专利名称：基于纳米金和硫堇信号放大检测谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明属于电化学检测技术领域，特别涉及一种修饰电极的制备和一种信号放大技术的研制，在其应用上涉及谷胱甘肽含量的检测。
背景技术：
谷胱甘肽是细胞内存在最丰富的小分子硫醇类化合物。还原型谷胱甘肽(GSH)(下称谷胱甘肽)是细胞内非蛋白硫氢基团的主要组成部分，在活组织中具有多种重要的生理功能。它不仅有着很重要的生理作用，其在细胞中含量的变化还是某些疾病和癌症的直接反映。
电化学方法具有操作简单、灵敏度高、仪器设备简单等优点。
离子液体碳糊电极是一种把离子液体代替液体石蜡作为粘合剂而制成的碳糊电极，由于离子液体具有高的电子导电性、好的粘性、宽的电化学窗口，因此离子液体碳糊电极常作为电化学传感器的基底电极，它具有比传统的玻碳电极更好性能。
石墨烯具有热导系数高、机械强度好、载荷子流动性好、比表面积大等优点。
电化学沉积纳米金具有大的比表面积，提高电子传递能力的作用。
发明内容
本发明的目的是利用硫堇在金纳米粒子表面的吸附作用构建信号放大技术，以谷胱甘肽切割二硫键作用实现电化学方法高灵敏度测定谷胱甘肽。
本发明所提供的方法包括以下步骤
(I)以离子液体为修饰剂制备离子液体碳糊电极。
所述的方法，其所述的离子液体可为阳离子为季铵盐离子、季鱗盐离子、咪唑盐离子和吡咯盐离子；阴离子为卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子组成的离子液体，如I-己基吡啶六氟磷酸盐等。
(2)在氧化石墨烯溶液中利用恒电位沉积法在离子液体碳糊表面制得石墨修饰膜，然后以HAuCl4为原料，使用恒电位法电沉积金，即可得到纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极，得工作电极。
所述的方法，其所述的离子液体碳糊电极可为离子液体碳糊电极、金属电极、非金属电极或氧化电极。
(3)以L-胱氨酸(Cystine)或含有二硫键的物质和功能化的DNAl修饰磁性微珠，制备功能化磁性微珠，磁性微珠作为载体负载含二硫键的物质和功能化的DNAl。
(4)利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫键作用，将(3)中制备的功能化磁性微珠表面的DNAl切割下来，释放DNAl ;随后对释放出的DNAl进行测定，据此实现对谷胱甘肽的测定。
(5)利用(4)中释放出来的DNAl对纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极进行修饰，在电极表面形成捕获DNA，用于后续实验中去捕获电化学探针。
(6)电化学探针(EC probe)的制备。利用硫堇在纳米金表面的吸附作用，制备硫堇修饰的金纳米粒子，然后将DNA2负载其上，制备DNA2/硫堇/纳米金信号放大单元，即电化学探针。
(7)电化学检测。将DNAl/纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊工作电极浸入电化学探针溶液中，利用DNA杂交作用，DNAl将DNA2/硫堇/纳米金信号放大单元捕获在电极表面，引起电极表面电活性物质浓度的变化，据此实现对谷胱甘肽的检测。
所述的方法，其所述的离子液体碳糊电极可为离子液体碳糊电极、金属电极、非金属电极或氧化电极。
所述的方法，其所述的电活性物质为硫堇、联吡啶钌、亚甲基兰以及含正电荷的电活性物质。
图I为本发明的实验原理示意图。
图 2 为不同修饰电极在 I. Ommol L—1 [Fe (CN) 6] 3_/4_ 和 O. 5mol L—1 KCl 溶液中的循环伏安图。
图3为不同浓度目标物的差分脉冲伏安法曲线。从a到f谷胱甘肽浓度依次为 1.0X IO-12,1.0X IO-11,1.0X IO-10,1.0X IO-9,1.0X IO-8,1.0X 10_7mol L' 插图浓度的对数对峰电流的关系曲线。
具体实施例方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但本发明的实施方法不限于此。实例·
I本发明所用的试剂
①I-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6，>99%,中科院兰州化物所绿色化学与催化中心)石墨粉(上海胶体化学厂，颗粒度< 30 μ m) 氯金酸(HAuCl4，中国上海试剂一厂)；④乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，美国Sigma公司)； N_羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海延长生化公司)；⑥氨基磁珠(Aminated MB)(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；十二烷基磺酸钠(SDS，上海亨达精细化学品有限公司)；⑦铁氰化钾(天津市瑞金特化学品有限公司)L-胱氨酸(上海蓝季科技发展有限公司)；⑨谷胱甘肽、⑩巯基乙酸(上海蓝季科技发展有限公司)；O硫堇(中国上海试剂一厂)。
2不同种类的缓冲溶液如下①IXTEA缓冲溶液(40.0mmol/L Tris,I. Ommol /T, EDTA, 40. Ommol /I,醋酸，pH = 8. O),② 50. Ommol /T, Tris-HCl 缓冲溶液(pH =7. O), 50. Ommo I/LTri s-EDTA (TE, pH = 8. O);③实验用水为二次蒸馏水。
3 氧化石墨烯由改进的 Hummer 法(Hummers, ff. S. , Offeman, R. E. , 1958.J. Am. Chem. Soc. 80,1339)合成。
4①DNAl、②DNA2序列由上海生工生物技术有限公司购得，序列如下
4. I DNAl :3’ -NH2-CCA GCA AGT TGG AGT CTG-5，；
4.2 DNA2 :3’ -SH-CAG ACT CCA ACT-5’ ；
4. 3 DNAl和DNA2的系列优选为DNA1的3’端为氨基；其功能基团与磁珠上连接的L-胱氨酸的羧基实现DNAl的固定。DNA2的3’端为巯基；其功能基团与电极表面的金形成S-Au键实现DNA2的固定。DNAl的5’端与DNA2的3’端部分互补，实现杂交。
5电沉积法制备纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极
5. I离子液体碳糊电极制备。将3.2g碳粉、1.6g 1_己基吡啶六氟磷酸盐和500 μ L液体石蜡混合，80°C研磨均匀后将适量填入玻璃管中，接铜丝作为导线，使用时在称量纸上打磨至镜面。
5. 2石墨烯修饰离子液体碳糊电极制备
5. 2. I将新制备的离子液体碳糊电极浸泡在I. Omg/mL的氧化石墨烯溶液中，缓慢搅拌并通入氮气；
5. 2. 2在-I. 3V(vs. SCE)电还原600s，取出用二次蒸馏水充分冲洗后用N2吹干，即可在离子液体碳糊电极表面形成一层稳定的电化学还原石墨烯修饰膜，此修饰电极表示为石墨烯修饰离子液体碳糊电极。
5. 3纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极制备将新制备的石墨烯修饰离子液体碳糊电极在5. Ommol/L HAuCl4和O. 5mol/L KNO3混合溶液中于-O. 4V (vs. SCE)电位范围内使用恒电位法电沉积，即可得到纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极。用二次水冲洗该电极，用N2吹干后备用。
5.4 在室温(25°C 左右)下在含有 10. Ommol/L [Fe (CN)6]3* 和 O. 5mol/LKCl溶液中对电极进行表征。
6胶体金的制备
6. 2然后用二次水冲洗干净，烘干备用；
6. 3在IOOOmL圆底烧瓶中加入500mL，ImM的HAuCl4,搅拌加热至沸腾；
6. 4快速加入50mL，38. 8mM的Na3C6H5O7，再加热10分钟，搅拌15分钟，然后冷却至室温后用0. 8μπι的尼龙膜过滤器过滤，转移到棕色瓶中于阴凉处保存；
6. 5用扫描电镜观察胶体金的粒径为20_25nm。
7L-胱氨酸/DNAl修饰的磁性微珠制备过程如原理图所示，具体过程如下
7. I 取 2mL ICT3M 的 L-胱氨酸溶液，加入 ImL EDC+NHS 混合溶液(5. OmMEDC, NHS和10. OmM Tris-HCl缓冲溶液，pH = 7. 4)，以活化L-胱氨酸的-C00H,反应30分钟；
7. 2加入50 μ L氨基磁珠，37°C恒温下继续反应；
7. 3反应后的物质用PBS缓冲溶液洗涤三次，得到L-胱氨酸修饰的磁性微珠;
7. 4在L-胱氨酸修饰的磁性微珠溶液中加入200 μ L ICT6M的氨基化DNAl，恒温37°C下反应12h ；
7. 5反应后的物质用PBS缓冲溶液洗涤三次，得L-胱氨酸/DNAl修饰的磁性微珠。
8负载硫堇金纳米粒子探针的制备
8. I向巯基DNA2溶液中加入醋酸盐缓冲溶液(pH = 5. 2)和10 μ L磷酸三氯乙酯，反应lh，用以活化巯基；
8. 2取ImL上述8. I中刚合成好的新鲜的胶体金溶液，加入硫堇溶液，反应O. 5h，使硫堇充分吸附在胶体金上；
8. 4把混合物放在15000转的离心机中离心30分钟，得到红色沉淀；
8. 5把得到的红色沉淀用PBS缓冲溶液洗涤并离心，重复三次，用PBS缓冲溶液(pH = 8. O)分散，即得到DNA2/硫堇金纳米粒子探针，放在4°C下避光保存。·
9谷胱甘肽含量的检测
9. I取含谷胱甘肽的样品溶液50 μ L加入到DNA1/L-胱氨酸修饰的磁性微珠溶液中，反应12h，磁性分离，即得含有-SH的DNA上清液；
9. 2将5. O μ L上述10. I中的上清液滴涂在纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极表面，使其在室温下杂交20分钟后，依次用O. 5%的SDS溶液和二次水洗涤，即得到DNAl/纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极；
9.4电化学测定。以述9. 3所得电极为工作电极，利用差分脉冲伏安法在PBS缓冲溶液(pH = 8. O)中以100mV/S的扫速进行扫描，电位扫描范围为-O. 7-0. IV。
10结果与讨论
10. I纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极的电化学表征
10. I. I图2为离子液体碳糊电极，石墨烯修饰离子液体碳糊电极，纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极在I. Ommol Γ1 [Fe (CN) 6] 3_/4_和O. 5mol Γ1 KCl溶液中的循环伏安 10. I. 2曲线a上可以看到一对对称的氧化还原峰，峰电位差为98mV，这说明离子液体碳糊电极中的离子液体起到了很好的导电作用；
10. I. 3在石墨烯修饰离子液体碳糊电极上(曲线b)，峰电流明显增大、电位差明显减小为74mV，这是由于离子液体碳糊电极的表面高导电性的石墨烯修饰膜极大的增加了电子传递能力；石墨烯可以与离子液体的芳香环发生共轭效应，因此为电子从石墨烯膜到离子液体碳糊电极表面构建了快速电子传递的通道；
10. I. 4响应电流在纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极(曲线c)上继续增大，同时电位差减小为62mV，这是由于电极表面的纳米金和石墨烯层的协同放大效应。电化学还原石墨烯不仅可以增加修饰电极的导电性，同时还可以为纳米金的沉积提供更大的表面积，所以纳米金/石墨烯复合修饰膜可以减小[Fe(CN)6]3_/4_向电极表面转移电子的阻力；
10. 2标准曲线的绘制与样品的采集测定。
10. 2. I标准曲线的绘制。配制不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，测定其电化学信号，氧化峰电流与谷胱甘肽浓度的对数值成良好的线性关系，线性范围为1.0Xl(T12mol Γ1 I. 0Xl(T7mol Γ1，检测限为 4. I X l(T13mol L—1(如图 3)。
10. 2. 2样品的采集测定。
10. 2. 3培养小鼠急性淋巴细胞白血病细胞系p388，贴壁生长达到80%以上时，进行细胞液提取
I、贴壁培养细胞用2mL胰酶消化2_3分钟，倒掉胰酶，加入约5mL培养基，将细胞吹散使细胞悬浮，离心收集细胞；
2、在细胞中加入3mL 4°C预冷的PBS(pH7. 2,0. 01M)，洗涤细胞，离心，然后
弃去洗液，重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液；
3、细胞重新悬浮于 3mL PBS-EDTA 缓冲溶液中(PBSE，pH7. 4,0. 10M)，均质化后加入3%高氯酸以沉淀细胞中的蛋白物质，整个操作在冰上进行；
4、4°C下 14，OOOrpm 离心 5 分钟；
5、收集上清液用于，检测；
6、差分脉冲伏安法在PBS缓冲溶液(pH = 8. O)中以100mV/s的扫速进行扫描，电位扫描范围为-O. 7-0. IV ；·
7、在最佳实验条件下，对提取好的小鼠急性淋巴细胞白血病细胞系p388上清液(每份400μ 进行检测，测定含量为1.62X10-8mol/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、代替、组合、简化，较为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于纳米金和硫堇信号放大技术及其在测定谷胱甘肽的应用，其特征包括以下步骤 (a)以离子液体为修饰剂，制备离子液体碳糊电极； (b)以电化学还原石墨烯和纳米金共沉淀修饰离子液体碳糊电极； (c)以L-胱氨酸和DNA修饰磁性微珠； (d)利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫键作用，切割释放DNA； (e)以释放的DNA对纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极电极进行修饰； (f)以金纳米粒子和硫堇信号放大构建信号放大技术和谷胱甘肽切割L-胱氨酸作用，建立一种高灵敏度测定谷胱甘肽的新方法。
2.根据权利要求I所述，其特征在于(a)中以离子液体I-己基吡啶六氟磷酸盐为修饰剂制备离子液体碳糊电极。
3.根据权利要求I所述，其特征在于(b)中利用恒电位电沉积法制备金纳米金/石墨烯修饰电极。
4.根据权利要求I所述，其特征在于(c)中以L-胱氨酸或含有二硫键的物质和功能化的DNAl修饰磁性微珠,制备功能化磁性微珠。
5.根据权利要求I所述，其特征在于(d)中利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫键作用，将功能化磁性微珠表面DNAl切割下来，释放DNAl。
6.根据权利要求I所述，其特征在于(e)中利用释放的DNAl对纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极电极进行修饰。
7.根据权利要求I所述，其特征在于(f)中利用纳米金对硫堇的吸附作用，制备硫堇修饰的金纳米粒子，然后将DNA2负载其上，制备DNA2/硫堇/纳米金信号放大单元；利用DNA杂交作用，DNAl将DNA2/硫堇/纳米金信号放大单元捕获在电极表面，引起电极表面电活性物质浓度的变化，据此实现对谷胱甘肽的检测。
8.根据权利要求I所述，其特征在于工作电极为离子液体修饰碳糊电极、金属电极、非金属电极或氧化电极。
全文摘要
本发明实施例公开了一种基于纳米金和硫堇信号放大技术和电化学检测还原型谷胱甘肽(GSH，下称谷胱甘肽)的方法。以L-胱氨酸和DNA1修饰磁性微珠，利用谷胱甘肽切割L-胱氨酸二硫键作用将磁性微珠表面的DNA1切割释放下来；将释放出来的DNA1对纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极进行修饰。将DNA2负载在硫堇修饰的金纳米粒子表面得电化学探针。将DNA1/纳米金/石墨烯修饰离子液体碳糊电极浸入电化学探针溶液中，DNA1将DNA2/硫堇/纳米金信号放大单元捕获在电极表面，引起电极表面电化学探针浓度的变化，进行电化学测定。本发明利用纳米金和硫堇信号放大技术和电化学检测技术，实现了对谷胱甘肽高灵敏度测定。
文档编号G01N27/30GK102914570SQ20121020814
公开日2013年2月6日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者混旭, 孙伟, 朱欢欢 申请人:青岛科技大学