹏偶联物在278nm处的吸光度； S载27s腳载体蛋白在278nm处的摩尔消光系数； S载桃,!^:载体蛋白在476nm处的摩尔消光系数； &u476 : Sudan I在476nrn处的摩尔消光系数； &u2 m : Sudan I在476nm处的摩尔消光系数； 经过计算，Sudan I与阳离子化载体蛋白的偶联比在8:1左右，证明成功制备了 Sudan I-阳离子化蛋白偶联物。
权利要求
1.阳离子化蛋白，其特征在于结构式其中，载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基取代，整个蛋白带正电，因而作为完全抗原免疫动物时，阳离子化载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的免疫应答。
2. Sudanl-阳离子化蛋白偶联物，其特征在于它的分子结构式为其中，载体蛋白可以是阳离子化牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin, cBSA)、阳离子化卵清白蛋白(Cationized ovalbumin, cOVA)、阳离子辣根过氧化物酶 (Cationized horseradish peroxidase, cHRP)、卩日离子化血孑L匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin， cKLH)或阳离子化多聚赖氨酸(Cationized ploy-L-lysine， cPLL)， 分别与Sudan I结合得到Sudan I-cBSA、 Sudan I-cOVA、 Sudan I-cHRP、 Sudan I-cKLH和 Sudan I隱cPLL。
3.制备权利要求l所述一种阳离子化载体蛋白的方法，其特征在于实验步骤包括 (1)制备cBSA，步骤如下将20 100nL乙二胺(ethylenediamine， EDA)加入到冰浴的500^L O.lmol/L 2-乙烷 磺酸(2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid， MES)缓冲液中，并用lmol/L HC1将pH调 节到4~6，然后，将5 100mg BSA溶解在50nL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶 液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的碳化亚二胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide, EDC)，室温搅拌l~12h，用4mol/L的醋酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，将其冻藏备用。(2) 制备cOVA，步骤如下将20 100pL EDA加入到冰浴的500pL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4~6，然后，将5~100mg OVA溶解在100jiL的上述MES缓冲液后，与上述 EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l~12h,用4mol/L的 醋酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，将其冻藏备用。(3) 制备cHRP，步骤如下将20 100nL EDA加入到冰浴的500pL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4~6，然后，将5 100mg HRP溶解在500pL的上述MES缓冲液后，与上述 EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l~12h，用4mol/L的 醋酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，冻藏备用。(4) 制备cKLH，步骤如下将20 100pL EDA加入到冰浴的500nL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4 6，再将5~100mg KLH溶解于800|nL的上述MES缓冲液后，与上述EDA 溶液混匀，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC,室温搅拌l 12h后，用4mol/L的醋 酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，冻藏备用。(5) 制备cPLL，步骤如下将20 100jaL EDA加入到冰浴的500 O.lmol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4~6，再将5~100mg PLL溶解于lOOOpL的上述MES缓冲液，然后，与上 述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l~12h后，用4mol/L 的醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48 72h，冻藏备用。所用EDA体积在20pL ~100pL之间，所用的载体蛋白质量在5mg 100mg之间，EDA 与MES的体积比在1:25 1:5之间，MES缓冲液的pH调节到4~6。
4. 如权利要求2所述一种Sudan I-阳离子化载体蛋白偶联物的制备方法，其特征在于 Sudani酚羟基邻位活泼氢能够在甲醛的偶联作用下与阳离子化蛋白的胺乙基反应，得到 Sudan I-阳离子化载体蛋白的偶联物，能够制备包括免疫抗原、包被抗原和酶标记物在内 的Sudanl-阳离子化蛋白偶联物，得到Sudani完全抗原。
5. 如权利要求2所述一种Sudanl-阳离子化载体蛋白偶联物的制备方法，其特征是偶联 剂为甲醛。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于实验步骤包括(1) Sudan I-cBSA的制备，步骤如下将5~100mg cBSA与l~50mg Sudan I分别用 500~10000nL去离子水和50~1000pL 二甲基甲酰胺溶解，再将Sudan I溶液逐滴加入到上 述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50 1000nL甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应后即 得到Sudan I-cBSA,用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(2) Sudan I-cOVA的制备，步骤如下将5 100mg的cOVA与l~50mg Sudan I分别 用500~10000]liL去离子水和50~1000|uL 二甲基甲酰胺溶解，再将Sudan I溶液逐滴加入 到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50~1000nL甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应 后即得到Sudan I-cOVA，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(3 Sudan I-cHRP的制备，步骤如下将5~100mg的cHRP与l~50mg Sudan I分别用 50(M000(VL去离子水和50~1000nL 二甲基甲酰胺溶解，再将Sudan I溶液逐滴加入到上 述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50~1000^L甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应后即 得到Sudan I-cHRP,接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(4) Sudan I-cKLH的制备，步骤如下将5~100mg的cKLH与卜50mg Sudan I分别 用500~10000^L去离子水和50~1000pL 二甲基甲酰胺溶解，再将Sudan I溶液逐滴加入 到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50~1000nL甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应 后即得到Sudan I-cKLH，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(5) Sudan I-cPLL的制备，步骤如下将5~100mg的cPLL与l~50mg Sudan I分别 用500~10000nL去离子水和50~1000^L 二甲基甲酰胺溶解，再将上述Sudan I溶液逐滴 加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50~1000^L甲醛，37。C下轻摇24h，充分 反应后即得到SudanI-cPLL，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。其中，阳离子载体蛋白与Sudani的质量比例在1:1 5:1之间，二甲基甲酰胺和甲醛的 体积比在1:1 5:1之间。
全文摘要
本发明公开了一种苏丹红I的人工抗原制备方法，该方法根据胺甲基化反应的原理，利用苏丹红I结构中酚羟基邻位的活泼氢原子，以甲醛为偶联剂，与阳离子化蛋白中的胺乙基发生缩合反应，合成苏丹红I与阳离子化载体蛋白偶联物。整个制备过程操作简便、可行，苏丹红I的利用率高。
文档编号C07K1/10GK101293911SQ20071005193
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者伟 余, 吴佳佳, 周有祥, 王小红, 陈福生 申请人:陈福生