重组核酸片段RecCR033208及其检测方法与流程

本申请涉及全基因组选择育种技术。具体而言，本申请涉及利用全基因组选择育种技术选育含有重组核酸片段的水稻植株，以及由此而获得的重组核酸片段及其检测方法。

背景技术：

长期以来，传统育种的选择方法主要依赖于田间表现型的评价，根据育种家个人经验进行取舍，其最大的缺点在于耗时长，效率较低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对基因型进行选择。随着分子生物技术的发展，分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能。近年来，已开始应用分子标记辅助选择方法来改良个别目标性状，能够显著的缩短育种年限。

三系杂交水稻具有稳产、高产等优势，是在细胞质雄性不育(即CMS，Cytoplasmic Male Sterility)基础上开发配套的恢复系、保持系和不育系。CMS恢复系主要有野败型(WA)CMS恢复系和红莲型(HL)CMS恢复系，以及粳稻包台型(BT)CMS恢复系(万建民等，2008)。上述3种类型中控制着育性恢复的关键位点之一就是Rf-1基因及其相邻区间，它包括了野败型CMS恢复基因Rf4(Tang等，2014)、包台型CMS恢复基因Rf-1(Rf1a)和Rf1b(Wang等，2006；Komori等，2004)、红莲型CMS恢复基因Rf5(Rf1a)(Hu等，2012)。

技术实现要素：

一方面，本申请提供了重组核酸片段，其选自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列1078-1865位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列262-901位核苷酸的序列 或其片段或其变体或其互补序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其变体或其互补序列；以及以上片段的组合。

在一实施方案中，所述重组核酸片段为基因组重组核酸片段。

此外，本申请提供了检测所述重组核酸片段的引物，其选自：(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列1-1078位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列1865-2067位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一组引物对与第二组引物对的组合，其包含(a)第一组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-1078位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1079-1864位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二组引物对：特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1079-1864位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1865-2067位核苷酸的序列的反向引物；(III)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第1077-1078位或第1078-1079位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第1864-1865位或第1865-1866位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第1077-1078位或第1078-1079位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1865-2067位核苷酸的序列的反向引物；(V)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第1-1078位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列第1864-1865位或第1865-1866位核苷酸的序列的反向引物；和/或任选地，(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列1-262位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列901-1437位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三组引物对与第四组引物对的组合，其包含(c)第三组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-262位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第263-900位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四组引物对：特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第263-900位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第901-1437位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第262-263位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别 包含SEQ ID NO:2所示序列第900-901位或第901-902位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第262-263位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第901-1437位核苷酸的序列的反向引物；(X)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第1-262位核苷酸的序列的正向引物和特异性识别包含SEQ ID NO:2所示序列第900-901位或第901-902位核苷酸的序列的反向引物。

在一实施方案中，用于扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对为，例如，5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，和5’-GAGGATGACGAGCCATTCGGTGA-3’。用于检测SEQ ID NO:1所示序列的测序引物为，例如，5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，5’-GATACGATGAATGCAGGGAA-3’，5’-GAGACGTAGCCCTTGGTGAT-3’，5’-CGAAGGAATCAAGGGCATAT-3’，5’-TCGGGTGCCTACATAGAATG-3’和5’-TTCTGGCGGAATCTGTAAT-3’。

在另一实施方案中，用于扩增SEQ ID NO:2所示序列的引物对为，例如，5’-ACCTTAACCGTCAATTACAGGA-3’，和5’-GGATTACACCGTTTCGCCACTT-3’。用于检测SEQ ID NO:2所示序列的测序引物为，例如，5’-TTTGAATCGAAGCGGACCAT-3’，5’-CAGGCGTCGTTAGAGGTTTT-3’，5’-ATCGAATGGGATGCTACAT-3’和5’-CGCACATATCTATTGCCTGA-3’。

另一方面，本申请提供了选育含有重组核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因组片段的水稻受体植物亲本作为轮回亲本，将其与含有目的基因组片段的水稻供体植物进行杂交，然后将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，再将所得到的回交种进行自交的步骤，其中利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择。例如，所述重组核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景选择的分子标记选自RfC10ID161、RfC10ID14和RfC10ID35中的一种或多种；和/或利用水稻全基因组育种芯片进行所述背景选择。

在一实施方案中，本申请提供的选育含有Rf-1基因组重组核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步骤：1)将轮回亲本与供体植物进 行杂交，再将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，获得回交一代，利用正向选择标记RfC10ID161和负向选择标记RfC10ID14、RfC10ID35对其进行Rf-1基因组片段的单侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE6K，对其进行背景选择；2)选择背景回复较好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)与轮回亲本再次进行回交，获得回交二代，利用正向选择标记RfC10ID161对其进行检测，选择含有Rf-1基因组片段的重组单株，然后利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE6K，对其进行背景选择；3)选择背景回复好的重组单株(此世代背景回复值超过87.5％)与轮回亲本又一次进行回交，获得回交三代，利用正向选择标记RfC10ID161和负向标记RfC10ID14、RfC10ID35对其进行Rf-1基因组片段的另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE60K，对其进行背景选择；以及4)选择导入片段小，且背景回复好的重组单株(背景回复值超过93.75％)，将选中的重组单株自交一次，获得自交种，利用正向选择标记RfC10ID161对其进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片，例如RICE60K，对其进行背景选择，最终获得含Rf-1基因组重组核酸片段纯合且背景回复(背景回复值超过99％)的水稻植株。

在另一实施方案中，利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物，包括：用于扩增分子标记RfC10ID161的引物对，其中正向引物为5’-TCATGTGATGAACATTAGCTGAGT-3’，反向引物为5’-CTTAGTCAATAGCGAGGACTCA-3’；用于扩增分子标记RfC10ID14的引物对，其中正向引物为5’-CGGCTCATCCATGTTGACTGACT-3’，反向引物为5’-ATGTTTGGGACGTGCGTGCAGAA-3’；以及用于扩增分子标记RfC10ID35的引物对，其中正向引物为5’-CACCAGCTAGAGCTAGGTTATTC-3’，反向引物为5’-CCTGTTTAGATTCGTGGTCCTGT-3’。

又一方面，本申请提供了检测重组核酸片段的方法，其包括根据如前所述的重组核酸片段设计特异性引物，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR扩增产物的步骤。具体地，例如，所述引物如前所述。可选择地，利用Sanger测序法分析PCR扩增产物。

具体而言，本申请提供的检测重组核酸片段的方法中，用于扩增 及检测SEQ ID NO:1所示序列的引物组合如下：扩增引物，包括正向引物：5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，反向引物：5’-GAGGATGACGAGCCATTCGGTGA-3’；测序引物，包括正向引物：5’-GAAGGCCAAGAAGGTCTGGGAGC-3’，正向引物：5’-GATACGATGAATGCAGGGAA-3’，反向引物：5’-GAGACGTAGCCCTTGGTGAT-3’，正向引物：5’-CGAAGGAATCAAGGGCATAT-3’，正向引物：5’-TCGGGTGCCTACATAGAATG-3’和反向引物：5’-TTCTGGCGGAATCTGTAAT-3’。所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID NO:1序列一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID NO:1所示同源重组片段。

另外，在本申请提供的检测重组核酸片段的方法中，用于扩增及检测SEQ ID NO:2所示序列的引物组合如下：扩增引物，包括正向引物：5’-ACCTTAACCGTCAATTACAGGA-3’，反向引物：5’-GGATTACACCGTTTCGCCACTT-3’；测序引物，包括反向引物：5’-TTTGAATCGAAGCGGACCAT-3’，反向引物：5’-CAGGCGTCGTTAGAGGTTTT-3’，正向引物：5’-ATCGAATGGGATGCTACAT-3’和反向引物：5’-CGCACATATCTATTGCCTGA-3’。所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID NO:2序列一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID NO:2所示同源重组片段。

通过检测确定了待测样品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含含有抗性基因的重组核酸片段。

此外，本申请还提供了检测重组核酸片段的试剂盒，其包括如前述的引物。

进一步地，本申请还提供了筛选含有重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段的步骤。在一实施方案中，采用如前所述的引物来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在另 一实施方案中，采用如前所述的检测重组核酸片段的方法来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在又一实施方案中，采用如前所述的试剂盒来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。

在又一方面，本申请提供了通过所述方法筛选得到的含有本申请公开的重组核酸片段的水稻植株或其种子。

本申请提供的基于全基因组选择育种技术的选育含有Rf-1基因组重组核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、准确、稳定的优势。仅通过五世代转育，即可仅将目标基因组片段导入受体材料，并同时实现背景的回复。本申请改良的受体材料为‘华占’，是中国水稻研究所培育的籼型常规水稻，具有分蘖力强配合力高等特点。利用上述方法，可以在保留‘华占’原有特性的情况下，提高对不育系金农2A等材料的恢复能力，扩大配组范围。同时，本申请提供的基因组重组核酸片段与育性恢复能力紧密相关，可作为基因资源应用于其他品种的培育。

附图说明

图1为本申请实施例1中CR033208水稻RICE60K全基因组育种芯片检测结果；其中，横坐标数字所指示方框依次表示水稻12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，灰色线条代表受体亲本‘华占’基因型，黑色线条代表供体亲本‘金恢3号’基因型，白色线条代表两亲本基因型一致即无多态性区段。图中第10号染色体黑色圆点处线条显示区段即为导入的Rf-1基因组重组核酸片段RecCR033208。

图2A和图2B为本申请实施例2中RecCR033208上游同源重组片段测序比对结果；图中所示星号代表比对结果中相同碱基，CR033208为获得的新品系，HZ为受体亲本‘华占’，JH3为供体亲本‘金恢3号’。

图3为本申请实施例2中RecCR033208下游同源重组片段测序比对结果；图中所示星号代表比对结果中相同碱基，CR033208为获得的 新品系，HZ为受体亲本‘华占’，JH3为供体亲本‘金恢3号’。

图4为本申请实施例2中RecCR033208两侧同源重组片段的结构图；其中，(A)为上游同源重组片段结构图；(B)为下游同源重组片段结构图，上方碱基为供体‘金恢3号’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘华占’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘华占’基因组区段，黑色区段为来源于‘金恢3号’基因组区段，白色区段为同源重组区段，横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。

图5为本申请实施例3中测配组合花粉I₂-KI溶液染色镜检结果：(A)测配组合金农2A/CR033208花粉I₂-KI溶液染色；(B)测配组合金农2A/华占花粉I₂-KI溶液染色。图中，黑色表示被I₂-KI溶液完全染色，为可育花粉；灰色表示被I₂-KI溶液不完全染色，属染败类型，为不育花粉；透明表示未被I₂-KI溶液染色，属圆败类型，为不育花粉。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

具体地，本申请涉及对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2进一步优化所得的核苷酸序列。该方法的更多细节描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。优化核苷酸序列可用于提高Rf-1基因 组重组核酸片段在水稻中的表达。

在一些实施方案中，本申请还涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的变体。一般来讲，特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

本申请还涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的1078-1865位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的262-901位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列。根据包含上述特定位点的片段，能够特异性地鉴定出相应的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。进一步地，通过鉴定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含含有抗性基因的重组核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以与水稻育种的所有植物品种。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

在本申请的方法可以适用于任何需要选育的水稻品种。也就是说，可以将任何缺少某种有利性状的优良品种(即综合性状较好，预计有发展前途的品种)用作轮回亲本。用另一具有该受体所缺少的有利性状的品种作为供体亲本，并且所提供的有利性状最好是显性单基因控制的。在本申请的实施方案中，采用水稻‘华占’作为轮回亲本，采用已被 证实具有特异育性恢复能力的水稻‘金恢3号’作为供体。

在本申请所提供的重组植株的选育方法中，利用分子标记对重组植株进行前景选择。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度，为提高选择的准确率，一般同时用两侧相邻的两个标记对目标基因进行跟踪选择。

在本申请的实施方案中，采用的前景选择标记包括正向选择标记和负向选择标记。在具体实施方案中，经优化筛选使用的正向前景选择标记是与目标基因组片段紧密连锁的标记RfC10ID161，负向选择标记是位于目标片段上游的标记RfC10ID14，以及位于目标片段下游的标记RfC10ID35。

在本申请的实施方案中，利用上述前景选择标记进行同源重组的检测时，一侧或单侧同源重组的判断标准是RfC10ID161检出与‘金恢3号’相同带型，且RfC10ID14或RfC10ID35检出与‘华占’相同带型；两侧或双侧同源重组的判断标准是RfC10ID161检出与‘金恢3号’相同带型，且RfC10ID14和RfC10ID35检出与‘华占’相同带型。

在本申请中，可以使用任何一种可利用的芯片进行本申请所提供的育种方法中的背景选择。在优选的实施方案中，可以采用本申请人在中国专利申请CN102747138A中公开的水稻全基因组育种芯片RICE6K，或者在PCT国际申请WO/2014/121419中公开的水稻全基因组育种芯片RICE60K。这两份申请文件中的全部内容整体并入本文作为参考。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本申请中所使用的水稻植株材料信息均可参见中国水稻品种及其系谱数据库(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申请中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

实施例1 选育导入Rf-1基因组片段的重组植株

本实施例中使用的材料为水稻‘华占’及水稻‘金恢3号’。

水稻‘金恢3号’具有特异育性恢复能力，并推测可能是第10染色体的Rf-1基因组片段对该材料的恢复能力起到了关键作用。

在重组植株的选育过程中，利用分子标记对重组植株进行前景选择，对所采用的前景选择分子标记进行了筛选。

使用Miseq测序技术对‘华占’和‘金恢3号’两个亲本进行全基因组测序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)试剂盒进行文库建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)试剂盒进行定量，使用MiSeq V2Reagent Kit(illumina)试剂盒进行测序反应。使用Miseq台式测序仪(illumina)进行检测。具体步骤及方法参见各试剂盒及测序仪使用说明书。选取第10号染色体18,340,000至19,390,000DNA序列进行比对分析，寻找碱基差异较大的位置，之后利用Premier 5.0软件在上述位置设计InDel标记共42对。通过PCR的方法，筛选上述引物对在‘金恢3号’及‘华占’中的多态性，最终挑选出在两份材料中具有多态性、扩增效率高的前景选择分子标记，分别是正向选择标记RfC10ID161和负向选择标记RfC10ID14、RfC10ID35。用于PCR扩增上述分子标记的具体引物信息见表1。

表1前景选择分子标记引物信息

将水稻‘金恢3号’中前述基因簇所在的基因组片段导入到水稻‘华占’中，具体过程如下：

以‘华占’为轮回亲本，‘金恢3号’为供体亲本进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本‘华占’进行回交，获得BC₁F₁种子，育苗后利用正向选择标记RfC10ID161和负向选择标记RfC10ID14、 RfC10ID35进行重组单株选择，筛选出52个在目标基因组DNA片段一侧同源重组的单株，即RfC10ID161检出与‘金恢3号’相同带型，且RfC10ID14或RfC10ID35检出与‘华占’相同带型，并利用水稻全基因组育种芯片RICE6K(CN102747138A)对其进行背景选择(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在筛选出的52个单侧同源重组单株中比较芯片结果，选择背景回复最好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)，使其与轮回亲本‘华占’再次进行回交，获得BC₂F₁种子，育苗后利用正向选择标记RfC10ID161对其进行检测，选择含有目标基因组DNA片段的重组单株，即RfC10ID161检出与‘金恢3号’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择。

选择背景回复较好的单株(此世代背景回复值超过87.5％)，使其与轮回亲本‘华占’又一次进行回交，获得BC₃F₁种子，育苗后利用正向选择标记RfC10ID161和负向标记RfC10ID14、RfC10ID35对收获的种子进行目标基因组DNA片段另一侧同源重组片段的筛选，获得6个在目标片段两侧重组的单株，即RfC10ID161检出与‘金恢3号’相同带型，且RfC10ID14和RfC10ID35检出与‘华占’相同带型。

利用水稻全基因组育种芯片RICE60K(WO/2014/121419)对上述6个双侧交换单株进行背景和目标片段选择(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，筛选到导入目标片段较小，且背景回复好的目标单株一个(此世代背景回复值超过93.75％)。

将选中的单株自交一次，获得BC₃F₂，育苗后利用正向选择标记RfC10ID161对其进行检测，选择含有目标基因组DNA片段的单株，即RfC10ID161检出与‘金恢3号’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择。

最终获得目标片段纯合，且背景回复(背景回复值超过99％)的株系一个，命名为CR033208。芯片检测结果见图1。

实施例2 导入Rf-1基因组片段后同源重组片段的确定

为了确定导入的育性恢复能力基因组片段大小，对‘华占’导入 片段的纯合单株进行了目标基因组片段两侧同源重组片段的测序。将CR033208所含的Rf-1基因组重组核酸片段命名为RecCR033208。

通过水稻全基因组育种芯片RICE60K检测结果初步确定，RecCR033208位于两个SNP标记F1018826255GT和R1019050984GT之间。

同时，使用Miseq测序技术对CR033208全基因组测序,方法见实施例1所示，对‘华占’、‘金恢3号’和CR033208三个样品的全基因组测序结果进行比对。

根据前述SNP芯片及Miseq测序结果，将RecCR033208上游同源重组片段定位在第10染色体的18832043bp到18834870bp区间，下游同源重组片段定位于19044989bp到19047257bp区间。

在此基础上，参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载对应区段DNA序列。使用Primer Premier 5.0软件设计扩增及测序引物，设计要求为引物长22nt左右、GC含量40-60％且没有错配。

以受体亲本‘华占’和供体亲本‘金恢3号’为对照，对RecCR033208上游和下游同源重组片段分别设计扩增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)进行扩增，使用两步法或三步法寻找最佳扩增条件，确保扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中显示为单一明亮条带。其中确定的上游同源重组片段扩增引物反应条件为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37个循环；20℃1min。下游同源重组片段扩增引物反应条件为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37个循环；20℃1min。由此，最终各筛选出一对扩增引物用于上游和下游同源重组片段的扩增。

另外，以扩增产物为模板，利用Sanger测序法进行测序，根据实际测序效果，最终各筛选出6条和4条测序引物分别用于上游和下游同源重组片段的测序。具体的扩增引物及测序引物序列见表2，测序结果见图2A、图2B和图3。

RecCR033208上游同源重组片段测序长度为2067bp(SEQ ID NO:1)。1-1078bp为受体‘华占’的基因组区段，与供体‘金恢3号’比较，存在3个SNP。1079-1864bp这一786bp区段为同源重组区段。 1865-2067bp为供体‘金恢3号’基因组片段，与‘华占’比较，存在3个SNP,1个Indel。

RecCR033208下游同源重组片段测序长度为1437bp(SEQ ID NO:2)。1-262bp为供体‘金恢3号’的基因组区段，与‘华占’比较，存在1个SNP，2个Indel。263-900bp这一638bp区段为同源重组区段。901-1437bp为受体‘华占’的基因组区段，与供体‘金恢3号’比较，存在5个SNP，1个Indel。

图4为RecCR033208两侧同源重组片段的结构图。其中，(A)为上游同源重组片段结构图；(B)为下游同源重组片段结构图。上方碱基为供体‘金恢3号’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘华占’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘华占’基因组区段，黑色区段为来源于‘金恢3号’基因组区段，白色区段为同源重组区段。横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。

表2 Rf-1基因组重组核酸片段扩增及测序引物信息

实施例3 ‘华占’导入Rf-1基因组片段后育性恢复鉴定

在水稻三系杂交系统中，不育系的细胞质会导致杂交F1代花粉不育，当恢复系中存在对应的恢复基因时，可使杂交F1代育性恢复、正常结实。CR033208与原品系‘华占’需要与相应的不育系‘金农2A’ 进行测配，观察杂交F1代育性，来测试两者育性恢复能力的差异。

1、杂交种子制备

2014年冬季在海南进行材料的种植，其中父本为改良品系CR033208和原品系‘华占’，测配母本为‘金农2A’。父本抽穗期间，母本选取盛花期植株，剪去已经开过的颖花，将已经成熟未开放的颖花喷水后逐粒剪去上部1/3的颖壳，不伤及柱头，套上纸袋。次日上午水稻盛花时段，剪取父本盛花的稻穗，从套袋顶端开口伸到母本稻穗的上方，充分抖粉，随后将套袋上口折合，注明父本编号和日期。20天后收获种子，完成两个测配组合金农2A/CR033208和金农2A/华占F₁代的制备，每个组合收获100粒左右种子。

2、F₁代种植

2015年夏季在武汉种植F₁代，上述两个F₁代杂交种分别种植24株，单株插秧，株距20cm，行距20cm，中间留走道40cm，常规栽培管理。

3、花粉育性考察

抽穗阶段，每个组合F₁代取5株，每株1穗。在穗上、中、下部各取成熟颖花1～2朵，每朵颖花剥取2～3枚花药，用镊子将花药在玻片上捣碎，用1％I₂-KI溶液染色后，置于100倍显微镜下观察花粉形态和染色程度。

I₂-KI染色镜检结果见附图5，(A)为测配组合金农2A/CR033208花粉I₂-KI溶液染色；(B)为测配组合金农2A/华占花粉I₂-KI溶液染色。图中，黑色为被I₂-KI溶液完全染色，为可育花粉；灰色为被I₂-KI溶液不完全染色，属染败类型，为不育花粉；透明为未被I₂-KI溶液染色，属圆败类型，为不育花粉。以可育花粉数/总花粉数×100％表示花粉育性，取5株平均值，考察结果见表3。

结果显示测配组合金农2A/CR033208花粉数目明显多于测配组合金农2A/华占，且前者的花粉育性明显高于后者，表明F₁代育性得到恢复。

4、自然结实率考察

每个组合F₁代灌浆结实20天后，各取5株，每株1穗，考察稻 穗的自然结实情况，以结实粒数/穗总粒数×100％表示自然结实率，取5株平均值，考察结果见表3。结果显示测配组合金农2A/CR033208自然结实率较测配组合金农2A/华占大幅提高，F₁代育性得到恢复。

表3 F₁代花粉育性及自然结实率考察结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。