一种巯基β‑环糊精功能化SERS纸基的制备方法及应用与流程

本发明涉及医药分析技术领域，具体地说，是一种巯基β-环糊精功能化sers纸基的制备方法及应用。

背景技术：

随着中药材市场的不断扩大，中药材违禁添加染料的事件在国内层出不穷。不法商贩为谋取利益，躲避药监部门对商品中染料的检查，通常会采用着色力强的脂溶性染料，或者采用两种或以上的混合染料对中药材中的次品进行染色。然而大多数染料分子对人体存在危害隐患。比如苏丹红分子，它是一类具有苯基偶氮萘酚结构的化合物，经过体内代谢转化为芳胺化合物，导致人体中肝脏细胞发生基因突变，从而提高了癌症的发生率。因此，为了保障公众的用药安全，建立一种适用于苏丹红分子的现场快速灵敏的检测方法具有重要的意义。

目前，常用于苏丹红分子检测的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳色谱法、免疫方法等，这些方法虽然高效灵敏，但是仪器庞大、造价高、分析周期长、样品前处理复杂，不能满足现场快速检测的需求。相反，表面增强拉曼光谱由于它快速、灵敏、可实现对样品无损检测以及提供丰富的分子指纹特征，在现场快速检测中受到了广泛的关注，具有很好的应用前景。

sers技术的关键在于基底的制备，近年来，滤纸由于具有轻、薄、造价低、方便携带和取样、可批量生产且生物兼容等特点，受到越来越多研究者的青睐，将其作为构筑各种纳米结构的支撑载体，应用于现场检测的实用化sers基底。然而，就脂溶性分子而言，其疏水性与亲水纸基之间亲和力弱，脂溶性分子不能有效地接近纸基的活性位点(“热点”)，导致纸基对脂溶性分子的检测灵敏性具有局限性。因此，为了提高基底与脂溶性分子之间的亲和力，通常会对基底进行表面疏水化或功能化修饰。目前，有方法利用氧化铝模板构筑巯基β-环糊精修饰银纳米棒基底，也有方法基于玻璃片上构筑巯基β-环糊精修饰金纳米球基底，均可用于提高对水污染中脂溶性分子多氯联苯(pcb)的检测灵敏性。然而，上述方法所采用的sers基底质地坚硬，制备成本较高，样品前处理复杂，而且银纳米颗粒易被氧化，导致基底的检测灵敏度快速降低，不利于基底的保存与携带。因此，限制了sers基底的实用化应用前景。本发明以巯基β-环糊精(hs-β-cd)为功能分子修饰金纳米棒(gnr)，不仅利用hs-β-cd的疏水空腔捕获脂溶性染料，提高基底与脂溶性染料的亲和力，而且相比于银纳米材料，gnr不易被氧化，信号稳键，方便贮存。此外，本发明采用滤纸为支撑材料，轻薄柔韧，方便携带，而且具有吸水性和毛细力特性，可简化样品采集过程，具有良好的实用化应用潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种适用于现场快速检测脂溶性染料的sers纸基的制备方法。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种巯基β-环糊精功能化sers纸基的制备方法，包括以下步骤：

步骤一(s1)：巯基β-环糊精功能化金纳米棒的制备

金纳米棒溶液预处理：取适量金纳米棒原液，离心后去除表面活性剂，用等体积的超纯水清洗底层的金纳米棒，离心后去除上清液，底层用等体积超纯水重新分散备用；配制浓度为100～0.1μm的巯基β-环糊精；取预处理后的金纳米棒溶液与巯基β-环糊精溶液混合，使巯基β-环糊精的最终浓度为50～1μm，振荡后，于恒温水浴中静置，使巯基β-环糊精与金纳米棒充分进行化学吸附作用，混合时间为3～48h，离心转速为8000～10000rpm，离心时间为10～20min；

步骤二(s2)：功能化金纳米棒在滤纸表面的吸附沉积量

将步骤一得到的功能化金纳米棒通过浸泡的方式吸附于滤纸表面：取适量功能化金纳米棒离心后去除上清液，底层用2～4倍浓缩量的超纯水重新分散，将滤纸裁剪成1×1cm²的正方形，分别浸泡于3个浓缩量的功能化金纳米棒溶液中，静置于恒温水浴中，使滤纸充分均匀吸附功能化金纳米棒；所述离心转速为8000～10000rpm，离心时间为10～20min，浸泡时间为12～48小时。

优选的，步骤一采用的巯基β-环糊精的最终浓度优选5μm，金纳米棒与巯基β-环糊精的混合比例优选9:1，混合时间优选24h，水浴中温度优选40℃，离心转速优选9000rpm，离心时间优选15min。

优选的，步骤二采用的金纳米棒的浓缩倍数优选3倍，水浴中温度优选40℃，离心转速优选9000rpm，离心时间优选15min。

本发明的第二方面，提供一种采用上述制备方法制备得到的巯基β-环糊精功能化sers纸基。

本发明的第三方面，提供一种采用上述制备方法制备得到的巯基β-环糊精功能化sers纸基sers性能的考察方法，以苏丹红iv作为探针分子，分别考察纸基的灵敏性、重现性和稳定性。

具体包括以下步骤：

步骤a：考察功能化sers纸基的灵敏性

配制了不同浓度的苏丹红iv溶液备用，分别将浓度50μm-0.5μm的苏丹红iv滴加于纸基表面，在拉曼光谱仪下进行检测，采集20个不同位点的光谱，通过选取1097cm^-1特征峰的强度作为纸基对不同浓度的苏丹红iv的灵敏性表征；

步骤b：考察功能化sers纸基的重现性

将浓度为50μm的苏丹红iv滴加于纸基表面，采集得到50个不同位点的光谱，选取苏丹红iv的特征峰1097cm^-1(ω(c-h/n-h)/υ(n-n))和1485cm^-1(ρ(n-h)/υ(c＝n)/ρ(c-h)ph)的强度计算平均标准偏差值；

步骤c：考察功能化sers纸基的稳定性

将纸基放置在空气中保存90天，分别在第1、7、15、30、60、90天时，将50μm的苏丹红iv滴加于纸基上，采集得到光谱，通过观察苏丹红iv的特征峰1097cm^-1的sers强度变化，评估功能化sers纸基的贮存稳定性。

优选的，所述的步骤a、b、c中sers检测条件为积分时间5s，激光波长为633nm。

与传统的没有经过功能化修饰的金纳米棒纸基对比，功能化金纳米棒纸基对苏丹红iv表现出更好的灵敏性(lod＝0.5μm)。纸基在50个不同位点检测所得的平均标准偏差均小于15％。纸基稳定性如图9所示，将其放置在空气中贮存90天，sers灵敏性仅降至60％。

本发明的第四方面，提供一种上述的巯基β-环糊精功能化sers纸基在检测中药材中违禁添加苏丹红染料中的应用。

本发明的第五方面，提供一种上述的巯基β-环糊精功能化sers纸基用于检测中药材中违禁添加苏丹红染料的方法，包括以下步骤：

用丙酮、乙醚、环己烷试剂润湿所述的功能化sers纸基，用润湿后的纸基擦拭待检样品的表面，通过拉曼检测得到sers光谱，将得到的sers光谱进行基线校正，分析待检样品中是否添加了苏丹红染料。

优选的，所述的润湿试剂优选环己烷，sers检测条件为积分时间5s，激光波长为633nm。

本发明的巯基β-环糊精功能化sers纸基检测真实样品中苏丹红iv的检测限达到38.04ng/cm²。

与背景技术相比，本发明的技术方案的有益效果在于：

1、利用巯基β-环糊精功能化金纳米棒，有利于捕获苏丹红分子

本发明以hs-β-cd作为功能化分子，利用了hs-β-cd具有独特的外亲水内疏水的空腔结构，提供了一个良好的疏水位点，与脂溶性分子具有较好的亲和性，能够包合脂溶性分子，缩短了脂溶性分子与增强基底之间的距离，实现对脂溶性分子的灵敏性检测。此外，将hs-β-cd修饰于gnr表面，由于s-au化学键比br-au强，因此，可以替换出gnr表面的ctab，形成稳键的功能化gnr基底，保证了纸基在检测环境中的稳定性。本发明巯基β-环糊精功能化金纳米棒步骤，保证gnr表面hs-β-cd的最大覆盖率，有利于提高hs-β-cd的疏水性空腔捕获脂溶性分子的效率，增加纸基对脂溶性分子的灵敏性和特异性检测。

2、重现性和稳定性好

本发明制备的纸基由于功能化金纳米棒在其表面吸附量多，而且吸附分布均一性较好，因此进行拉曼检测时，呈现出较好的重现性。此外，金纳米棒不易被氧化，所以功能化纸基的贮存稳定性也表现良好。因此，功能化sers纸基可以满足实用化基底的要求。

3、纸基提供了3d构型，而且制备和操作过程简单，检测成本低

本发明中纸基表面由交叉堆叠的纤维素构成了3d构型，有利于产生较多的热点，提高基底的sers增强性能。此外，利用纸基的吸水性和毛细力特性，通过试剂润湿后，能够实现对真实样品表面的染料分子的简易提取，简化了对样品的前处理过程，检测速度快。并且纸基的制备方式简单，检测成本低，满足现场快速检测的需求。

4、本发明方法制备步骤简单，检测时间短，能够实现对中药材中违禁添加苏丹红染料的快速灵敏性检测。

附图说明

图1为功能化sers纸基的制备以及应用于检测中药材中违禁添加苏丹红染料的流程图；

图2为实施例1中不同浓度的巯基β-环糊精与金纳米棒随混合时间的变化，sers强度的变化趋势；

图3为实施例1中不同浓缩倍数的功能化金纳米棒的sers灵敏性；

图4为实施例1中3倍浓缩的功能化金纳米棒在纸基表面不同沉积时间的sers灵敏性；

图5为实施例1中功能化金纳米棒纸基对不同浓度的苏丹红iv的灵敏性检测光谱以及与金纳米棒纸基灵敏性的对比图；

图6为实施例1中功能化金纳米棒纸基在不同位点采集所得的50条光谱；

图7为实施例1中功能化金纳米棒纸基检测所得50条光谱在1097cm^-1特征峰处的强度图以及它的rsd值；

图8为实施例1中功能化金纳米棒纸基检测所得50条光谱在1485cm^-1特征峰处的强度图以及它的rsd值；

图9为实施例1中功能化金纳米棒纸基随着保存时间的变化，检测苏丹红iv特征峰1097cm^-1的峰强变化；

图10为实施例2中不同试剂润湿的功能化金纳米棒纸基擦拭血竭空白样本采集得到的空白背景；

图11为实施例2中不同试剂润湿的功能化金纳米棒纸基擦拭血竭染色样本采集得到的sers光谱；

图12为实施例2中功能化金纳米棒纸基检测用不同浓度苏丹iv染色的血竭采集得到的sers光谱以及它们在1097cm^-1特征峰处的强度变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本实施例1采用的拉曼光谱仪是labramhr800共聚显微拉曼光谱仪(horibajy)，配备激光波长为632.8mn的he-ne激光器，选用×50lmplfln物镜，数值孔径(na)为0.5，激光功率为～1mw。采用的增强基底为金纳米棒溶胶，制备方法是：1.金纳米棒的制备：将盛有10ml十六烷基三甲基溴化铵(ctab，0.1m)的烧杯放置在水浴锅中(恒温28℃)，加入103μl水合氯金酸(haucl4,25mm)混匀，在搅拌下迅速加入新配置的硼氢化钠溶液(nabh4,0.01m)600μl，持续搅拌2min，28℃静置1h，即为种子液备用。再将盛有10mlctab(0.1m)的三角瓶放置在水浴锅中(恒温28℃)，先后加入120μl硝酸银(agno3,0.08m)，100μl硝酸(hno3,2m)，206μl水合氯金酸(haucl4·3h2o,25mm)，维生素a(aa,0.1m)，搅拌混匀后，加入120μl种子液，搅拌数秒后28℃下静置24h生长成金纳米棒备用。

图1为本实施例对功能化金纳米棒纸基的不同优化条件的制备流程图，具体包括以下三步：

步骤一(s1)：巯基β-环糊精功能化金纳米棒的制备条件优化

金纳米棒溶液预处理：取适量金纳米棒原液，离心后去除表面活性剂，用等体积的超纯水清洗底层的金纳米棒，离心后去除上清液，底层用等体积超纯水重新分散备用；配制浓度为100～0.1μm的巯基β-环糊精；取预处理后的金纳米棒溶液分别与不同浓度的巯基β-环糊精以合适的比例混合，使巯基β-环糊精的最终浓度为50～1μm，振荡后，于恒温水浴中静置，使巯基β-环糊精与金纳米棒充分进行化学吸附作用，混合时间为3～48h，离心转速为8000～10000rpm，离心时间为10～20min。

步骤二(s2)：功能化金纳米棒在滤纸表面的吸附沉积量优化

将步骤一得到的功能化金纳米棒通过浸泡的方式吸附于滤纸表面：取适量功能化金纳米棒离心后去除上清液，底层用2-4倍浓缩量的超纯水重新分散，将滤纸裁剪成1×1cm²的正方形，分别浸泡于3个浓缩量的功能化金纳米棒溶液中，静置于恒温水浴中，使滤纸充分均匀吸附功能化金纳米棒；所述离心转速为8000-10000rpm，离心时间为10-20min，浸泡时间为12-48小时。

步骤三(s3)：功能化金纳米棒纸基的sers性能考察

考察步骤二得到的功能化金纳米棒纸基的sers性能，以苏丹红iv作为探针分子，分别考察纸基的灵敏性、重现性和稳定性。配制了不同浓度的苏丹红iv溶液备用，首先考察纸基的灵敏性，分别将不同浓度(50μm-0.5μm)的苏丹红iv滴加于纸基表面，在拉曼光谱仪下进行检测，采集20个不同位点的光谱，通过选取1097cm^-1特征峰的强度作为纸基对不同浓度的苏丹红iv的灵敏性表征。其次考察纸基的重现性，将浓度为50μm的苏丹红iv滴加于纸基表面，采集得到50个不同位点的光谱，选取苏丹红iv的特征峰1097cm^-1(ω(c-h/n-h)/υ(n-n))和1485cm^-1(ρ(n-h)/υ(c＝n)/ρ(c-h)ph)的强度计算平均标准偏差(rsd)值。最后考察纸基的稳定性，将纸基放置在空气中保存90天，分别在第1、7、15、30、60、90天时，将50μm的苏丹红iv滴加于纸基上，采集得到光谱，通过观察苏丹红iv的特征峰1097cm^-1的sers强度变化，评估功能化sers纸基的贮存稳定性。上述sers检测条件为积分时间5s，激光波长为633nm。

根据步骤一至步骤三(s1～s3)所述方法进行sers效果分析。

经步骤一得到不同浓度巯基β-环糊精与金纳米棒混合不同时间所对应的sers信号强度变化，如图2所示，巯基β-环糊精的最终浓度为5μm时，且金纳米棒与巯基β-环糊精的混合比例9:1时，其与金纳米棒在任意混合时间均比其它浓度的sers强度更高，而且在混合时间为24h时达到最高，因此选择优化条件为5μm浓度和24h混合时间。

经步骤二得到不同浓缩倍数的功能化金纳米棒的sers信号响应，如图3所示。滤纸在功能化金纳米棒溶液中不同浸泡时间所得的纸基的sers信号响应，如图4所示。纸基的sers信号随着功能化金纳米棒浓缩倍数的增加而增强，但3倍与4倍浓缩量的差距不大，考虑成本效益选择优化条件为3倍的浓缩胶。此外，纸基的sers信号随着滤纸在功能化金纳米棒溶液中的浸泡时间的增加而逐渐增强，但24h和48h的强度差距不大，考虑时间效益选择优化条件为24h的浸泡时间。

经步骤三探索了功能化金纳米棒纸基的sers性能。以苏丹红iv为探针分子，分别考察了纸基对苏丹红iv的检测灵敏性，如图5所示，考察了纸基不同位点的sers重现性，如图6、7、8所示，考察了纸基在空气中随贮存时间的延长的sers稳定性，如图9所示。与传统的没有经过功能化修饰的金纳米棒纸基对比，功能化金纳米棒纸基对苏丹红iv表现出更好的灵敏性(lod为0.5μm)。纸基在50个不同位点检测所得的平均标准偏差均小于15％，重现性好。将其放置在空气中贮存90天，sers灵敏性仅降至60％，稳定性好。

实施例2

本实施例2将上述优化制备所得的功能化纸基应用于经过不同浓度苏丹红iv染色的血竭中药材进行分析检测。

步骤四：功能化金纳米棒纸基应用于血竭中药材违禁添加的苏丹红的检测

将步骤二得到的功能化金纳米棒纸基应用于血竭中苏丹红染料的检测，配制浓度为10^-3mol/l的苏丹红iv溶液作为母液，其它浓度则通过对母液进行稀释得到。量取20μl的相应溶度的苏丹红iv对血竭进行模拟染色，制备染色的血竭样本。把功能化纸基当成抹布，分别用三种不同试剂(乙醚、环己烷、丙酮)润湿的纸基轻轻擦拭血竭样本表面，简单提取血竭表面的苏丹红iv染料，通过拉曼检测得到sers光谱，对得到的sers光谱进行基线校正，分析功能化纸基对血竭样本中苏丹红iv的检测灵敏性。sers检测条件为积分时间5s，激光波长为633nm。

经步骤四，考察了不同润湿试剂对真实样品检测的影响，如图9所示，三种试剂分别为乙醚、环己烷、丙酮，润湿纸基后分别擦拭空白血竭以及染色血竭后检测sers光谱，如图10、11所示，发现乙醚和丙酮作为润湿试剂分别擦拭空白血竭和染色血竭表面检测得到的光谱之间无差异，说明乙醚和丙酮均不能实现对血竭中染料分子的有效提取。相反，以环己烷试剂润湿的纸基在空白血竭表面擦拭得到的sers光谱中几乎没有出现任何杂质干扰峰，而擦拭染色血竭后得到了丰富的sers信号峰，并与苏丹红iv图谱进行对比，特征峰基本一致，说明环己烷是一种合适的润湿剂，能最大程度减少真实样品的基质干扰，并且最大程度提高对真实样品中苏丹红iv分子的提取。此外，通过对不同浓度苏丹红iv染色的血竭样本进行sers检测，如图12所示，功能化金纳米棒纸基检测真实样品中苏丹红iv的检测限达到38.04ng/cm²。因此，本文建立的巯基环糊精功能化金纳米棒纸基适用于中药材中违禁添加苏丹红染料的灵敏性检测。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。