一种基于电化学探针检测还原型谷胱甘肽的方法与流程

本发明属于电化学传感器
技术领域：
，具体涉及一种还原型谷胱甘肽的检测方法。
背景技术：
：低分子量的巯基化合物(RSH)，如半胱氨酸(Cystine,Cys)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)具有还原性，在生物体内抗氧化防御系统以及蛋白质各种功能控制中起着非常重要的作用。半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，具有很多药用价值，可以缓解药物中毒，对放射线损伤也有防治效果；还原型谷胱甘肽本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。生物体内巯基化合物的定量检测十分重要。已报道的分析检测巯基化合物的方法有光学探针法，高效液相色谱法、电化学法、质谱法、毛细管电泳法等。在诸多检测方法中，由于电化学法具有简单的可操作性和灵敏性而更具有优越性。公开号为CN102914570B的发明专利，公开了一种基于纳米金和硫堇信号放大技术和电化学检测还原型谷胱甘肽的方法。公开号为CN103364464B的发明专利，公开一种用于还原型谷胱甘肽检测的光电化学传感器的检测方法，通过构建氧化亚铜/氧化锌异质结基光阳极，产生的光电流比氧化锌光阳极的提高77.3%。但检测灵敏度还需提高。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种基于电化学探针高灵敏度检测还原型谷胱甘肽的方法，检测限为0.05nmol·L-1；利用稀土铈(IV)作为电化学探针，基于Ce(IV)和GSH进行氧化还原反应，Ce(IV)转化为Ce(III)时有电化学信号的变化，建立一种电化学传感器技术检测还原型谷胱甘肽的方法。本发明所需要的稀土铈(IV)电化学探针为硫酸铈CeSO4·4H2O，涉及到的主要反应方程式为Ce(IV)+2GSHCe(III)(GSSG)+2H+。本发明电化学测试实验在CHI660D电化学工作站完成。工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为银/氯化银电极。本发明电化学测试为差示脉冲伏安法（DPV），实验条件是支持电解质为1.0mol/LNa2SO4，溶液pH值为6（用H2SO4和NaOH调节），测试温度为25℃。本发明控制Ce(IV)离子的浓度为10.0nmol/L，GSH的浓度分别为0.15，0.4，0.5，0.75，1.5，3.0，5.0nmol/L，使用DPV法分别测定其电流值的变化。电流值与所加GSH浓度成线性关系，通过计算得出GSH的检测浓度。本发明的电化学探针所用原料易得，反应条件容易控制，对还原型谷胱甘肽的检测灵敏度高，检测限为0.05nmol·L-1。选择性好，GSH与Ce(IV)反应后，电位由U1=0.680V变为U2=0.908V，而半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽与Ce(IV)反应后电位变化不明显。所述的检测琉基化合物的荧光探针可应用于化学体系中含琉基化合物的检测，并可发展应用于生物活细胞和活组织内的还原型谷胱甘肽的分析检测。本发明检测还原型谷胱甘肽的具体步骤如下：步骤一，探针储备溶液的配置准确称量CeSO4·4H2O，加入蒸馏水超声溶解，然后转入容量瓶中定容后，室温下配制成1.0mmol/LCe(IV)探针储备溶液。步骤二，测定探针离子对还原型谷胱甘肽的选择性将探针储备溶液用蒸馏水稀释，使最终探针离子的浓度为10.0nmol/L。而待测样品半胱氨酸(Cystine，Cys)、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH，GSSG）的浓度为5.0nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在电化学工作站(CHI660D)上，采用差示脉冲伏安法（DPV）进行测定电流-电压曲线。由实验数据可知，GSH与Ce(IV)反应后，电位变化加大，电流变化较大，而半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽与Ce(IV)反应后电压和电流没有明显变化，说明Ce(IV)对GSH选择性好。步骤三，测定探针离子对还原型谷胱甘肽的电流-浓度曲线将探针储备溶液用蒸馏水稀释。使最终探针离子的浓度为10.0nmol/L，谷胱甘肽（GSH）的浓度为0.15，0.4，0.5，0.75，1.5，3.0，5.0nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在电化学工作站(CHI660D)上应用DPV法进行测定，进而得到电流值对浓度变化的曲线，电流值与所加GSH浓度呈线性关系，线性方程为I(电流值)=28.5246+3.2432cGSH，其中线性相关系数R是0.9994，标准偏差是0.2177，检测限为0.05nmol·L-1。步骤四，已知浓度样品和实际生物样品中还原型谷胱甘肽的检测通过DPV法进行测定已知浓度的还原型谷胱甘肽样品和市售猪肝中的还原型谷胱甘肽（GSH），根据电流值和线性方程可计算出还原型谷胱甘肽的浓度，实现还原型谷胱甘肽的分析检测。本发明的优点和有益效果1、利用稀土铈(IV)作为电化学探针，基于Ce(IV)和GSH进行氧化还原反应，Ce(IV)转化为Ce(III)时有电化学信号的变化，建立一种电化学传感器技术检测还原型谷胱甘肽的方法。该方法电压响应值较大，具有良好的选择性，与其它含有巯基和二硫键分子无作用，具有较高的琉基检测灵敏度。2、探针分子容易购买，稳定性好，能够长期保存使用，可应用于生物体系的检测。附图说明图1是采用DPV法测得的10.0nmol/LCe(IV)探针溶液，分别与不同浓度的还原性谷胱甘肽（0.15~5.0nmol/L）反应前后电流-电压曲线，插图是在0.908V处，电流值与还原性谷胱甘肽的浓度的线性图。图2是采用DPV法测得的10.0nmol/LCe(IV)探针溶液，分别与5.0nmol/L半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽（GSH，GSSG）反应前后电流-电压曲线。具体实施方式下面结合附图和表格，对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明在CHI660D电化学工作站完成，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为银/氯化银电极。电化学测试为示差脉冲伏安法（DPV），实验条件是支持电解质为1.0mol/LNa2SO4，用H2SO4和NaOH调节溶液pH值为6.0，测试温度为25℃。一种基于电化学探针高灵敏度检测还原型谷胱甘肽的方法，具体包括以下步骤：步骤一，探针储备溶液的配置准确称量0.0202g的CeSO4·4H2O置于50mL的烧杯中加入30mL蒸馏水超声溶解，然后转入50mL容量瓶中定容后，室温下配制成1.0mmol/LCe(IV)探针储备溶液。步骤二，测定探针离子对还原型谷胱甘肽的选择性将探针储备溶液用蒸馏水稀释。使最终探针离子的浓度为10.0nmol/L。而待测样品半胱氨酸(Cystine，Cys)、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH，GSSG）的浓度为5.0nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在电化学工作站(CHI660D)上采用差示脉冲伏安法（DPV）进行测定电流-电压曲线，见图2；最大电流值和对应的电压值如表1所示。由表1知，GSH与Ce(IV)反应后，电位由U1=0.680V变为U2=0.908V，ΔU=0.228V，电流由25.15μA变为44.55μA，ΔI=19.40μA而半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽与Ce(IV)反应后电压和电流没有明显变化，说明Ce(IV)对GSH选择性好。表1Ce(IV)与巯基化合物反应前后电压电流及其变化值Ce(IV)Ce(IV)andCysCe(IV)andHcyCe(IV)andGSHCe(IV)andGSSGU(V)0.6800.6960.6720.9080.656ΔU(V)-0.016-0.080.228-0.024I(μA)25.1531.8923.3444.5511.90ΔI(μA)-6.74-1.8119.40-13.25步骤三，测定探针离子对还原型谷胱甘肽的电流-浓度曲线将探针储备溶液用蒸馏水稀释。使最终Ce(IV)探针离子的浓度为10.0nmol/L，谷胱甘肽（GSH）的浓度为0.15、0.4、0.5、0.75、1.5、3.0、5.0nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在电化学工作站(CHI660D)上应用DPV法进行测定，进而得到电流值对浓度变化的曲线，见图1；最大电流值如表2所示。电流值与所加GSH浓度的线性方程为I(电流值)=28.5246+3.2432cGSH，其中线性相关系数R是0.9994，标准偏差是0.2177，检测限为0.05nmol/L。表210.0nmol/L的Ce(IV)与不同浓度的GSH反应后电流值GSH浓度(nmol/L)0.150.40.50.751.535电流(μA)28.9629.5730.0531.1733.5138.5144.55步骤四，已知浓度和实际生物样品中还原型谷胱甘肽的检测通过DPV法进行测定1.0nmol/L的还原型谷胱甘肽（GSH）6次，其结果如表3所示，计算平均值为1.05nmol/L，偏差为5.0%，相对标准偏差为1.65%。通过DPV法进行测定市售猪肝中还原型谷胱甘肽（GSH）6次，其计算结果依次为4.61，4.63，4.74，4.66，4.69，4.75μmol/g，平均值为4.68μmol/g，相对标准偏差为3.17%。表310.0nmol/L的Ce(IV)与1.0nmol/L的GSH反应后电流值及计算结果电流(μA)31.8231.8531.6831.7531.8831.72GSH浓度(nmol/L)1.061.071.021.041.081.03当前第1页1 2 3