专利名称：增加谷胱甘肽的物质的筛选方法
技术领域：
01本发明涉及篩选可成为神经变性疾病，恶性肿瘤，感染病等
多种疾病治疗药的有效成分的、增加细胞内谷胱甘肽量的物质的方法。
背景技术：
已知若实验性地使神经细胞内的谷胱甘肽减少，则引起神经 变性(非专利文献2)。即使在实际的疾病中，已知在神经变性疾病(帕 金森病，阿尔茨海默病等)，恶性肿瘤，感染病等多种疾病中谷胱甘肽 减少，人们预想并希望如果有使谷胱甘肽增加的治疗药会非常有用(非 专利文献3-6)。但是，现在并不存在这种治疗药。已发现细胞膜中表达的EAAC1 (易刺激的氨基酸载体 -l，excitory amino acid carrier-l)是将谷氨酸摄入到细胞内的蛋 白质(谷氨酸输送蛋白质)，然而已知其作为谷氨酸输送蛋白质的能力 低，其它蛋白质(GLT-1，GLAST)作为谷氨酸输送蛋白质十分重要(非专 利文献7-8)。然后，发现EAAC1不仅具有输送谷氨酸还具有输送包括 半胱氨酸在内的其它氨基酸的能力(非专利文献9-11)。
05而且，最近发现E A AC 1是用于维持细胞内谷胱甘肽量所必需 的蛋白质(非专利文献12)。因此推想EAAC1具有输送谷胱甘肽的构成 氨基酸-谷氨酸和半胱氨酸的能力而对此有贡献。通过与对照细胞的结果比较，将使细胞产生显著低的 GTRAP3-18mRM表达量的待测物质鉴定为目的物质(使细胞内谷胱甘 肽增加的物质)。而且，通过寡核苷酸探针用放射性同位素(RI)法或非RI法标 识，但优选使用非RI法。作为非RI法，可以例举荧光标识法，生物 素标识法，化学发光法等，但优选使用荧光标识法。作为焚光物质， 可以适当选择可以和寡核苷酸的碱基部分结合的物质来使用，可以使 用花青色素(例如Cy DyeTM系列的Cy3， Cy5等)，若丹明6G试剂，N-乙酰氧基-W-乙酰氨基芴(AAF)， AAIF(AAF的碘衍生物)等。而且，作 为标识法，可以适当选择本领域公知的方法(例如随机引物法，Nick 翻译法，通过PCR进行的DM扩增，标识/加尾法，体外转录法等)来 使用。例如，可以通过在HRF寡核普酸中导入官能团(例如脂肪族伯氨 基，SH基等)，在这种官能团上结合前述标记，制成标识化寡核苷酸 探针。使用的引物组可以基于公知的GTRAP3-18cDNA序列，采用市 售的软件例如Oligo TM[National Bioscience Inc.(美国)制〗， GENETYX[软件开发(林)(日本)制]等设计，经合成'纯化各个步骤制备。通过在HEK293细胞中瞬间导入GTRAP3-18的反义寡核苷酸， 可以使细胞内的GTRAP3-18量减少(
图1)。接着，通过 ThioGlo-l (Calbiochem公司)测定细胞内谷胱甘肽量。通过western 印迹法确认了 GTRAP3-18量的增加。使用导入了有义寡核苷酸的细胞 作为对照组。另一方面， 一旦使甲基-环糊精(Me卩CD)作用于HEK293 细胞，则通过western印迹法确i人了 GTRAP3-18量比对照组有所增加 (图1)。此时，细胞内谷胱甘肽量与对照组相比，显著减少(图2)。
391此结果显示，通过使GTRAP3-18量增大，细胞内谷胱甘肽量减少。
40j根据以上结果，确认了以细胞内GTRAP3-18量的变化(或者 GTRAP3-18的功能变化)作为指标，可以探寻可以使细胞内谷胱甘肽量 增加的物质。
实施例2在小鼠的脑室中施用针对GTRAP3-18的siRNA(10 |i g/h) 。 1周 后，在海马细胞中，GTRAP3-18量与施加对照(緩沖液)时相比，显著减 少(图3)。同样，测定在小鼠脑室内施用针对EAAC1的siRM时的海马 细胞中的EAAC1量，确i/v了 EAAC1量通过该siRNA显著减少(图4)。
421然后，这样一来，测定使GTRAP3-18量和EAAC1量减少的 海马细胞中谷胱甘肽的量。即，将从海马組织中获得的提取液与含有 EDTA(乙二胺四乙酸)，GSH还原酶，DTNB(5，5， -二碌"代双-硝基苯曱 酸)，NADPH的反应溶液混合后，测定412nm的吸光度。用GSH标准溶 液的吸光度求出浓度后，用组织重量补正。
[431其结果示于图5,在使EAAC1量减少的小鼠海马细胞中谷胱 甘肽量比对照中少，在使GTRAP3-18量减少的小鼠海马细胞中谷胱甘
肽量相对于对照显著增加。
[44j另一方面，若在小鼠脑室中施用甲基-p-环糊精(MePCD)， 则海马细胞中的GTRAP3-18量比对照组有所增加(图6)，而此时，海 马细胞中谷胱甘肽量相较于对照组显著减少(图7)。
根据以上结果，确认了，即使以动物个体内的细胞作为对象，通 过以对于GTRAP3-18表达的效果作为指标，也可以筛选使谷胱甘肽量增 加的物质。
权利要求
1、一种筛选使细胞内谷胱甘肽量增加的物质的方法，其特征在于使待测物质与表达GTRAP3-18蛋白质的细胞接触，将使GTRAP3-18蛋白质的表达量减少、或抑制GTRAP3-18蛋白质功能的物质鉴定为目的物质。
2、 根据权利要求l的方法，所述细胞是动物个体内的细胞。
全文摘要
本发明提供一种用于筛选使谷胱甘肽增加的治疗药的有效成分的物质的方法，该方法是神经变性疾病，恶性肿瘤，感染病等疾病的治疗方法。该方法中，使待测物质与表达GTRAP3-18蛋白质的细胞相接触，将使GTRAP3-18蛋白质的表达量减少或者抑制GTRAP3-18蛋白质功能的物质鉴定为目的物质。
文档编号G01N33/15GK101421419SQ20078001309
公开日2009年4月29日 申请日期2007年4月26日 优先权日2006年5月2日
发明者中木敏夫, 渡部正彦, 青山晃治 申请人:学校法人帝京大学