多肽和含有重组病毒载体的核酸搬运体的制作方法

专利名称：多肽和含有重组病毒载体的核酸搬运体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗中使用的，含有重组病毒载体的核酸搬运体。
背景技术：
在基因治疗的临床应用中，为了有效、安全的将药物基因导入靶细胞中，开发研制最适宜的基因形态和方法已成为重大技术课题之一。
1980年初期，试应用了微型注入器等物理方法，还不能为疾病治疗，安全有效地导入新需要的药物基因，更没有临床应用。后来，为有效地将药物基因导入细胞，开发了形成载体的重组病毒载体，一开始就能将基因治疗应用于临床。在美国，直到1998年4月由NIH重组DNA委员会(RAC)承认了212基因治疗协议书，将先天性免疫不全症、家族性高胆固醇血症、囊胞性纤维症等遗传性疾病和各种癌症作为对象，已对2000名以上患者进行了临床试验(Hum.Gene Therapy，92143-2161，1998)。
使用现在临床中使用的重组病毒载体，不可能将药物基因导入所有的靶细胞中。为此，例如进行了如下治疗法(US5399346)(exvivo基因导入法)，即在将血液细胞作为对象的治疗法中，从生物体中一次分离出靶血液细胞，在试管内进行基因导入后，再返回到生物体内。然而，使用这种方法，仍存在基因导入效率低(Dunbar，C.E.，等人，Blood 85，3048-3057，1995)，需要数次基因导入作业，必然产生基因导入效率化的问题。
另一方面，作为提高这种重组病毒载体的基因导入效率的方法，进行如下尝试，即，将可与病毒载体形成复合体的物质与病毒相互作用，可有效将基因导入目的细胞内。作为实例，有将1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Morgan，J.R.，等人，Biotechnol Prog.，10，441-446，1994)、聚乙烯亚胺(Meunier-Durmort C.，等人，Gene Therapy，4，808-814，1997)、阳离子性核蛋白体(Hodgson C.P.，和Solaiman F.，Nature Biotechnol.，14，339-342，1996)、合成多氨基酸(Curiel D.T.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，88，8850-8854，1991)等与病毒载体形成复合体，用作载体的方法。
然而，由于1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、聚乙烯亚胺是生物体中不存在的物质，难以向生物体内给药。关于阳离子性核蛋白体，据报导由调制核蛋白体时的组成形成很高的毒性(YagiK.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.196，1042-1048，1993)，所以必须注意。再有合成聚氨基酸，特别是聚赖氨酸，当增加浓度时很容易产生沉淀，实际上对疾病治疗难以使用。当将含有产生沉淀粒子的药液注入到静脉内时，很容易引起血管的栓塞和血栓等问题，即使局部注射，也存在注射针堵塞的问题，为对靶细胞进行治疗不能导入所需量基因等问题。
发明公开本发明的目的是为有效且安全地将药物基因导入细胞内而提供一种核酸搬运体。
本发明者为解决上述课题，经过深入研究结果发现使用含有由二氨基丁酸和/或其药学上允许的盐形成的多肽，和重组病毒载体的核酸搬运体，可有效、安全地将药物基因导入细胞内，并至此完成了本发明。
即，本发明提供了含有由二氨基丁酸和/或其药学上允许的盐形成的多肽，和重组病毒载体的核酸搬运体。
本发明提供的上述核酸搬运体，其特征是含有嵌段共聚物，而该嵌段共聚物由多肽和聚乙二醇形成，而所说的多肽是由二氨基丁酸和/或其药学上允许的盐所形成。
进而，本发明提供的上述核酸搬运体，其特征是上述多肽是由残基数为20～280的二氨基丁酸和/或其药学上允许的盐所形成。
本发明提供的上述任何核酸搬运体，其特征是上述重组病毒载体含有药物基因。
本发明提供的上述任何核酸搬运体，其特征是上述重组病毒载体是HIV载体。
再有，本发明提供的上述核酸搬运体，其特征是上述HIV载体是与VSV-G的假型HIV载体。
进而根据本发明提供一种重组病毒载体的基因导入效率改进剂，以二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽作为有效成分。


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图1是本发明的二氨基丁酸和其药学上允许盐的合成过程的一例示意图。
图2是构成本发明重组病毒载体的辅助质粒pCMV-R8.2构造的模式图。
图3是构成本发明重组病毒载体的供给VSV-G用质粒pMD.G构造的模式图。
图4是构成本发明重组病毒载体的载体质粒pHXCAGEGEP构造的模式图。
图5是本发明的核酸搬运体的利用GFP/HIV载体/PDBA复合体导入EGFP基因的结果示意图。
图6是本发明的核酸搬运体的GFP/HIV载体/PDBA复合体的稳定性试验结果示意图。
实施发明的最佳形态以下对本发明构成和最好实施形态进行详细说明。
(由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽)本发明的由二氨基丁酸形成的多肽是具有以式(1)表示的(其中n为自然数)构造。但也可含有其他任意的单体单元。 本发明的由药学上允许的二氨基丁酸盐形成的多肽是具有以式(2)表示的(其中n为自然数)构造，但也可以含有其他任意的单体单元。 本说明书中使用的所谓「由二氨基和/或其药学上允许盐形成的多肽」也可以是具有以任意比率含上述2种构造的构造。即，也包括以任意比率，以聚二氨基丁酸、或其药学上允许盐形成存在的。
在上述二氨基丁酸中可存在光学异性体的D体和L体，但本发明的由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽，是含有D体、或L体、或二种任意混合的多肽、即，含有聚-L-二氨基丁酸、聚-D＝二氨基丁酸、和聚-DL-二氨基丁酸中任何一种的多肽。本说明书中使用的所谓「由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形的多肽的残基」是指形成该多肽的单体的二氨基丁酸(或其药学上允许的盐)基，其残基数是指这些分子的数(即，上述式中的n表示的)。本发明的由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽的最佳残基数，至少在10个以上，更好在20个以上，最好在25个以上。本发明的由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽的最佳残基数，更好在280个以下，最好在250个以下。残基数太多时，难以合成，处理也不方便。而太少时，作为核酸搬运体，其性能不充分。最佳的残基数，可根据所用重组病毒载体，从同时使用所得成分的性质等进行适当选择。
药学上允许的二氨基丁酸盐，在将本发明的核酸搬运体给药对象时，不能呈现毒性，或者呈现允许程度毒性的盐类，对此没有特殊限定。好的有盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸盐、醋酸、丙酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、丙二酸、富马酸、苹果酸等有机酸盐，这些中特别好的是醋酸盐。
若将由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽形成二氨基丁酸·醋酸盐，由于二氨基丁酸·醋酸盐的分子量为160，所以上述的残基数也可以用分子量表示。
本发明的由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽(以下也称作「本发明的多肽」)另一实例，包括使上述说明的由二氨基丁酸形成的多肽进一步与聚乙二醇结合的具有嵌段共聚物构造的，并以式(3)表示(其中、m、n分别为自然数)。 上述多肽由于具有1个羧酸基，对于具有上述块述共聚物构造的，也可以是以式(4)表示的(其中，m、n、n′分别为自然数)。 此处关于乙二醇的分子量(或数m)没有特殊限制，但从下述理由，通常最好是200～25000。
作为本发明的一种实施形态，也可以将组织特异的配位体与本发明的多肽结合。含有这种多肽的本发明核酸搬运体，对于组织特异的核配位体能很有效地进入特异特定组织内。例如，将肝脏作为靶时，将糖类(半乳糖、乳糖、酸异式糖蛋白、贫半乳糖、透明质酸等)与本发明的多肽结合时，可提高对肝脏的亲和性，可更有效地将本发明的核酸搬运体送达到肝脏。
将减轻细胞毒性、血中滞留、提高向溶剂的溶解性作为目的，作为本发明的多肽采用以式(3)或式(4)表示的、二氨基丁酸和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物最好。这种情况，使用PEG的分子量在200以上为理想的，更好使用1000以上的。PEG的分子量在2500以下是理想的，但更好在10000以下，最好在5000以下。PEG的分子量在25000以上时，由于和细胞表面的亲和性降低，而引起导入核酸(基因)效率的降低，在200以下时，作为目的，由PEG产生的效果很小，不理想。
(本发明的多肽合成方法)将具有上述说明的构造作为特征，关于本发明的多肽合成方法，没有特殊限制。最好使用包括通常公知的各种多肽合成方法(新实验化学讲座19高分子化学I1980年发行、丸善株式会社)在内的有机化学反应。
更具体讲，本发明中，最好是通过适当反应将单体成分进行聚合获得。这时，作为使用的单体，最好使用二氨基丁酸、在γ氨基上导入保护基的二氨基丁酸、或者，为形成肽基而具有活性化氨基和/或羧酸基的二氨基丁酸。本发明中，为了保护γ氨基、而且易于结合形成肽，最好将二氨基丁酸形成酸酐化(新实验化学讲座19高分子化学I1980年发行、丸善株式会社)。
在聚合这种单体时，可使用各种类型的适量引发剂。具体讲可使用各种胺化合物、醇化合物。对于上述胺化合物，有烷基胺类、最好是丁胺。作为醇类，使用聚乙二醇类时、可得到附加有聚乙二醇基的本发明多肽(即，由二氨基丁酸和聚乙二醇的嵌段共聚物形成)。
图1中示出了在本发明多肽的合成中，最好的合成过程。即，使用适当的保护基保护γ氨基，而且用光气将将部分氨基酸形成酸酐，最好用作缩聚单体(图1的(10))。使用这种单体，，缩合反应可使用适当的引发剂，可导入最佳数的单体数。对于引发剂没有特殊限制，较好使用各种胺化合物，更好使用丁胺。通过将适当的乙二醇类用于引发剂，同样是具有最佳数单体的多肽，而且能获得具有乙二醇基的嵌段共聚物。
具体讲，按照Helv.Chlm.Acta，43，270-279(1960)或「新实验化学讲座19高分子化学I1980年发行、丸善株式会社」中记载的方法，或者作为基准进行。
(本发明的多肽检测)本发明的多肽构造是具有上述说明的特征的。因此，根据这种构造上的特征，可以检测本发明的由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽。本发明的多肽本身，或使用它的核酸搬运体，或基因治疗用组合物，以各种使用形态使用时，通过实施适当的前处理，同样可检测本发明的多肽。本领域人员很容易选择必要的前处理。
关于检测方法没有特殊限制，可使用公知的各种多肽分析方法(Young H.C.，等人J.Controlled Release，54，39-48，1998)。具体讲，可以使用肽的氨基酸分析方法对二氨基丁酸的定性和定量分析、使用各种液相色谱测定分子量以确定残基数，检测聚乙二醇基存在的光谱分析(红外线吸收光谱、核磁共振吸收光谱)、质量分析、或化学的定性分析方法。
(重组病毒载体)本发明的重组病毒载体，可以DNA或RNA病毒为基础制作，并不限于来自这些的病毒种，也可以是MoMLV载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、AAV载体、HIV载体、仙台病毒载体等任何病毒载体。如果具有病毒治疗效果，具有人类以外的宿主域病毒也可以用作病毒载体。
作为本发明的重组病毒载体，最好使用HIV载体，将导入了HIV载体的核酸植入染色体内，可在长时间内发现该核酸的药物基因。HIV载体可以是向细胞表面分子的CD4阳性T细胞有选择地导入基因。HIV载体在没有细胞分裂的静止期内，也能植入染色体内，所以若使用下述的假型HIV病毒载体，可在骨髓干细胞、造血干细胞、神经细胞、肌肉细胞等静止期内，向任何一种细胞可有效地导入药物基因。
将病毒载体的构成蛋白质群中的一个置换成异种病毒的构成蛋白质的或者，将构成基因信息的核酸配列中的一部分置换成异种病毒的核酸配列的，假型病毒载体也可用作本发明的重组病毒载体。例如，有将HIV外皮蛋白质的EnV蛋白质置换成小水痘性口内炎病毒(Vesicular stomatitisvirusVSV)的外皮蛋白质的VSV-G蛋白质的假型病毒载体(NaldiniL.，等人.，Science272，263-267，1996)。
以下关于本发明中使用的重组HIV载体及其制造方法作详细说明。
即，调制含有HIV的gag、pol、env基因的，缺少包装信号的基因组，通过公知的基因操作方法，将细胞肥大病毒(CMV)的启动子配置在其上游的基因构筑物，插入到含有与耐氨必西林性基因一起复制的SV40开始点的表达载体中，构筑成辅助质粒(pCMV-R9)。进而，利用公知基因操作方法，使pCMV-39的env基因缺损一部分，构筑成未表达EnV蛋白质的pCMV-R8.2。上述基因组含有HIV-1、HIV-2、和猿猴免疫不全病毒(SIV)、猫免疫不会病毒(FIV)等，也可以哺乳类的免疫不全病毒基因组配列为基础构筑。辅助质粒和表达VSV-G蛋白质的质粒pMD.G、进而和以下所示载体质粒共转染成细胞，可调制成将VSV-G作为外皮蛋白质的假型重组HIV病毒载体。
通过从辅助质粒除去包装信号，可减少确保RCR(Replication competentretrovirus)的出现，通过将Env蛋白质置换成VSV-G蛋白质，也可以向没有表达CD4的细胞中导入基因(NaldiniL.，等人.，Science 272，263-267，1996)。
进而，为了构成HIV，除了必须的gag、pol、env基因之外，也可以任意缺损1个或1个以上的vif、vpr、vpu、tat、rev、nef基因，或者与它们相当的辅助基因，以提高安全性。为了发现HIV基因，所用的启动子并不仅限于CMV，例如，也可使用CAG、RSV、TK、SV40、SR-α、β-actin、EF1-α等启动子。
例如，利用疱疹病毒、B型肝炎病毒等病毒性增强蛋白质，或NFK-B、SP-1等细胞性转印活性化蛋白质，也可给药增强启动子的增强配列，将这些蛋白质进行编码的质粒进行共转染也可制成重组HIV载体。调制重组HIV载体的细胞，若是能产生HIV蛋白质的细胞，可使用任何体系的细胞。较好是哺乳类动物细胞系，例如，有将CV-1、Hela、Raji、RD、SW480、CHO、COS、293细胞、SV40large T抗原进行变性的293T细胞等。特别好是COS、293T细胞，最好是293T细胞。
包装在HIV病毒粒子中，随后，用靶细胞逆转印，植入染色体，为了发现药物基因，所需要的断片，按如下顺序从5′末端到3′末端方向HIV-LTR(Long-Terminal-RepeatsU3、R、U5领域形成)、包装信号、表达药物基因的任意启动子、药物基因和HIV-LTR。利用公知的基因操作方法，将配置这些的基因构筑物，例如，插入含有与耐氨必西林性基因复制的SV40开始点的表达质粒中，构筑成载体质粒。因此，上述载体质粒以含有HIV-1、HIV-2、和猿猴免疫不全病毒(SIV)、猫免疫不全病毒(FIV)等的哺乳类的免疫不全病毒的基因组排列为基础构筑。
根据需要，可向药物基因给药聚腺苷化信号。对于表达药物基因的任意启动子没有特殊限定，例如，可以使用CAG、CMV、RSV、TK、SV40、SR-α、MBP、β-actin、EF1-α等启动子。药物基因和表达它的启动子5′末端的LTR，可以使用将LTR的U3区域。例如置换成CAG、CMV、RSV、TK、SV40、SR-α、MBP、β-actin、EF1-α等启动子的嵌合体型LTR。
利用磷酸钙法、使用各种阳离子性脂质的脂转染法、或电穿孔法等公知的方法，将这种构筑的质粒，例如转染成COS细胞。
为了有效地制作重组HIV载体，在适宜所用宿主细胞的温度下，将感染细胞培养24～72小时，至少培养48小时以上更好。
排出培养上清液的重组HIV载体，以2000rpm将培养上清液离心10分钟，或者，使用孔径为0.45μm的过滤器，除去来自宿主细胞的夹杂物，调制成重组HIV载体溶液。进而，利用密度梯度离心法，PEG(Polyethylene glycol)沉淀法，或硫酸纤维素柱、亲和性柱等柱法，也可除去夹杂物。
(药物基因)插入本发明重组病毒载体中的药物基因、和其他的基因，由各种核酸和/或病毒核心的衍生物形成，它们的种类、分子量、形状、配列等没有特殊限制。
例如，核酸的形状，可以使用单链基因、双链基因、3链基因、DNA、RNA、DNA/RNA嵌合型基因、偶磷硫酸型基因、直链状基因、环状基因等，没有限制。在上述重组病毒载体内编码的基因排列，除了药物基因外，还有为转印药物基因的启动子和增强体、聚A信号、为标识和/或选择导入基因的细胞的标识基因、为在细胞的基因组DNA排列内很好插入基因的来自病毒的基因排列，为使以药物起作用的物质向细胞外分泌和/或滞留在细胞内局部处的信号排列等，可使用任何排列。
药物基因可使用与病患相对应的基因、即对病患起抗拒作用的基因和补足病患中欠缺的基因。例如有细胞分裂素类、成长因子、抗体或抗体断片、与细胞分裂素或成长因子相对的受体、具有防增殖作用或抑制细胞增殖作用的蛋白质、酵素、脉关系制剂、血检诱发物质、和凝集抑制剂、具有溶解血纤维作用的蛋白质、病素包涂蛋白质、细菌性抗原和寄生动物性抗原、肿瘤抗原、在血液循环中有效果的蛋白质、肽激素、和像核酶和反意义RNA一类的核糖核酸，对从以上中选出的药理活性化合物进行编码的基因。
作为对特定病患有代表性的基因，对于炎病性病患，有SOD、抗炎症性的细胞分裂素类、对细胞接合因子起抗拒作用的肽进行编码的基因；对于酵素缺损症有将正常酵素进行编码的基因；对于受容体缺损症，有将正常受容体进行编码的基因；对于病毒感染症，有将为杀伤病毒感染细胞的胸苷激酶、白喉毒素等毒进行编码的基因和阻碍病毒复制等的反意义、三股螺旋、核酶、假、反式显性突变种等进行编码的基因；对于癌症，有为杀癌细胞的胸苷激酶、白喉毒素等毒素进行编码的基因和为使癌基因惰性化的反意义、核酶、三股螺旋等进行编码的基因、为使癌细胞正常化的P53等癌抑制基因、将关于对抗癌剂的多剂耐性的基因形成惰性化的反义、三股螺旋、核酶等进行编码的基因；对于家族性高胆固醇血症，有将LDL受体进行编码的基因等。
进而，药物基因中使用的表达盒，若是在靶细胞内发现基因的，对此没有特殊限制，可使用任何一种。本技术人员可限容易选择这种发现盒。好的是在来自动物细胞内可表达基因的表达盒、更好是在来自哺乳类细胞内可表达基因的表达盒，尤其好是在来自人类细胞内可表达基因的表达盒。表达盒中可使用的基因启动子，包括来自腺病毒、细胞肥大病毒、人类免疫不全(HIV)病毒、猿病毒40、劳氏肉瘤病毒、单纯疱疹病毒、小鼠白血病病毒、大脑神经病毒、新培斯病毒A型肝炎病素、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、乳头瘤病毒、人类T细胞白血病病毒、流感性病毒、日本脑炎病毒、JC病毒、小核糖核酸病毒B19、脊髓灰质炎病毒等病毒的启动子、来自蛋白质和热休克蛋白等哺乳类的启动子、CAG启动子等嵌合体型启动子等。
(核酸搬运体)本发明的核酸搬运体，其特征是包括由上述二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽、和上述重病毒载体。按规定比将多肽和重组病毒载体组合在一起时很容易形成复合体，形成本发明的核酸搬运体。根据本发明的最佳实施形态，本明的一种重组病毒载体，含有上述所示的适宜药物基因。是将该重组病毒载体和本发明的多肽组合在一起时可用于基因治疗的核酸搬运体，而且得到的是基因治疗用组合物。因此，通过将含有上述药物基因的重组病毒载体，和上述由二氨基丁酸和/或基药学上允许盐形成的多肽进行混合，调制成基因治疗用的细合物。这样得到的基因治疗用组合物也包括在本发明范围之内。
更具体讲，将二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽和含有药物基因的重组病毒载体分别溶解在水、生理食盐水、等进行强化的缓冲液等适当溶剂中后，再进行混合调制成基因治疗用组合物。
这时，所使用的含上述药物基因的重组病毒载体和本发明的多肽混合比，没有特殊限制。实用中，对于1×102～1×1013IU/ml、好的为1×103～1×1012IU/ml，更好为1×104～1×1011IU/ml的1ml重组病毒载体溶液，使用本发明的多肽浓度为5μg/ml～20μg/ml，最好5μg/ml～10μg/ml。
此处所说的IU(infectious units)，是指表示重组病毒载体的基因导入效率(titer)、在上述1ml的病毒载体溶液中可导入基因的细胞数。基因导入效率，例如在含耐新霉素药剂性基因的重组病毒载体中对任意细胞进行导入基因处理后，在含药剂的培养液中培养，通过统计获得可增殖的耐药剂性细胞数量。
本发明的核酸搬运体，在将多肽和重组病毒载体混合后，1分钟后就形成复合体，这种复合体即使在形成后经过1小时，仍稳定地存在于混合溶液中。
本发明的核酸搬运体在混合形成复合体后也不会引起沉淀。因此，将本发明的核酸搬运体直接注入血管中。也不存在引起血栓的危险性，能有效安全地给药药物基因。
本发明的核酸搬运体，根据需要还可含有添加剂。例如，为了促进对细胞吸附、使重组病毒载体稳定化、促进药物基因向细胞胞内或核内导入，或者控制重组病毒载体的放出，根据需要可向本发明的肽中添加添加剂。
作为这样的添加剂，只要能达到上述目的就可以，没有特殊限定，例如有蔗糖、氨基醋酸、谷氨酸钠、硫酸软骨素、明胶、蛋白质、细胞分裂素、HMG-1、HMG-2混合物、氯喹啉、VSV-G(小水痘性口内炎病毒外皮蛋白质)、戊糖苷(腺苷病毒构造蛋白质)等。
而且，还发现，本发明的核酸搬运体，比单独用重组病毒载体导入药物基因，可向靶细胞有效导入约3倍以上的药物基因。
(本发明核酸搬运体的使用方法)本发明的核酸搬运体，首先，从患者身体向体外取出靶细胞，导入药物基因后，在将该细胞返还回患者体内的由在自家移植的基因治疗中可使用(ex vivo基因治疗)。也可使用在直接将药物基因给药患者的基因治疗中(in vivo基因治疗)。
作为基因治疗的方法，大致有原样使用异常(原因)基因，付加新的(正常)基因方法(Augumentation Gene Therapy)，利用正常基因置换异常基因的方法(Replacement Gene Therapy)。本发明的核酸搬运体可使用任何一种方法。
关于将本发明核酸搬运体给药生物体的方法，没有特殊限制。例如非经口给药，最好实施注射给药。
本发明核酸搬运体的用量，随使用方法、使用目的而异，本领域人员可依据治疗对象确定最适宜用量。例如，使用注射给药时，1天的给药量好的为0.1μg/kg～1000mg/kg，更好为1μg/kg～100mg/kg。
(实施例)以下列举制造例、实施例、试验例更具体地说明本发明，但本发明不受这些例所限制。
以下制造例和实施例中使用的由二氨基丁酸和/或基药学上允许盐形成多肽的合成，可按照VogelerK。等人的方法进行(VogelerK、和LanzP.，Helv.Chim.Acta，43，270-279(1960)，其合成过程如图1所示。
本说明书中，聚二氨基丁酸(Poly(2，4-diaminobutyric acid)，包括其醋酸盐，简写成PDBA。PDBA中也包括可全部是旋光异构体的。同样将与聚乙二醇的嵌段共聚物简写成PDBApeg(或PDBA-PEG)。
(制造例1)由二氨基丁酸和/或基药学上允许盐形成肽的合成(1)作为单体的，Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(4N-Carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acld N-carboxy-anhydride)(10)的合成
(I-1)Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(4N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acid)(8)的合成将15gDL-2，4-二氨基丁酸2盐酸盐(DL-2，4-diamino-n-butyric aciddihydro chloride)(1)(sigma社制)溶解在75ml水中，再向其中加入11.7g碱性碳酸铜(2)，放置后，煮沸回流、过滤。向滤液中加16.6g碳酸氢钠、17.8ml苄氧羰基氯化物(4)(和光纯药社制)，搅拌，得到沉淀生成物。将得到的生成物过滤，用丙酮、和二乙基醚洗涤后，干燥，得到15gNγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸铜络合物(4N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acid coppercomplex；以下写作Dba(Z)-Cu)(5)。
将11g上述得到的络合物(5)加入到9.3ml35％HCl、22ml水、11ml甲醇的混合液中。在硫化氢(H2S)气的存在下搅拌。室温下静置，除去过剩的硫化氢后，过滤除去不溶物。将滤液减压，加入水和甲醇，冷却。再加入甲醇后，加入二乙胺(7)(diethylamine)将溶液PH调整到7。过滤分离出析出的结晶，在漏斗上用二乙醚洗涤，干燥、以白色结晶得到4g生成物。再将上述滤液浓缩、冷却，过滤分离析出的结晶，在漏斗上用二乙醚洗涂、并干燥，以白色结晶得到1.5g生成物，将它们合并得到合计5.5g(由原料氨基酸计算收率31％的Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基基丁酸(8)。
(I-2)Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA)4N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acid N-carboxy-anhydride(10)的合成。
将5g上述得到的(8)溶解在四氢呋喃(THF)200ml中，向其中加入40mlTHF中溶解4.5g三光气(9)溶液(triphosgene，bis(tricholoromethyl)carbonate，Aldrich社制)，在40℃搅拌60分钟。减压除去溶剂后，在得到的粗生成物中加入已烷溶解。冷却，再减压除去大部分已烷后，再向得到的粗生成物中加入醋酸乙酯溶解、过滤除去不溶物。向所得液中加入已烷，冷却，生成物以白色结晶沉淀出。过滤分离析出的结晶，减压下干燥。上过滤液也减压浓缩后，同样处理得到结晶生成物。将得到的结晶用二乙醚重结晶，获得2.7g(收率50％)精制生成物(10)。
(II)聚合反应由各种残基数的二氨基丁酸形成的多肽，通过将上述得到的Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)，用各种比率的引发剂进行缩聚，随后脱去氨基的保护基。
所谡本发明的残基数是指按下式(Arieh Yaron等、Biochim.Biophys.Acta，69，397-399(1963)计算出的(最后乘以0.9的理由是在去除保护基的反应条件下，分子量约降低10％)。进而，本发明的分子量意指以下式表示的。
残基数＝聚合度(n)＝[Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)的量(摩尔数)/引发剂的量(摩尔数)]×收率(％)/100×0.9分子量＝n(聚合度)×残基量(作为醋酸盐，DBA醋酸盐的残基量＝160)以下详述表1、表2中合成例3(残基数49)中所示聚-DL-二氨基丁酸(poly-DL-2，4-diaminobutyric acid)和其醋酸盐的合成。使用表1所示其他条件，同样得到合成例1(残基数12)、2(残基数26)、4(残基数62)、5(残基数170)、6(残基数278)、7(残基数348)的PDBA。合成例3中在聚二氨基丁酸及其醋酸盐的末端结合了聚乙二醇(14)(PEG、分子量1000)的聚二氨基丁酸-PEG(15)及其醋酸盐的合成条件，作为合成例8也示于表1和表2。
(II-1)聚-Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(poly(4-N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyoric acid)(11)的合成将1g(3.6摩尔)Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基酷酸NCA(10)溶解在19ml乙腈(acetonitrile)中。
作为引发剂，加入4.38mg(0.06mmol)丁胺(butylamine)、在30℃静置307小时。将得到的聚合物过滤、用乙腈洗涤。用索式萃取器，以二乙醚萃取后，减压下干燥、得到0.77g(聚合率91％)聚-Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)。
(II-2)聚-DL-二氨基丁酸(poly DL-2，4-diaminobutyric acid)(13)醋酸盐的合成将0.5g聚Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)溶解在2ml三氟醋酸中(trifluoroacetic acid)，向其中加入25％溴化氢醋酸溶液(12)，振荡混合。静置后，加入二乙醚，倾斜除去上澄醚相，再用二异丙醚进行相同操作，倾斜去除上清醚相。将得到的沉淀物减压充分干燥。在所得固体中加入醋酸钠和水，使用除去分子量1000以下的渗析管，以流动水对所得混合液进行渗析后，以20000G进行一小时离心分离，除去沉淀物。将得到的溶液进行冷冻干燥，得到0.34g(收率91％)聚-DL-二氨基丁酸(13)。
表1利用4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸NCA的缩聚得到聚(4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)的合成条件

a)BA；丁胺PEG1000；聚乙二醇MW1000b)引发剂/N-羧酸酐(NCA)摩尔比(引发剂和NCA的摩尔比)c)ACN；乙腈表2利用聚4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸的脱保护得到聚(DL-2，4-二氨基丁酸)醋酸盐的合成条件

a)聚(Dba(Z))；聚(4-N-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸)聚(Dba(Z))-PEG；聚(4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)-PEG1000
(制造例2)GFP/HIV载体的调制将在含有HIV的gag、pol基因、缺少env基因和包装信号的基因组上游，配置了细胞肥大病毒启动子的基因构筑物，插入含有与耐氨必西林性基因复制的SV40开始点的发现载体中的质粒pCMV-R8.2(Naldini L，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，11382-11388，1996图2)、和将在对小水痘性口内炎病毒(Vesicular stomatitisvirusVSV)的外皮蛋白质VSV-G进行编码基因上游配置了细胞肥大病毒启动子的基因构筑物，植入到表达载体PXF3中的质粒pMD.G(Naldini L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，11382-11388图3)，以及将从5′末端到3′末端方向依次配置HIV-LTR、CAG启动子、绿色荧光蛋白质(EGFP)基因和HIV-LTR的基因构筑物，插入含有耐氨必西林基因复制的SV40开始点的表达载体中的表达质粒pHXCAGEGFP(图4)，一起利用磷酸钙法转染在COS细胞上。培养2天后，将得到的培养上清液以2000rpm离心10分钟，除去沉淀物，得到GFP/HIV载体溶液。
(实施例1)GFP/HIV载体/PDBA复合体的调制服用之前，每次以等量将制造例2中调制的GFP/HIV载体和以2倍要求浓度调制的PDBA溶液等量混合，调制成本发明的核酸搬运体GFP/HIV载体/PDBA复合体溶液。将PDBA的最终浓度分别调制成0、0.3、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/ml。溶剂使用DMEM培养基(Sigma社制)。PDBA使用以表2中合成例3得到的PDBA，分子量为7800。此处，PDBA的最终浓度为25μg/ml形成的复合体在溶液中不会产生沉淀。
(试验例1)和用GFP/HIV载体/PDBA复合体向Hela细胞内导入基因试验前一天，在12穴的多孔板(社制)上的每个孔中播种1×105个Hela细胞。在10％牛胎仔血清(三光纯药社制)存在下，给药GFP/HIV载体/PDBA复合体溶液，在37℃进行孵化4小时。更换新鲜培养液后，再孵化48小时。
(试验例2)使用流式细胞仪测定导入基因的效率对试验例1中导入基因的Hela细胞进行胰蛋白酶处理，从板中回收。将回收的细胞悬浊液用1％多聚甲醛进行固定，用流式细胞仪(FACS Calibur；ベクトンデイツキンソン社制)进行测定。在10000个细胞中导入标识基因(EGFP)的细胞比率示于图5。在只以重排HIV载体用作对照样(PDBA为0μg/ml)中，确认约30％的细胞内导入了基因。在PDBA和GFP/HIV载体的复合体组中，依赖于PDBA的浓度提高了导入基因的效率，以最终浓度10.0μg/ml以上，与对照样比较，确认导入基因约高3倍。图5的纵轴单元为％，曲线以％表示将对照样取为100％时各浓度的基因导入。
(试验例3)GFP/HIV载体/PDBA复合体的稳定体评价GFP/HIV载体/PDBA复合体的调制分别在试验前60、30、15、10、3、1分钟，每次以等量将制造例2中调制的GFP/HIV载体和以20.0μg/ml调制的PDBA溶液混合，调制成GFP/HIV载体/PDBA复合体溶液(PDBA的终浓度为10.0μg/ml)。
溶剂使用DMEM培养基(Sigma社制)。PDBA使用由表2中合成例3得到的分子量为7800的。将各GFP/HIV载体/PDBA复合体溶液，在室温下静置后，给药Hela细胞。48小时后，固定细胞，用流式细胞仪CFACS Calibur；ベクトンデイツキンソン社制)测定导入基因效率。在10000个细胞中导入EGFP基因的细胞比率示于图6。从图6可以确认，将PDBA和重组病毒载体混合后立刻形成稳定的复合体，即使在室温下放置1小时，导入基因效率也不发生变化。和图5一样，图6的纵轴单元为％，曲线以％表示将对照样取为100％时各浓度的基因导入率。
工业应用本发明的核酸搬运体是由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽，与重组病毒载体形成复合体，可将药物基因有效安全地导入细胞内，由于保证能在该细胞内出现很高的基因，所以可用于基因治疗中。
权利要求
1.一种核酸搬运体，其特征是含有由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽，和重组病毒载体。
2.根据权利要求1记载的核酸搬运体，其特征是上述多肽含有由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽，与聚乙二醇的嵌段聚合物。
3.根据权利要求1记载的核酸搬运体，其特征是多肽是由残基数20～280的二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成。
4.根据权利要求2记载的核酸搬运体，其特征是多肽是由残基数20～280的二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成。
5.根据权利要求1-4中任一项记载的核酸搬运体，其特征是上述重组病毒载体含有药物基因。
6.根据权利要求1-4中任一项记载的核酸搬运体，其特征是重组病毒载体是HIV载体。
7.根据权利要求5记载的核酸搬运体，其特征是重组病毒载体是HIV载体。
8.根据权利要求6记载的核酸搬运体，其特征是上述HIV载体是与VSV-G的假型HIV载体。
9.根据权利要求7记载的核酸搬运体，，其特征是上述HIV载体是与VSV-G的假型HIV载体。
全文摘要
将含有由二氨基丁酸和/或其药学上允许盐形成的多肽、和重组病毒载体(最好也含药物基因)的核酸搬运体、和药物基因有效安全地导入细胞内,可在该细胞内出现很高的药物基因,实施基因治疗。
文档编号C12N15/86GK1379821SQ00814532
公开日2002年11月13日 申请日期2000年10月20日 优先权日1999年10月20日
发明者後藤武, 饭岛修, 岛田隆 申请人:久光制药株式会社