检测黄曲霉毒素M1的核酸适配体、传感器、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及检测黄曲霉毒素m1的核酸适配体，本发明进一步涉及含有该核酸适配体的传感器及用其制备的检测黄曲霉毒素m1的试剂盒，本发明还涉及它们在检测黄曲霉毒素m1中的应用，属于黄曲霉毒素m1的检测领域。

背景技术：

黄曲霉毒素m1(afm1)是奶产品中毒性最强的霉菌毒素之一，对人类健康带来巨大的危害。afm1被世界卫生组织(who)国际癌症研究机构指定为1类致癌物。当奶牛采食了含有afb1的发霉饲料后，就会在牛奶里产生代谢物afm1。为了阻止由于污染的饲料和食品的召回带来的食品安全恐慌和经济损失，很多国家对afm1进行了限量。不同食品afm1的限量范围为0.05-0.5μgkg^-1。因此，为确保食品安全，开发简单，灵敏和特异性的afm1检测方法非常重要。

目前已有的黄曲霉毒素检测方法主要有：

定量检测afm1的液相色谱结合荧光检测器和液相色谱结合质谱技术，这些仪器检测方法需要专业的操作人员和昂贵的仪器设备。

一些快速免疫学方法如elisa，免疫传感器方法也得到了广泛的应用。但是在运输和贮存过程中抗体的稳定性难以保证限制了这类方法的应用。

与抗体有着类似功能的核酸适配体，具有低价格，高稳定性，易修饰和易合成等优点，可以重复使用和长时间保存。经体外筛选获得的核酸适配体能与目标物质高特异性地结合，因此被广泛应用于生物传感器检测领域。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种用于检测黄曲霉毒素m1的核酸适配体；

本发明的目的之二是提供一种检测黄曲霉毒素m1的核酸适配体传感器；

本发明的目的之三是提供一种含有所述核酸适配体传感器的用于检测黄曲霉毒素m1的试剂盒；

本发明的目的之四是将所述的核酸适配体、核酸适配体传感器以及试剂盒用于检测黄曲霉毒素m1，实现灵敏度高、线性范围宽、操作简单的检测黄曲霉毒素m1的效果。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供一种黄曲霉毒素m1核酸适配体，其为如下所示核苷酸序列：

5′-atccgtcacacctgctctgacgctggggtcgacccg-3′(seqidno:1)。

本发明还提供一种检测黄曲霉毒素m1的核酸适配体传感器，该核酸适配体传感器由以下四部分组成：

(1)dna序列a：由以下dna序列构成的dna模板：5′-ggtgtgacggatxaxb-3′；其中，xa和xb分别代表a个和b个任意碱基，a＝b＝20—30；

优选的，所述dna序列a为如下核苷酸序列：

5′-ggtgtgacggataatctggtttagctacgccttccccgtggcgatgtttcttagcgccttac-3′(seqidno:2)。

(2)dna序列b：seqidno:1所述的黄曲霉毒素m1核酸适配体，其中，在3’端修饰生物素；

(3)pcr引物1，所述pcr引物1的长度为20-30nt，且序列具有如下特征：5’-xc-3’，5’端的20-30个碱基与dna序列a的xb段互补配对；其中，x为任意碱基，c或b为碱基数量，c＝b＝20-30；

优选的，所述pcr引物1的核苷酸序列如下：

5′-gtaaggcgctaagaaacatcg-3′(seqidno:3)。

(4)pcr引物2，所述pcr引物2的长度为20-30nt，且序列具有如下特征：5’-xd-3’，5’端的20-30个碱基与dna序列a的xa段相同；其中，x代表任意碱基，a或d代表碱基数量，d＝a＝20-30。

优选的，所述pcr引物2的核苷酸序列如下：

5′-aatctggtttagctacgccttc-3′(seqidno:4)。

本发明所述黄曲霉毒素m1核酸适配体传感器通过混合上述四种组分进行组装即可获得。

本发明还提供一种检测黄曲霉毒素m1的试剂盒，该试剂盒包括以下组分：

(1)pcr管修饰溶液；

(2)传感器溶液；

(3)pcr体系溶液；

(4)黄曲霉毒素m1提取溶液；

其中，所述pcr管修饰溶液包括以下组分：戊二醛溶液、碳酸盐缓冲液、链霉亲和素；其中，所述戊二醛溶液、碳酸盐缓冲液的浓度分别优选为0.8％、0.01m，链霉亲和素的浓度优选为2.5-5ngml^-1，进一步优选为2.5ngml^-1。

所述传感器溶液包括以下各组分：

所述黄曲霉毒素m1核酸适配体传感器、pbst缓冲液、杂交缓冲液、tris缓冲液；其中，所述传感器溶液中dna序列a的浓度优选为1×10^-3-10nm，进一步优选为10nm；所述传感器溶液中dna序列b的浓度优选为5-40nm，进一步优选为10nm；所述传感器溶液中pcr引物1和pcr引物2的浓度优选为5-20μm，进一步优选为10μm。

所述的pcr体系溶液，可以为商购dna聚合酶时所带的反应液，也可以为根据反应原理配制而成的反应液，其中包括以下组分：sybrgreen染料，taqdna聚合酶，pcr缓冲液，dntp，水。

所述黄曲霉毒素m1提取液可以为任意能溶解黄曲霉毒素m1的溶液，优选为甲醇溶液，所述甲醇溶液的浓度可以根据需要确定，例如，可以为70％甲醇溶液。

进一步，本发明提供了所述试剂盒检测黄曲霉毒素m1的方法，包括以下步骤：

(1)将含有黄曲霉毒素m1的待测样品与黄曲霉毒素m1提取液混合，涡旋震荡，离心并取上清液；

(2)将所述上清液与传感器溶液混合并孵育；

(3)弃去步骤(2)所述混合液，并用tris缓冲液洗脱；

(4)加入pcr体系溶液，经定量pcr检测荧光信号。

优选的，步骤(1)中所述待测样品与黄曲霉毒素m1提取液的重量比为1:3—1:100。

步骤(2)中所述孵育的温度优选为45℃，孵育时间优选为1h。

所述pcr体系溶液可以根据商购聚合酶时的使用说明确定。

本发明的试剂盒采用定量pcr法，其检测原理如下：

首先利用pcr管修饰溶液将pcr管表面修饰上链霉亲和素；将生物素修饰的黄曲霉毒素m1核酸适配体与pcr管表面修饰的链霉亲和素结合，从而将黄曲霉毒素m1核酸适配体固定到pcr管表面；将dna序列a与黄曲霉毒素m1核酸适配体dna(b)通过互补组装成传感器。样品中游离的黄曲霉毒素m1与黄曲霉毒素m1核酸适配体dna(b)特异性结合，使得dna序列a从pcr管表面脱落，释放到溶液中，从而触发传感器，通过pcr技术扩增得到信号的放大。如果样品中游离的黄曲霉毒素m1量多，则脱落下来的dna序列a多，pcr管表面剩余的dna序列a少，则需更多的循环数才能达到荧光阈值。反之，则少。设置不同浓度梯度的黄曲霉毒素m1标准品，通过上述方法检测出信号，将检测不同浓度的黄曲霉毒素m1得到的信号做成标准曲线，实际样品中的的黄曲霉毒素m1浓度可通过对比标准曲线得到。

本发明所述的黄曲霉毒素m1核酸适配体、所述黄曲霉毒素m1核酸适配体传感器和所述试剂盒可应用于检测黄曲霉毒素m1。

本发明使用核酸适配体作为识别单元，具有选择性好的特点。采用本发明的核酸适配体制备的传感器测定黄曲霉毒素m1灵敏度高，使用pcr技术作为信号转导进行信号放大，大大的降低了检测限，可达0.03ng/l。

本发明中，所述pcr是指聚合酶链反应(polymerasechainreaction)，该术语的含义和技术步骤为本领域技术人员公知。

附图说明

图1本发明核酸适配体传感器检测黄曲霉毒素m1的原理图。

图2定量pcr检测黄曲霉毒素m1的标准曲线。

图3定量pcr检测黄曲霉毒素m1的扩增曲线。

具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

本发明中的pcr体系溶液中premixex和roxreferencedyeii(50×)反应液均为商购。

实施例1传感器溶液的制备

将dna序列a和dna序列b反应液混合。其中，dna序列a、dna序列b的浓度均为10nm。

其中，dna序列a的序列为：

5′-ggtgtgacggataatctggtttagctacgccttccccgtggcgatgtttcttagcgccttac-3′。

dna序列b的序列为：

5′-atccgtcacacctgctctgacgctggggtcgacccg-biotin-3′。

制备pcr体系溶液：

将pcr引物1、pcr引物2、premixex和roxreferencedyeii(50×)反应液混合；其中，pcr引物1、pcr引物2的浓度均为10μm。

其中，pcr引物1的序列为：

5′-gtaaggcgctaagaaacatcg-3′。

pcr引物2的序列为：

5′-aatctggtttagctacgccttc-3′。

实施例2制作标准曲线

50μl0.8％戊二醛溶液处理pcr管37℃5h；超纯水洗三次之后，添加0.01m碳酸盐缓冲液溶解的链霉亲和素50μl孵育2h(37℃)；

磷酸盐缓冲液洗两次之后，适配体和互补dna1:1(v/v)充分混合，50μl的混合物添加到每个管中孵育1h(37℃)；

杂交缓冲液洗三次，50μl不同浓度梯度(浓度分别为0.1ng/l、1ng/l、0.01μg/l、0.1μg/l、1μg/l)的黄曲霉毒素m1标准品；

tris缓冲液洗三次之后添加pcr体系溶液，经定量pcr检测荧光信号，制作标准曲线，所制作的标准曲线见图2。

实施例3检测样品中黄曲霉毒素m1的含量

称取0.5g被检测样品，加入2.5ml0.05ngml^-1黄曲霉毒素m1标准溶液与其充分混匀，然后加入2.5ml70％甲醇。混合物涡旋震荡5min后于10000g离心10min。收集上清液氮吹浓缩至0.5ml。加入2ml5％甲醇复溶；定量pcr检测荧光信号。

定量pcr检测黄曲霉毒素m1的扩增曲线见图3，根据实施例2测出的标准曲线，确定检测样品中黄曲霉毒素m1的含量为0.045ngml^-1。

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<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>检测黄曲霉毒素m1的核酸适配体、传感器、试剂盒及应用

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