用于生产高效价1,3－丙二醇的生物学方法

专利名称：用于生产高效价1,3－丙二醇的生物学方法
技术领域：
本发明包括通过单一微生物将可发酵的碳源生物转化成1，3-丙二醇的方法。
背景1，3-丙二醇是在生产聚酯纤维和生产聚亚胺酯和环类化合物方面具有潜在用途的单体。
已知有多种生产1，3-丙二醇的方法。例如，在有磷化氢、水、一氧化碳、氢和一种酸存在的条件下通过一种催化剂可将环氧乙烷转化成1，3-丙二醇，通过丙烯醛的催化溶液相水合、然后还原，或者以诸如甘油的化合物为原料，在有一氧化碳和氢存在的条件下通过具有元素周期表中VIII组原子的催化剂转化而成。尽管可以通过上述方法生产1，3-丙二醇，但其价格昂贵，并且产生含有环境污染物的废物。
一个世纪以来就已经知道可以通过甘油发酵生产1，3-丙二醇。例如，业已在柠檬酸杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、泥杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌和暗杆菌属中发现了能产生1，3-丙二醇的菌株。在研究过的每一种情况下，甘油是通过两个步骤转化成1，3-丙二醇，由酶催化反应过程。在第一个步骤中，由脱水酶催化将甘油转化3-羟基丙醛(3-HPA)和水，公式1。在第二个步骤中，通过NAD+-连接的氧化还原酶将3-HPA还原成1，3-丙二醇，公式2。1，3-丙二醇不再进一步的代谢，其结果是在培养基中积累。
甘油→3-HPA+H20(公式1)3-HPA+NADH+H+→1，3-丙二醇+NAD+(公式2)总的反应消耗辅助因子形式的还原物还原的β-烟酰胺腺苷二核苷酸(NADH)，它被氧化成烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)。
在肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、巴氏梭菌中，编码甘油脱水酶的三个结构亚基的基因(dhaB1-3或dhaB、C和E)位于靠近编码专一性1，3-丙二醇氧化还原酶的基因(dhaT)处(参见


图1)。尽管在这些微生物中的遗传组构略有不同，这些基因被归为一类，这一类还包括orfX和orfZ(编码甘油脱水酶的脱水酶的再活化因子基因，以及orfY和orfW(具有未知功能的基因)。已知所述微生物的专一性1，3-丙二醇氧化还原酶的基因(dhaT)属于III型醇脱氢酶家族，各自具有一个保守的铁结合基序，并能优先进行1，3-丙二醇和3-HPA的NAD+/NADH关联的相互转化。不过，1，3-丙二醇和3-HPA的NAD+/NADH关联的相互转化还可以通过醇脱氢酶催化，这种酶不是专一性与脱水酶连接的(例如，马肝和面包酵母醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1))，不过，具有较低效果的动力学参数。甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇[1，3-丙二醇]脱水酶(E.C.4.2.1.28)是相关的但又是不同的酶，它们是由不同基因编码的。源于产酸克雷伯氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的二醇脱水酶基因与甘油脱水酶基因类似，并且被归为一类，这一类包括类似于orfX和orfZ的基因(Daniel等，FEMS微生物学综述22，553，1999；Toraya和Mori，生物学化学杂志，274，3372，1999；GenBank AF026270)。
用甘油生产1，3-丙二醇通常是在厌氧条件下用甘油作为唯一的碳源并且在缺乏其他外源还原等同受体的情况下进行的。在上述条件下，在诸如柠檬酸杆菌属、梭菌属和克雷伯氏菌属的菌株中，甘油操纵的一个平行途径首先涉及通过NAD+-(NADP+-)连接的甘油脱氢酶将甘油氧化成二羟基丙酮(DHA)，公式3。dha在由dha激酶磷酸化成二羟基丙酮磷酸酯(dhaP)之后(公式4)，甘油+NAD+→dha+NADH+H+(公式3)dha+ATP→dhaP+ADP(公式4)可用于生物合成和支持ATP生成，例如，通过糖酵解。与1，3丙二醇途径相反，该途径能为细胞提供碳和能量，并产生NADH，而不是消耗NADH。
在肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌中，编码在功能上与甘油脱水酶(dhaB)、1，3丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性相关的基因包括在dha调节子范围内。在肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌中，dha调节子还包括编码一种转录激活蛋白的基因(dhaR)。来自柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌属的dha调节子业已在大肠杆菌中表达，并且被证实能将甘油转化成1，3丙二醇。
上述生产1，3丙二醇的化学方法或生物学方法都不是很适合工业规模的生产，因为化学方法是能量密集型的，而生物学方法局限于来自昂贵原材料甘油的较低的效价。上述缺陷可以通过需要低的能量投入和诸如碳水化合物或糖类的廉价原材料的方法而得到克服，或者通过提高甘油加工的代谢效率而得到克服。任一种方法的开发都需要操纵决定糖类向甘油转化和甘油向1，3丙二醇转化的遗传学机制。
制备甘油的生物学方法是已知的。占绝对多数的甘油生产菌是酵母，但某些细菌、其他真菌和藻类也是已知的。细菌和酵母是通过糖酵解中的果糖-1，6-二磷酸途径或EMP途径转化葡萄糖或其他碳水化合物而产生甘油的，而某些藻类在叶绿体将溶解的二氧化碳或碳酸氢根转化成卡尔文循环的3-碳中间体。在一系列步骤中，所述3-碳中间体磷酸甘油酸被转化成甘油醛3-磷酸，它可以方便地转化成其酮异构体二羟基丙酮磷酸酯，并最终转化成甘油。
具体地讲，地衣形芽孢杆菌和番茄乳杆菌能合成甘油，并且甘油产生存在于耐卤藻类杜氏藻和Asteromonas gracilis中，以便免受外部高盐浓度的损害。类似地，各种耐渗透压的酵母能合成甘油作为保护措施。酵母属的大多数菌株在醇发酵期间能产生某些甘油，并且通过施加渗透压力可以通过生理学方法提高其产量。在本世纪初期，甘油生产是通过使用酵母属培养物实现的，向该培养物中添加诸如亚硫酸盐或碱的“转向试剂”。通过形成无活性的复合物，所述转向试剂能阻止或抑制乙醛向乙醇的转化；因此，有过量的还原等同物(NADH)可用于或“被转向”至DHAP，用于还原产生甘油。该方法的局限是亚硫酸盐对酵母生长的部分抑制。这种局限通过使用能通过其他机制产生过量NADH等同物的碱而得到部分克服。在该方法中，所述碱能启动Cannizarro汽化作用，由乙醛的两种等同物产生乙醇和乙酸。
业已从S.diastaticus中克隆了编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(DAR1，GPD1)，并进行了测序(Wang等，细菌学杂志176，7091-7095，1994)。将DAR1克隆到穿梭载体上，并用于转化大肠杆菌，通过表达产生活性酶。Wang等(同上)认为，DAR1是通过细胞渗透环境调控的，但没有暗示该基因如何可用于在重组微生物中提高1，3丙二醇的产量。业已分离了甘油-3-磷酸脱氢酶例如，业已从酿酒酵母中克隆了sn-甘油-3-磷酸脱氢酶并进行了测序(Larason等，分子微生物学10，1101，1993)，而Albertyn等(分子细胞生物学14，4135，1994)披露了从酿酒酵母中克隆编码甘油-3-磷酸脱氢酶GDP1。与Wang等(同上)一样，Albertyn等和Rarason等都认可该基因调控的渗透压敏感性，但没有暗示该基因如何可用于在重组微生物中生产1，3丙二醇。
与G3PDH一样，业已从酿酒酵母中分离了甘油-3-磷酸酶，并确定该蛋白是由GPP1和GPP2基因编码的(Norbeck等，生物学化学杂志271，13875，1996)，与编码G3PDH的基因一样，GPP2似乎也是对渗透压敏感的。
尽管用一种微生物将除了甘油或二羟基丙酮以外的可发酵碳源转化成1，3-丙二醇是理想的，但有大量证据表明，在这样做时有很大的困难需要克服。例如，Gottschalk等(EP373230)披露，诸如果糖或葡萄糖的氢供体的存在会干扰包括弗氏柠檬酸杆菌、Clostridiumautobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌在内的用于生产1，3丙二醇的大多数菌株的生长。在提供甘油作为唯一的碳源时，通过甘油和果糖和葡萄糖共发酵产生1，3丙二醇的短乳杆菌和布氏乳杆菌的菌株不能生长，并且尽管业已证实静息细胞能代谢葡萄糖或果糖，但不能产生1，3丙二醇(Veiga DA Cunha等，细菌学杂志，174，1013，1992)。类似的，业已证实，在提供甘油和乙酸时能产生1，3丙二醇的多养型泥杆菌菌株不能用除了甘油以外的、包括果糖和葡萄糖在内的碳底物产生1，3丙二醇(Steib等，Arch.Microbiol.140，139，1984)。最后，Tong等(应用生物化学生物技术34，149，1992)披露，在缺乏外源甘油的情况下，用编码甘油脱水酶的dha调节子转化过的重组大肠杆菌不能利用葡萄糖或木糖产生1，3丙二醇。
业已报导了提高用甘油产生1，3丙二醇产量的尝试，其中，该方法包括能够提供还原性等同物，通常为可发酵的糖类的共同底物。业已报导了弗氏柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270静息细胞共发酵甘油和葡萄糖的产量的提高(Gottschalk等，同上；和Tran-Dinh等，DE3734764)；但在生长共发酵甘油和葡萄糖的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的细胞方面没有取得成功，这种细胞不产生1，3丙二醇(I-T.Tong博士论文，Wisconsin-Madison大学，1992)。业已报导了通过重组大肠杆菌共发酵甘油和葡萄糖或果糖可以提高产量；不过，在缺乏甘油的情况下不产生1，3丙二醇(Tong等，同上)。在上述系统中，单一微生物利用糖类作为产生NADH的来源，同时提供细胞维持或生长的能量和碳。以上文献表明，糖类没有进入产生1，3丙二醇的碳流。
不过，最近业已披露了用能表达脱水酶的单一微生物将除了甘油或二羟基丙酮以外的碳底物转化成1，3丙二醇(US5686276；WO9821339；WO9928480；和WO9821341(US6013494))。用甘油或葡萄糖生产1，3丙二醇的生物学方法的一个特殊的缺陷一直是通过发酵所获得的产物的低效价；因此，需要能量密集型的分离工艺从含水的发酵液中获得1，3丙二醇。通过补料分批发酵或分批发酵用甘油生产1，3丙二醇的最终效价对于丁酸梭菌来说为65克/升(Saint-Amans等，生物技术通讯16，831，1994)，对于丁酸梭菌突变体来说为71克/升(Abbad-Andaloussi等，应用环境微生物学61，4413，1995)，对于肺炎克雷伯氏菌来说为61克/升(Homann等，应用微生物生物技术33，121，1990)，而对于弗氏柠檬酸杆菌来说为35克/升(Homann等，同上)。还没有披露过对葡萄糖进行发酵所产生的1，3丙二醇能超过通过甘油发酵所获得的效价。
有待解决的问题是如何通过单一微生物用诸如葡萄糖或其他糖类的廉价碳底物通过生物学方法以高效价生产1，3丙二醇。1，3丙二醇的生物学生产需要甘油作为两步序列反应的底物，其中，由脱水酶(通常是辅酶B12-决定型脱水酶)将甘油转化成一种中间体3-羟基丙醛，然后由NADH-(或NADPH)决定型氧化还原酶将其还原成1，3丙二醇。所述辅助因子要求的复杂性必须利将全细胞催化剂用于工业化生产中，该方法利用所述反应序列生产1，3丙二醇。
发明概述申请人业已解决了上述问题，本发明提供了能以明显高于以前所能达到的效价并且利用单一微生物将可发酵的碳源直接生物转化成1，3丙二醇的方法。用葡萄糖作为模式底物，并用大肠杆菌作为模式宿主。在本发明的一个方面，能表达一组基因(包括编码脱水酶活性、脱水酶再活化因子、1，3丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶的基因)的重组大肠杆菌以接近将甘油发酵成1，3丙二醇的效价将葡萄糖转化成1，3丙二醇。
在本发明的另一方面，在该重组大肠杆菌中，消除有功能的dhaT基因，会导致明显较高的由葡萄糖产生1，3丙二醇的效价。效价的这种出人意料的提高导致了经济指标的改善，因此，它是一种用于由葡萄糖生产1，3丙二醇的改进方法。另外，本发明可普遍应用于任何碳底物，这些底物能方面地转化成1)甘油，2)二羟基丙酮，3)甘油氧化状态的C3化合物(例如，甘油3-磷酸)，或4)二羟基丙酮氧化状态的C3化合物(例如，二羟基丙酮磷酸或甘油醛3-磷酸)。在dhaT-菌株中生产1，3丙二醇需要非专一性催化活性，它能将3-HPA转化成1，3丙二醇。决定将3-HPA转化成1，3丙二醇的非专一性催化活性的酶和/或基因的鉴定可导致利用多种宿主微生物用多种含碳底物作底物生产1，3丙二醇。还可希望利用这种将3-HPA转化成1，3丙二醇的非专一性催化活性会导致用甘油或二羟基丙酮生产1，3丙二醇的改进方法，它会导致改进了的效价和经济指标的提高。
业已以核酸片段形式从大肠杆菌中分离了这种活性，该片段编码将3-羟基丙醛转化成1，3丙二醇的非专一性催化活性，该片段如SEQID NO58所示或选自下列一组(a)编码SEQ ID NO57的氨基酸序列的全部或主要部分的分离的核酸片段；(b)基本上类似于编码SEQ ID NO57的氨基酸序列的全部或主要部分的分离的核酸片段的分离的核酸片段；(c)编码具有至少387个氨基酸并且与SEQ ID NO57的氨基酸序列有至少80％相同性的多肽的分离的核酸片段；(d)能在0.1XSSC、0.1％SDS，65℃的杂交条件下，并用2XSSC、0.1％SDS洗涤，然后用0.1XSSC、0.1％SDS洗涤的条件下与(a)杂交的分离的核酸片段；和(e)互补于(a)、(b)、(c)或(d)的分离的核酸片段。另外，所述非专一性催化活性体现在SEQ ID NO57所示多肽上。
可以构建包括上述分离的核酸片段的嵌合基因，所述片段可操纵地连接于合适的调控序列上。该嵌合基因可用于转化下列一组的微生物柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、气杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属、和假单胞菌属，大肠杆菌是优选的宿主。
因此，本发明提供了一种可用于生产1，3丙二醇的重组微生物，它包括(a)编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个基因；(b)编码具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的至少一个基因；(c)编码一种具有脱水酶活性的多肽的至少一个基因；(d)编码脱水酶再活化因子的至少一个基因；(e)编码足于将3-羟基丙醛转化成1，3丙二醇的非专一性催化活性的至少一个内源基因，其中，不存在编码1，3丙二醇氧化还原酶的有功能的dhaT基因。优选的实施方案是不存在dhaT基因的重组微生物(优选大肠杆菌)。所述重组微生物可以在选自下列一组的内源基因上含有突变(例如缺失突变或点突变)(a)编码具有甘油激酶活性的多肽的基因；(b)编码具有甘油脱水酶活性的多肽的基因；和(c)编码具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的基因。
在另一种实施方案中，本发明包括一种生产1，3丙二醇的方法，该方法包括(a)在合适条件下让含有dha调节子并缺乏编码1，3丙二醇氧化还原酶活性的有功能的dhaT基因的重组大肠杆菌与至少一种碳源接触，其中，所述碳源选自下列一组单糖、寡糖、多糖、和单碳底物；和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3丙二醇。
本发明还提供了一种用重组微生物生产1，3丙二醇的方法，该方法包括(a)让本发明的重组微生物与选自下列一组的至少一种碳源接触单糖、寡糖、多糖、单碳底物，以便产生1，3丙二醇；和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3丙二醇。
类似地，本发明还提供了一种利用重组微生物生产1，3丙二醇的方法，该方法包括(a)让一种重组微生物与至少一种碳源接触，所述重组微生物包括(i)编码一种脱水酶活性的多肽的至少一个基因；(ii)编码脱水酶再活化因子的至少一个基因；(iii)编码足于将3-羟基丙醛转化成1，3丙二醇的非专一性催化活性的至少一个内源基因，其中，不存在编码1，3丙二醇氧化还原酶的有功能的dhaT基因；所述碳源选自甘油和二羟基丙酮，其中，产生了1，3丙二醇；和(b)可选地回收在(a)产生的1，3丙二醇。
本发明的另一方面提供了碳底物共饲养的方法。在生产1，3丙二醇的这种实施方案中，其步骤有(a)让重组大肠杆菌与第一种碳源和第二种碳源接触，所述重组大肠杆菌含有(i)至少一个编码一种具有脱水酶活性的多肽的外源基因；(ii)至少一个编码一种具有脱水酶再活化因子的外源基因；(iii)至少一个编码足于将3-羟基丙醛转化成1，3丙二醇的非专一性催化活性的外源基因，其中，在所述重组大肠杆菌中不存在编码1，3丙二醇氧化还原酶活性的有功能的dhaT基因，并且，其中，所述第一种碳源选自甘油和二羟基丙酮，而第二种碳源选自单糖、寡糖、多糖和单碳底物，和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3丙二醇。所述共饲养可以顺序进行或同时进行。用于共饲养实施方案的重组大肠杆菌还可以包括(a)一组外源基因，包括(i)至少一个编码一种甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的基因；(ii)至少一个编码具有甘油-3-磷酸酶活性的基因；和(iii)编码dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ的基因产物的至少一小类基因，和(b)一类内源基因，每一个基因具有使该基因失活的一个突变，这一类基因包括(i)编码一种具有甘油激酶活性多肽的基因；(ii)编码一种具有甘油脱氢酶活性多肽的基因；和(iii)编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的基因。
有用的重组大肠杆菌菌株包括重组大肠杆菌菌株KLP23，它含有(a)两个内源基因构成的一组，每一种基因具有使该基因失活的一个突变，这一类包括(i)编码一种具有甘油激酶活性多肽的基因；和(ii)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；(b)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的外源基因；(c)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的外源基因；和(d)质粒pKP32和重组大肠杆菌菌株RJ8，它含有(a)由三个内源基因构成的一类，每一个基因具有一个使该基因失活的突变，这一类包括(i)编码一种具有甘油激酶活性的多肽的基因；和(ii)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；和(iii)编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的基因。
其他有用的实施方案包括重组大肠杆菌，这种大肠杆菌含有(a)一类外源基因，包括(i)至少一个编码一种具有脱水酶活性的基因；(ii)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的基因；(iii)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的基因；和(iv)至少一个编码脱水酶再活化因子的基因；和(b)至少一个编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的内源基因，其中，在所述重组大肠杆菌中不存在编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的有功能的dhaT基因。
另一种实施方案是一种重组大肠杆菌，它含有(a)一类外源基因，包括(i)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的基因；(ii)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的基因；(iii)至少一小类编码dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ的基因产物的基因，和(b)至少一个编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的内源基因，其中，在所述重组大肠杆菌中不存在编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的有功能的dhaT基因。该实施方案还包括使用一种重组大肠杆菌，该大肠杆菌还含有一类内源基因，每一种基因具有一个使该基因失活的突变，这一类包括(a)一个编码具有甘油激酶活性的多肽的基因；(b)一个编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；和(c)一个编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的基因。
该实施方案还包括一种生物生产1，3-丙二醇的方法，包括(a)在合适的条件下让本文所披露的重组大肠杆菌与选自单糖、寡糖、多糖和单碳底物的至少一种碳源接触，以便产生1，3-丙二醇；和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3-丙二醇。
还包括另一种生物生产1，3-丙二醇的方法，包括(a)让本文所披露的重组大肠杆菌与选自甘油和二羟基丙酮的碳源接触，所述大肠杆菌还包括(i)至少一个编码一种具有脱水酶活性的多肽的基因；(ii)至少一个编码一种脱水酶再活化因子的外源基因；(iii)至少一个编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的内源基因，和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3-丙二醇。
附图的简要说明，序列说明，和生物学保藏物通过以下详细说明和作为本申请组成部分的附图、所附序列说明和生物学保藏物可以更全面的理解本发明。
图1表示dha调节子亚克隆pHK28-26的序列上的基因组构。
图2表示用稳定的维生素B12饲养的基本上如例7所述的两种发酵之间的胞外可溶蛋白(克/升)比较的曲线图。对于实线曲线来说，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pKP32。对于虚线曲线来说，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pDT29。
图3表示用稳定的维生素B12饲养的基本上如例7所述的两种发酵之间的细胞活力[(活细胞/毫升)/OD550]比较的曲线图。在一种情况下(实线)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pKP32。在另一种情况下(虚线)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pDT29。
图4表示在缺乏维生素B12或辅酶B12的条件下，基本上如例7所述的两种发酵之间的由葡萄糖产生甘油的产量的比较曲线图。在一种情况下(实线)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pKP32。在另一种情况下(虚线)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pDT29。
图5是表示葡萄糖向1，3-丙二醇代谢转化的流程图。
图6是从在天然凝胶上表现出内源大肠杆菌氧化还原酶活性(非专一性催化活性)的带上提取的可溶蛋白级份的2D-PAGE膜印迹。
68个序列说明以及所附的序列表符合在37C.F.R.§1.821-1.825中所规定的专利申请的核苷酸和/或氨基酸序列公开的要求(含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则)，并符合世界知识产权组织(WIPO)的标准ST2.5(1998)和EPO和PCT的序列表要求(5.2和49.5(a-bis)条，和208节和管理指南的附录C)。序列说明包括与披露于核酸研究13，3021-3030，1985和生物化学杂志219，345-373，1984中的IUPAC-IYUB的标准一致的核苷酸序列的一字母代码和氨基酸的三字母代码，以上文献被收作本文参考。
SEQ ID NO1含有由来自pKP1(含有源于肺炎克雷伯氏菌的DNA的粘粒)的12.1kb EcoRI-SalI片段测定的核苷酸序列，所述片段被亚克隆到pIBI31(IBI生物系统，New Haven，CT)，并被称为pHK28-26。表1还列举了在SEQ ID NO1上所确定的基因、相应的碱基对和相关的功能。还可以参见例1。
SEQ ID NO57含有测定的yahD的核苷酸序列。
申请人已经按照国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定提供了以下生物学保藏物SEQ ID NO58含有测定的YahD的氨基酸序列保藏者提供的资料 国际保藏编号 保藏日期含有编码甘油脱氢酶的一部分 ATCC 697891995年4月18日肺炎克雷伯氏菌属基因组的转化大肠杆菌DH5α包括含有编码二醇脱水酶的一 ATCC 697901995年4月18日部分肺炎克雷伯氏菌属基因组的粘粒pKP4的转化大肠杆菌DH5α大肠杆菌MSP33.6 ATCC 985981997年11月25日glpK突变体大肠杆菌RJF10mATCC 985971997年11月25日这些保藏物将在所指定的国际保藏机构保藏至少30年，并且在披露它的专利被授权以后向公众提供。可以获得保藏物并不意味着许可以损害由政府行为所授予的专利权来实施本发明。
在本文中“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心国际保藏处，该保藏机构位于10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209美国。“ATCC No.”是由ATCC保藏的培养物的保藏号。
发明详述本发明提供了一种利用单一微生物将可发酵的碳源直接生物转化成1，3-丙二醇的改进方法。该方法的特征是具有改进的效价、产量和细胞生活力以及在发酵期间细胞裂解的降低。
本发明部分基于这样的发现包括1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)在内的1，3-丙二醇发酵过程的特征是在培养基中有高含量的3HPA和其他醛和酮，这些化合物与细胞生活力的降低有关。本发明还部分基于出人意料的发现模式宿主大肠杆菌通过能够将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的内源非专一性催化活性可以将3-HPA转化成1，3-丙二醇。本发明还部分基于出人意料的发现包括这种非专一性催化活性并缺乏有功能的dhaT的大肠杆菌发酵过程会导致在发酵期间细胞生活力的提高，并能产生比含有有功能的dhaT的发酵过程更高的1，3-丙二醇的效价和/或产量。
在一方面，甘油是模式底物，宿主微生物在野生型dhaT上有一个突变，因此没有1，3-丙二醇氧化还原酶活性，并包括足于将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一催化活性。在另一方面，葡萄糖是模式底物，而重组大肠杆菌是模式宿主。在这一方面，大肠杆菌包括足于将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的内源非专一性催化活性。在一种实施方案中，所述非专一性催化活性是醇脱氢酶。
在一方面，本发明提供了能表达一组基因的重组大肠杆菌，这一组基因包括(a)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的基因；(b)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的基因；(c)至少一个编码具有脱水酶活性的多肽的基因；(d)至少一个编码一种脱水酶再活化因子的基因；和(e)至少一个编码足于将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的内源基因；利用该微生物以高效价将葡萄糖转化成1，3-丙二醇。在本发明的另一方面，在这种重组大肠杆菌中消除有功能的dhaT基因可以由葡萄糖产生高于以前所能达到的出人意料的高效价的1，3-丙二醇。
本发明提供了一种在单一微生物中由可发酵的碳源生物学生产1，3-丙二醇的改进方法。在本发明的一个方面，用于将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的一种改进方法是通过利用重组微生物而实现的，这种微生物包括用肺炎克雷伯氏菌dha调节子基因dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ转化过的宿主大肠杆菌，以上所有基因的排列方式与在野生型肺炎克雷伯氏菌中的遗传组构相同。这种发酵方法所获得的效价明显高于以前所报导的类似发酵的所有效价。如在例6和例7中所披露的，这种改进取决于质粒pDT29的利用。
在本发明的另一方面，用于从葡萄糖生产1，3-丙二醇的另一种改进方法是利用含有编码G3pdh、G3p磷酸酶、脱水酶、和脱水酶再活化因子的基因重组大肠杆菌实现的，这种改进是相对使用含有编码G3pdh、G3p磷酸酶、脱水脱水酶再活化因子以及有功能的dhaT的基因的重组大肠杆菌的方法而言的。明显改进的方法取决于编码一种非专一性催化活性-预计为醇脱氢酶的内源基因，它存在于大肠杆菌中。
如在例7和例9中所述，该方法的明显改进表现在1，3-丙二醇效价提高。该方法的改进还表现在细胞裂解的减弱，这种减弱是通过发酵液中胞外可溶蛋白的浓度而确定的。本发明的这一方面如图2所示。另外，该方法的改进还表现在在发酵过程中延长了的细胞生活力。本发明的这一方面如图3所示。另外，该方法的改进还表现为产量的提高。在表达1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的大肠杆菌中(例如，用质粒pDT29转化过的大肠杆菌KLP23)，甘油可以代谢成除了3-HPA以外的产物。相反，在不表达1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的大肠杆菌中(例如，用质粒pKP32转化过的大肠杆菌KLP23)，甘油不被代谢成除了3-HPA以外的产物。这种神秘的途径是由于有功能的dhaT的存在或不存在，这一点可以通过由葡萄糖产生甘油的较低产量证实，如图4所示。
在本文中，下面的术语可用于解释权利要求书和说明书。
术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“G3PDH”是指一种决定催化二羟基丙酮磷酸酯(dhaP)向甘油-3-磷酸(G3P)转化的酶活性的多肽。在体内，G3PDH可以是NADH；NADPH；或FAD-决定型的。在专门用于表示辅助因子专一性甘油-3-磷酸脱氢酶时，可以使用术语“NADH-决定型甘油-3-磷酸脱氢酶”、“NADPH-决定型甘油-3-磷酸脱氢酶”和“FAD-决定型甘油-3-磷酸脱氢酶”。一般来说，NADH决定型和NADPH决定型甘油-3-磷酸脱氢酶可以交换使用NADH和NADPH(例如，由gpsA所编码的基因)，术语NADH决定型和NADPH决定型-3-磷酸脱氢酶可以交互使用。例如，NADH决定型酶(EC1.1.1.8)是由若干基因编码的，包括GPD1(GenBankZ74071X2)，或GPD2(GenBankZ35169X1)，或GDP3(GenBankG984182)或dhaR(GenBankZ74071X2)。NADPH决定型酶(EC1.1.1.94)是由gpsA编码的(GenBankU321643，(cds197911-196892)G466746和L45246)。FAD决定型(EC1.1.99.5)是由GUT2(GenBankZ47047X23)，或glpD(GenBankG147838)，或glpABC(GenBankM20938)编码的(参见WO9928480及其参考文献，被收作本文参考)。
术语“甘油-3-磷酸酶”、“sn-甘油-3-磷酸酶”、或“d，1-甘油-3-磷酸酶”、和“G3P”磷酸酶是指一种决定催化将甘油-3-磷酸和水转化成甘油和无机磷酸的酶活性的多肽。例如，G3P磷酸酶是由GPP1(GenBankZ47047X125)，或GPP2(GenBankU18813X11)编码的(参见WO9928480及其参考文献，被收作本文参考)。
术语“甘油激酶”是指一种决定将甘油和ATP转化成甘油-3-磷酸和ADP的酶活性的多肽。高能磷酸供体ATP可以被生理学取代物(例如，烯醇丙酮磷酸)所代替。例如，甘油激酶是由GUT1(GenBankU11583X19)和glpK(GenBankL19201)编码的(参见WO9928480及其参考文献，被收作本文参考)。
术语“甘油脱氢酶”是指一种决定催化将甘油转化成二羟基丙酮的酶活性(E.C.1.1.1.6)或将甘油转化成甘油醛的酶活性(E.C.1.1.1.72)的多肽。决定催化将甘油转化成二羟基丙酮的酶活性的多肽又被称为“二羟基丙酮还原酶”。甘油脱氢酶可取决于NADH(E.C.1.1.1.6)、NADPH(E.C.1.1.1.72)、或其他辅助因子(例如，E.C.1.1.99.22)。例如，NAPH决定型甘油脱氢酶是由gldA(GenBankU00006)编码的(参见WO9928480及其参考文献，被收作本文参考)。
术语“脱水酶”是指能催化将甘油分子转化成3-羟基丙醛产物的任何酶活性。对于本发明来说，脱水酶包括甘油脱水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)，它们分别以甘油和1，3-丙二醇为优选底物。业已在肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、巴氏梭菌、鼠伤寒沙门氏菌和产酸克雷伯氏菌中鉴定了编码脱水酶的基因。在任一种情况下，脱水酶是由三个亚基组成的大的或α亚基，中等的或β亚基，以及小的或γ亚基。由于在文献中基因的命名有很大不同，在表1中给出了一个对照表，以便于识别。例如，所述基因还披露于Dniel等(FEMS微生物学综述22，553，1999)和Toraya和Mori(生物学化学杂志，274，3372，1999)的文献中。参见表1，编码甘油脱水酶大的或α亚基的基因包括dhaB1、gldA和dhaB；编码中等或β亚基的基因包括dhaB2、gldB、和dhaC；编码小的或γ亚基的基因包括gldC、dhaE。同样参见表1，编码二醇脱水酶的大的或α亚基的基因包括pduC和pddA；编码中等或β亚基的基因包括pduD和pddB；编码小的或γ亚基的基因包括pduE或pddC。
表1基因名称和脱水酶及相关功能的GenBank资料的比较表基因功能
基因功能
通过甘油和某些其他底物对甘油和二醇脱水酶进行基于机制的自杀失活(Daniel等，FEMS微生物学综述22，553，1999)。术语“脱水酶再活化因子”是指决定再活化脱水酶活性的蛋白。术语“脱水酶再活化活性”、“再活化脱水酶活性”或“再生脱水酶活性”是指将不能催化底物的脱水酶转化成能够催化底物的脱水酶的现象，或者是指抑制脱水酶失活的现象或者延长脱水酶在体内的有用的半衰期的现象。业已鉴定了作为脱水酶再活化因子的两种蛋白(参见WO9821341(US6013494)以及其中的参考文献，被收作本文参考；Daniel等，同上；Toraya和Mori，生物学化学杂志274，3372，1999；和Tobimatsu等，细菌学杂志181，4110，1999)。参见表1，编码上述一种蛋白的基因包括orfZ、dhaB4、gdrA、pduZ和ddrA。同样参见表1，编码上述两种蛋白的另一种的基因包括orfX、orf2B、gdrB、pduH和ddrB。
术语“1，3丙二醇氧化还原酶”、“1，3丙二醇脱氢酶”或“dhaT”是指决定能够催化3-HPA和1，3丙二醇相互转化的酶活性的多肽，其前提是，编码所述活化的基因在其天然状态下(即野生型)在物理学方面或转录方面与脱水酶相关；例如，发现所述基因存在于dha调节子上，如源于肺炎克雷伯氏菌的dhaT。参见表1，编码1，3丙二醇氧化还原酶的基因包括源于肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌和巴氏梭菌的dhaT。上述每一种基因编码一种属于III型醇脱氢酶家族的多肽，具有一个保守的铁结合基序，并对NAD+/NADH关联的3-HPA和1，3丙二醇的相互转化有优势(Johnson和Lin，细菌学杂志，169，2050，1987；Daniel等，细菌学杂志177，2151，1995；和Leurs等，FEMS微生物学通讯154，337，1997)。业已从短乳杆菌和布氏乳杆菌中分离了具有类似物理学特性的酶(Veiga da Dunha和Foster，应用环境微生物学58，2005，1992)。
术语“dha调节子”是指编码各种生物学活性的一组相关的基因或开放读框，包括，但不限于脱水酶活性、再活化活性、和1，3丙二醇氧化还原酶。通常，dha调节子包括本文所披露的开放读框dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ。
术语“非专一性催化活性”是指决定足于催化3-HPA和1，3丙二醇的相互转化的酶活性的多肽，并且特别排除了1，3丙二醇氧化还原酶。通常，这种酶是醇脱氢酶。这种可以利用除了NAD+/NADH以外的辅助因子，包括，但不限于诸如FAD或FMN的黄素。例如业已发现编码非专一性醇脱氢酶的基因是内源编码的，并且能在微生物大肠杆菌KLP23中进行有功能的表达。
术语“功能”或“酶功能”是指一种酶在改变完成特定化学反应所需要的能量方面的催化活性。已经了解到，这种活性可用于平衡的反应，产物或底物的产生可以在合适的条件下完成。
术语“多肽”和“蛋白”可以交换使用。
术语“碳底物”和“碳源”是指能够被本发明的宿主微生物代谢的碳源，并且特别是选自下列一组的碳源单糖、寡糖、多糖和单碳底物或其混合物。
术语“宿主细胞”或“宿主微生物”是指能够接收外源或异源基因并且能够表达这些基因以便产生有活性的基因产物的微生物。
术语“外源基因”、“外源dha”、“异源基因”和“异源DNA”是指通过各种方法放入宿主微生物中的为一种生物所天然拥有的遗传材料。感兴趣的基因可以是天然存在的基因、突变基因、或合成基因。
术语“转化”和“转染”是指在整合核酸之后使细胞获得新的基因。所获得的基因可以整合到染色体DNA上或作为染色体外复制系列导入。术语“转化体”是指转化的产物。
术语“遗传学改变的”是指通过转化或突变改变遗传材料的过程。
术语“重组微生物”和“转化过的宿主”是指业已用异源或外源基因或额外拷贝的同源基因转化过的微生物。本发明的重组微生物能表达甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、甘油脱水酶(dhaB1、dhaB2和dhaB3)脱水酶再活化因子(orfZ和orfX)以及可选地1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因，以便由合适的碳底物生产1，3-丙二醇。一种优选的实施方案是用缺乏有功能的dhaT的上述基因转化过的大肠杆菌。除了大肠杆菌以外的宿主微生物还可转化成含有所披露的基因和编码催化3-HPA和1，3-丙二醇的相互转化的非专一性催化活性的基因，特别排除了1，3-丙二醇氧化还原(dhaT)。
“基因”是指表达一种特殊蛋白的核酸片段，包括位于编码区前面的调控序列(5’非编码区)和随后的序列(3’非编码区)。术语“天然”和“野生型”是指与其调控序列一起天然存在的序列。
术语“编码”一个基因通过转录和翻译机制产生一种氨基酸序列的过程。可以理解的是，编码一种特定氨基酸序列的过程包括可能涉及不会导致所编码的氨基酸改变的碱基改变的DNA序列，或者可能改变或多个氨基酸，但不会影响由该DNA序列所编码的蛋白的功能特性的碱基改变。因此，可以理解的是，本发明包括除了特定代表性序列以外的序列。
术语“分离的”是指除去了与它天然相关的至少一种成分的蛋白或DNA序列。
“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是单链的或双链的。可选地含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可以包括cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个以上的片段。
“基本上相似的”指这样的核酸分子，其中，一个或多个核苷酸碱基的改变，会导致一个或多个氨基酸的取代，但不会影响由该DNA序列编码的蛋白的功能特性。“基本上相似的”还表示这样的核酸分子，其中，一个或多个核苷酸碱基的改变，不会影响该核酸分子通过反义或共抑制技术介导基因表达的改变的能力。“基本上相似的”还表示本发明核酸分子的修饰(如一个或多个核苷酸碱基的缺失或插入)，这种修饰不会明显影响所得到的转录物的功能特性以及通过反义或共抑制技术介导基因表达改变的能力或改变所得到的蛋白分子的功能特性。本发明包括除了特定代表性序列以外的序列。
例如，本领域众所周知的是，基因的改变会导致在特定位点上产生化学上等同的氨基酸，但不会影响所编码的蛋白的功能特性。对于本发明来说，取代被定义为发生在下列5组内部的交换1.小的脂族、非极性或弱极性残基丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸(脯氨酸、甘氨酸)；2.极性、带负电荷的残基及其酰胺天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺；3.极性、带正电荷的残基组氨酸、精氨酸、赖氨酸；4.大的脂族、非极性残基甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸(半胱氨酸)；和5.大的芳族残基苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
因此，编码一种疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一种疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子所取代。类似地，会导致一种带负电荷的残基取代另一种带负电荷的残基(如天冬氨酸取代谷氨酸)或一种带正电荷的残基取代另一种带正电荷的残基(如赖氨酸取代精氨酸)的变化预计会产生在功能上等同的产物。
在很多场合下，会导致蛋白分子的N-末端或C-末端部分改变的核苷酸变化也不一定会改变该蛋白的活性。
所推荐的每一种修饰为本领域技术人员所熟知，对所编码的产物的生物学活性的保留的测定也是公知的。另外，技术人员了解的是，本发明所包括的基本上类似的序列还可以根据其在严格条件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃，用2XSSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1XSSC，0.1％SDS，洗涤)与本发明代表性序列杂交的能力确定。本发明的优选的基本上类似的核酸片段是这样的核酸片段，其DNA序列与本发明所报导的核酸片段的DNA序列的相同性至少为80％。更优选的核酸片段与本发明所报导的核酸片段的DNA序列的相同性至少为90％，最优选的核酸片段与本发明所报导的核酸片段的DNA序列的相同性至少为95％。
如果一种单链形式的核酸片段在合适的温度和溶液离子强度条件下与其他核酸片段退火的话，则认为该核酸片段与另一种核酸片段是“可以杂交的”，如cDNA、基因组DNA或RNA。杂交和洗涤条件是众所周知的，并且披露于以下文献中Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，1989，特别是该书的第11章和表11.1(被全文收作本文参考)。由温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。为了初步筛选同源核酸，可以使用低严格杂交条件，相当于Tm为55℃，例如，5XSSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，无甲酰胺；或30％甲酰胺，5XSSC，0.5％SDS。中等严格的杂交条件相当于较高的Tm，例如，40％甲酰胺，5X或6XSSC。杂交要求两种核酸含有互补的序列，尽管取决于杂交的严格性，但碱基之间的错配是可能的。杂交核酸的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度，以及本领域众所周知的变数。两种核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有这些序列的核酸的杂合体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(相当于较高的Tm)按以下顺序降低RNARNA、DNARNA、DNADNA。对于长度超过100个核苷酸的杂合体来说，业已推导出了计算Tm的公式(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸，即寡核苷酸的杂交来说，错配的位置变得更重要，而寡核苷酸的长度决定其专一性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。在一种实施方案中，可杂交核酸的长度至少为大约10个核苷酸。可杂交核酸的最小长度优选为至少大约15个核苷酸，更优选至少大约为20个核苷酸，最优选至少30个核苷酸。另外，技术人员可以理解的是，温度和洗涤溶液的盐浓度可以是根据需要按照诸如探针长度的因素进行调整。
“实质性部分”是指氨基酸或核苷酸序列，它包括一种多肽的足够的氨基酸序列或一种基因的足够的核苷酸序列以便对所述多肽或基因进行推测性鉴定，这种鉴定是由本领域技术人员通过进行序列的人工评估完成的，或者使用诸如BLAST的程序通过计算机自动化序列比较和鉴定完成的(基础局部排比检索工具；Altschul等，分子生物学杂志215403-410，1993；还可参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。一般，为了推测性地鉴定一种多肽或核酸序列是否与已知蛋白或基因同源需要10或10个以上连续的氨基酸序列或40或40个以上的核苷酸序列。另外，对于核苷酸序列来说，可将包括20个或30个连续核苷酸的基因专一性寡核苷酸探针用于基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌体噬斑的原位杂交)的序列决定型方法中。另外，可将12-15个碱基的短的寡核苷酸用作PCR的扩增引物，以便获得含有该引物的特定的核酸分子。因此，核酸序列的“实质性部分”包括足够的序列来完成含有该序列的核酸分子的具体鉴定和/或分离。本说明书披露了编码一种或多种特定蛋白的部分或完整氨基酸和核苷酸序列。本领域技术人员现在可以利用本发明所报导的序列，将所披露序列的全部或实质性部分用于本领域技术人员所公知的目的。因此，本发明包括在所附序列表中所报导的完整的序列，以及如上文所定义的这些序列的实质性部分。
术语“互补”表示能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA序列来说，腺苷与胸苷互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明还包括互补于所附序列表中所报导的完整序列以及基本上类似的核酸序列的分离的核酸分子。
术语“百分相同性”正如本领域所公知，是两种或两种以上多肽序列或两种或两种以上多核苷酸序列之间的关系，这种关系是通过比较这些序列而确定的。在本领域中，“相同性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，可以根据所述序列之间的匹配程度确定。“相同性”和“相似性”可以通过已知方法方便地计算出来，包括，但不限于披露于以下文献中的方法计算分子生物学；Lesk，A.M.著；牛津大学出版社纽约，1988；生物计算信息和基因组工程；Smith，D.W.等；学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，第1部分；Griffin，A.M.和Griffin，H.G.著；Humana出版社新泽西，1994；分子生物学的序列分析；von Heinje，G.著；学术出版社，纽约，1987；和序列分析引物；Gribskov，M.和Devereux，J.著；Stockton出版社纽约，1991。用于测定相同性的优选方法被设计成能在测定的序列之间产生最大的匹配。
测定相同性和相似性的方法被编辑成公众可以获得的计算机程序。用于测定两个序列之间的相同性和相似性的优选的计算机编程方法包括，但不限于GCG程序包中所提供的GCGPileup程序，使用Needleman和Wunsch算法，及其标准预设值，缺口产生罚金＝12，而缺口延伸罚金＝4(Devereux等，核酸研究12387-395，1984)，BLASTP、BLASTN和FNSTA(Pearson等，美国科学院院报852444-2448，1988)。BLASTX程序可以从NCBI和其他来源公开获得(BLAST手册，Altschul等，国家生物技术信息中心，国家医学文库(NCBINLM)NIH，Bethesda，Md.20894；Altschul等，分子生物学杂志215403-410，1990；Altschul等，缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白数据库检索程序，核酸研究253389-3402，1997)。测定百分相同性的另一种优选方法是利用Jotun-Hein算法的DNASTAR蛋白排比方案的方法(Hein等，酶学方法183626-645，1990)。用于排比的Jotun-Hein方法的预设参数为对于多重排比来说，缺口罚金＝11，缺口长度罚金＝3；对于成对的排比来说，ktuple＝6。作为一种说明，与参考核苷酸序列至少有95％的核苷酸序列“相同性”的多核苷酸被认为该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，所不同的是，该多核苷酸序列可以包括在每100个参考核苷酸序列中最多可以有5个点突变。换句话说，包括与参考核苷酸序列有至少95％核苷酸序列相同的多核苷酸。参考序列中的最多5％的核苷酸可以缺失或被其他核苷酸所取代，或者在参考序列上插入占总核苷酸的最多5％的核苷酸。参考序列的突变可以出现在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置上或两个末端部分之间的任何位置上，单独分布在参考序列的核苷酸之间或者在参考序列上形成一个或多个连续的组。类似的，与参考氨基酸序列至少有95％的氨基酸序列“相同性”的多肽被认为该多肽的氨基酸与参考序列相同，所不同的是，该多肽的序列可以包括在每100个参考氨基酸序列中最多可以有5个点突变。换句话说，包括与参考氨基酸序列有至少95％氨基酸序列相同的多肽。参考序列中的最多5％的氨基酸可以缺失或被其他氨基酸所取代，或者在参考序列上插入占总氨基酸残基的最多5％的氨基酸。参考序列的突变可以出现在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上或两个末端部分之间的任何位置上，单独分布在参考序列上的残基之间或在参考序列上形成一个或多个连续的组。
术语“同源的”是指一种特定宿主细胞天然存在的蛋白或多肽。本发明包括通过重组DNA技术生产同源蛋白的微生物。
术语“百分同源性”是指多肽之间氨基酸序列相同性的程度。如果第一种氨基酸与第二种氨基酸序列相同，那么第一种和第二种氨基酸序列就具有100％的相同性。任何两种多肽之间的同源性是在任意一个序列上的测定位点上匹配的氨基酸的总数的直接函数，例如，如果两个序列的任一个上的氨基酸总数的一半是相同的，那么这两个序列就被说成具有50％的同源性。
“密码子简并性”是指容许核苷酸序列的变化但又不影响所编码多肽的氨基酸序列的遗传密码的差异。因此，本发明涉及编码SEQ IDNO57所示氨基酸序列的全部或实质性部分的所有核酸分子。本领域技术人员所熟知的是特定宿主细胞在利用核苷酸密码编码特定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，在合成用于改善宿主细胞表达的基因时，需要对该基因进行设计，以便其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
还涉及对所述序列的修饰，如缺失、插入或取代，这种修饰能产生不会明显影响所得到的蛋白分子的功能特定的沉默变化。例如，包括在基因序列上所发生的能反映遗传密码简并性的改变或会导致在特定位点产生化学上等同的氨基酸的改变。因此，编码疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可以用编码另一种疏水性较弱的残基，如甘氨酸的密码所取代，或用疏水性更强的残基，如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码所取代。类似的，能导致一种带负电荷的残基取代另一种带负电荷的残基的变化，如天冬氨酸取代谷氨酸，或带正电荷的残基取代另一种带正电荷的残基，如赖氨酸取代精氨酸，也有可能产生生物学上等同的产物。预计会导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也会改变蛋白的活性。在某些场合下，实际上可能需要产生序列的突变体，以便研究改变对蛋白的生物学活性的影响。所推荐的每一种修饰都是本领域所熟知的，对所编码产生的生物学活性保留的测定也是熟知的。另外，本领域技术人员可以理解的是，本发明所包括的序列还可以根据其在严格条件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)与本文所列举的序列杂交的能力确定。
术语“表达”是指由编码基因产物序列的基因进行的基因产物的转录和翻译。
术语“质粒”、“载体”和“框”是指染色体外因子，它通常具有不作为该细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是环状双链DNA分子序列形式的。所述因子可以是自主复制的序列、基因整合序列、噬菌体或核苷酸序列、单链或双链线性或环状的DNA或RNA，可源于任何来源，其中，多个核苷酸序列业已连接或重组到一种特殊结构中，该结构能够将启动子片段和特定基因产物的DNA序列连同合适的3’非翻译序列一起导入细胞。“转化框”是指含有外源基因的特殊载体，除了外源基因之外还具有有利于转化特定宿主细胞的因子。“表达框”是指含有外源基因的特殊载体，除了所述外源基因之外还具有能增强该基因在外源宿主中表达的因子。重组生物的构建可以用本领域所公知的技术构建重组生物，该重组生物含有编码将碳底物转化成1，3-丙二醇的酶促途径的必要基因。从诸如克雷伯氏菌属或酵母菌属的天然宿主中分离编码甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、甘油脱水酶(dhaB1、dhaB2和dhaB3)、脱水酶再活化因子(orfZ和orfX)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因，并用于转化宿主菌株，如大肠杆菌dha5α、ECL707、AA200、或KLP23。分离基因从细菌基因组中获得目的基因的方法是常用的，并且为分子生物学领域的技术人员所公知。例如，如果该基因的序列是已知的话，可以通过限制性内切核酸酶消化产生合适的基因组文库，并可以用互补于目的基因序列的探针筛选。一旦分离了所述序列，就可以用诸如聚合酶链式反应(PCR)的标准引物指导的扩增方法扩增所述DNA(US4683202)，以便获得适合用合适的载体进行转化的量的DNA。
另外，可以制备粘粒文库，其中，将基因组DNA的大的片段(35-45kb)包装到载体中，并用于转化合适的宿主。粘粒载体在容纳大量DNA的能力方面是独一无二的。常见的粘粒载体至少具有一个拷贝的cosDNA序列，它是外源DNA的包装以及随后的环化所必需的。除了cos序列之外，所述载体还含有一个诸如ColE1的复制起点，以及诸如抗氨苄青霉素或新霉素的基因的抗药性标记。利用粘粒载体转化合适的细菌宿主的方法披露于以下文献中Sambrook，J.等，分子克隆实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社，被收作本文参考。
通常为了克隆粘粒，利用合适的限制性内切酶分离外源DNA，并连接到靠近粘粒载体的cos部分。然后让含有线性化的外源DNA的粘粒载体与诸如噬菌体的DNA包装载体起反应。在包装过程中，cos位点被裂解，并且外源DNA被包装到细菌颗粒的头部。然后将所述颗粒用于转染诸如大肠杆菌的合适宿主。一旦注射到细胞中，所述外源DNA就在cos粘性末端的影响下环化。这样，即可将外源DNA的大片段导入重组宿主细胞，并在其中表达。编码甘油脱水酶(dhaB1、dhaB2和dhaB3)、脱水酶再活化因子(orfZ和orfX)和1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的基因的分离和克隆在本发明中使用粘粒载体和粘粒转化方法，以便克隆来自已知具有能够将甘油加工成1，3-丙二醇的基因的细菌属的基因组DNA的大片段。具体地讲，用本领域所熟知的方法从肺炎克雷伯氏菌中分离基因组DNA，并用限制酶Sau3A消化，以便插入粘粒载体Supercosl，并用GigapackII包装提取物进行包装。在构建载体之后，用粘粒DNA转化大肠杆菌XL1-Blue MR细胞。通过在有甘油的条件下生长细胞并分析培养基中1，3-丙二醇的形成，根据将甘油转化成1，3-丙二醇的能力筛选转化体。
对两个1，3-丙二醇阳性转化体进行分析，并将粘粒命名为pKP1和pKP2。DNA测序发现了与源于弗氏柠檬酸杆菌的甘油脱水酶基因的高度的同源性，表明这些转化体含有编码甘油脱水酶基因的DNA。对其他1，3-丙二醇阳性转化体进行了分析，将粘粒命名为pKP4和pKP5。DNA测序发现这些粘粒具有编码二醇脱水酶基因的DNA。
尽管本发明利用的是源于克雷伯氏菌属粘粒的分离的基因，脱水酶基因和脱水酶再活化因子基因的其他来源包括，但不限于柠檬酸杆菌属、梭菌属和沙门氏菌属(参见表1)。编码G3PDH和G3P磷酸酶的基因本发明提供了适合于在宿主细胞中表达G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。
编码G3PDH的基因是已知的。例如，业已从酵母属中分离了G3PD1，并具有SEQ ID NO53所示的碱基序列，编码SEQ ID NO54所示的氨基酸序列(Wang等，同上)。类似地，业已从酵母属中分离了由GPD2编码的G3PDH活性(Eriksson等，分子微生物学17，95，1995)。
对于本发明来说，希望编码决定NADH决定型G3PDH活性的多肽的任何基因都是合适的，其中，所述活性能够催化二羟基丙酮磷酸(dhaP)向甘油-3-磷酸(G3P)的转化。另外，希望编码NADH-决定型G3PDH’s的氨基酸序列的任何基因，相当于基因DAR1、GPD1、GPD2、GPD3和gpsA都能在本发明中起作用，其中，所述氨基酸序列可以包括不会改变有关酶的功能的氨基酸取代、缺失或添加。技术人员可以理解的是，从其他来源分离的编码G3PDH的基因同样适用于本发明。编码G3P磷酸酶的基因是已知的。例如，业已从酿酒酵母中分离了GPP2，它具有SEQ ID NO5所示的碱基序列，该序列编码SEQ ID NO56所示的氨基酸序列(Norbeck等，生物学化学杂志271，13875，1996)。
对于本发明来说，编码G3P磷酸酶活性的任何基因都能适用于本发明，其中，所述活性能够催化将甘油-3-磷酸和水转化成甘油和无机磷酸。另外，编码G3P磷酸酶的氨基酸序列的任何基因，相当于基因GPP2和GPP1都能在本发明中起作用，包括含有不会影响G3P磷酸酶的功能的氨基酸取代、缺失或添加的任何氨基酸序列。本领域技术人员可以理解的是，从其他来源分离的编码G3P磷酸酶的基因同样适用于本发明中。宿主细胞适用于重组生产1，3-丙二醇的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，并且仅受宿主细胞表达1，3-丙二醇途径的有活性的酶的能力限制。合适的宿主细胞可以是细菌，如柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、气杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属、和假单胞菌属。本发明优选大肠杆菌、E.blattae、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属和气杆菌属。
利用以下通用方法可以将微生物转化成高效价1，3-丙二醇的生产菌。
1.确定潜在的宿主生物中内源dhaT-样活性的存在，这种活性容许在存在1-2M 1，3-丙二醇的条件下具有稳态浓度的毒性或抑制含量的3-HP。
2.如果在潜在的宿主生物中存在这种活性的话，实施合适的诱变，以便使该活性缺失或失活。通过在存在1-2M 1，3-丙二醇的条件下检测到缺乏3-HPA的积累，证实无功能的或缺失的dhaT-样活性。
3.表达合适的基因，以便a)产生甘油，如果甘油不是碳源的话，b)甘油脱水酶和相关的维持系统，和c)yqhD。
对某些微生物来说需要考虑的因素与内源dhaT-样酶在1，3-丙二醇生产的条件下的表达或抑制有关。这些因素还可以包括甘油、葡萄糖或厌氧生活的存在。载体和表达框本发明提供了多种适用于向合适的宿主细胞中克隆、转化和表达G3PDH、G3P磷酸酶、脱水酶和脱水酶和脱水酶再活化因子的载体和转化和表达框。合适的载体是与所采用的微生物兼容的载体。例如，合适的载体可源于细菌、病毒(如噬菌体T7或M-13衍生的噬菌体)、粘粒、酵母或植物。获得和使用所述载体的方法为本领域所公知(Sambrook等，分子克隆，实验室手册，1、2、3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)。通常，所述载体或框含有指导合适的基因转录和翻译的序列、选择标记、以及能够进行自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括所述基因的5’区，它具有转录起始控制作用，以及所述DNA片段的3’区，它控制转录的终止。最优选的是，这两个控制区源于与转化的宿主细胞同源的基因。所述控制区不一定源于被选作生产宿主的特定物种所天然拥有的基因。
有众多可用于在目的宿主细胞中启动G3PDH和G3P磷酸酶基因(分别为DAR1和GPP2)表达的起始控制区或启动子，并且为本领域技术人员所熟知。实际上，能够启动这些基因表达的任何启动子都是适用于本发明的，包括，但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母中表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)。
终止控制区还可源于优选的宿主所天然具备的各种基因。可选地包括一个非必要终止位点；不过，最后包括这么一个位点。
为了实现本发明的酶的表达，将编码这种酶的DNA通过起始密码子可操作地连接在特定表达控制区上，以便表达能导致合适的mRNA的形成。本发明中特别有用的是载体pDT29和pKP32，这些载体被设计成与pAH48结合使用。pDT29和pKP32的必要因子源于从肺炎克雷伯氏菌中分离的dha调节子。pDT29含有开放读框dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2和dhaB3、其序列包含在SEQ ID NO1中的核苷酸。pKP32含有与pDT29上相同的一组开放读框，这些读框来自相同的来源，所不同的pKP32缺乏dhaT。PAH48是用于将DAR1和GPP2基因导入宿主细胞的载体，更具体地讲，包括从酿酒酵母中分离的dhaR1和GPP2基因。合适宿主的转化和基因的表达，以便生产1，3-丙二醇一旦构建了合适的框，就将其用于转化合适的宿主细胞。将含有编码G3PDH、G3P磷酸酶、脱水酶和脱水酶再活化因子的框导入宿主细胞可以通过已知方法完成，如通过转化(例如，使用钙透化细胞、电穿孔)，或通过用重组噬菌体病毒进行转染，Sambrook等，同上)。
在本发明中，完全按照一般方法和实施例中所披露的方案用框转化大肠杆菌。突变体除了所列举的细胞之外，希望本发明可以利用具有一个或多个突变的细胞，这些突变是为了提高1，3-丙二醇的产量而专门设计的。可以对在正常情况下会将碳饲养母液引向非生产途径的细胞或表现出明显的分解代谢物阻抑的细胞进行诱变，以避免这种表型缺陷。例如，很多野生型细胞会受到培养基中的葡萄糖和副产品的分解代谢产物阻抑，并且希望这种野生型生物的突变菌株能够产生1，3-丙二醇，它是抗葡萄糖阻抑的，因此特别适用于本发明。
产生突变体的方法是常见的并且为本领域所熟知。例如，可以用各种试剂，如射线或化学诱变剂处理野生型细胞，然后筛选所需要的表型。当通过辐射产生突变时，可以使用紫外线或离子化射线。用于遗传诱变的合适的短波紫外线波长落在200-300纳米范围内，优选254纳米。在这种波长范围内的紫外线辐射主要会导致核酸序列上的鸟嘌呤和胞嘧啶改变成腺苷和胸苷。由于所有细胞都具备修复大多数紫外线诱导的突变的DNA修复机制，可以添加诸如咖啡因和其他抑制剂的试剂，以便阻止该修复过程，并增加有效突变的数量。使用300-400范围内的光线的长波紫外线诱变也是可行的，但通常不如短波紫外线有效，除非与各种活化剂结合使用，如能与DNA相互作用的补骨脂素染料。
通过化学试剂进行的诱变也可用于产生突变体，并且常用的物质包括能影响非复制DNA的化合物，如HNO2和NH2OH，以及能影响复制DNA的试剂，如丫啶染料，以能引起移码突变而著称。利用辐射或化学试剂产生突变体的具体方法在本领域有大量报导。例如，参见ThomasD.Brock，生物技术工业微生物学教科书，第2版，1989，SinauerAssociates公司，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V，应用生物化学生物技术36，227，1992，收作本文参考。
在发生诱变之后，可以通过多种方法筛选具有所需表型的突变体。随机筛选是最常用的，其中，选择诱变细胞产生所需产物或中间物的能力。另外，可以通过在选择培养基上生长诱变的群体对突变型进行选择性分离，其中，只有抗性菌落能够发育。突变体筛选方法是高度发达的，并且为工业微生物学领域所熟知。例如，参见Brock，同上；DeMancilha等，食品化学14，313，1983。
还可以通过破坏编码不需要的酶的基因达到消除不需要的酶活性的目的。所述方法为本领域技术人员所熟知，并且在例4和例8中加以说明。改变1，3-丙二醇生产途径代表性酶途径。由葡萄糖生产1，3-丙二醇可以通过下面的一系列步骤完成。这一系列步骤是本领域技术人员所公知的多种途径的代表，并且示于图5中。葡萄糖在糖酵解途径的酶的作用下通过一系列步骤转化成二羟基丙酮磷酸(dhaP)和3-磷酸-甘油醛(3-PG)。然后通过将dhaP水解成二羟基丙酮(dha)然后还原，或者将dhaP还原甘油-3-磷酸(G3P)然后水解而产生甘油。所述水解步骤可以通过多种细胞磷酸酶中的任一种催化，已知这些酶对其底物是非专一性的，或者通过重组将所述活性导入宿主。所述还原步骤可以由NAD+(或NADP+)连接的宿主酶催化，或者通过重组将该活性导入宿主。可以理解的是，DAH调节子含有能催化公式3的可逆的反应的甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)。
甘油→3-HPA+H2O (公式1)3-HPA+NADH+H+→1，3-丙二醇+NAD+(公式2)甘油+NAD+→DHA+NADH+H+(公式3)正如上文所详细披露的，通过中间体3-羟基丙醛(3-HPA)将甘油转化成1，3-丙二醇。中间体3-HPA是在脱水酶的作用下由甘油产生的，公式1，这种酶可以由宿主编码或者通过重组导入宿主。这种脱水酶可以是甘油脱水酶(E.C.1.1.1.30)、二醇脱水酶(E.C.4.2.1.28)或任何能催化这种转化的酶。甘油脱水酶，而不是二醇脱水酶是由dha调节子编码的，1，3-丙二醇是在NAD+(或NADP+)连接的宿主酶的作用下由3-HPA产生的，公式2，或者可以通过重组将该活性导入宿主。在生产1，3-丙二醇中的最终反应可以由1，3-丙二醇脱氢酶(E.C.1.1.1.202)或其他醇脱氢酶催化。
能影响碳通道的突变和转化。含有在1，3-丙二醇生产途径上发生了变异的多种突变微生物可用于本发明中。例如，将磷酸丙糖异构酶突变(tpi-)导入本发明微生物中就是利用突变改善碳通道性能的一个例子。磷酸丙糖异构酶是决定DAHP转化成3-磷酸甘油醛的酶，并因此使得碳流偏离由葡萄糖产生甘油和1，3-丙二醇的主要通道(图5)。因此，缺失突变(tpi-)能提高所需途径的代谢效率，这种提高是相对现有技术而言的。类似地，可以抑制通向1，3-丙二醇生产途径的其他途径的突变也可用于本发明。例如，消除甘油激酶，能够抑制在G3P磷酸酶的作用下由G3P产生甘油，避免以消耗ATP为代价将其再转化成G3P(图5)。另外，消除甘油脱氢酶(例如，gldA)能抑制在NADH决定型甘油-3-磷酸脱氢酶的作用下由dhaP产生甘油，避免其转化成二羟基丙酮(图5)。突变可以是针对结构基因的，以便损害或提高一种酶促活性，或者可以是针对调控基因的，包括启动子区和核糖体结合位点，以便调节酶促活性的表达水平。
因此，需要对转化和突变进行组合，以便控制特定酶的活性，从而提高1，3-丙二醇的产量。因此，本发明的范围包括会导致1，3-丙二醇产量提高对完整细胞催化剂的预期的修饰。
本发明利用一种优选途径由糖底物生产1，3-丙二醇，其中，碳流从葡萄糖向dhaP、G3P、甘油、3-HPA转移，并最终形成1，3-丙二醇。业已对本发明的生产菌株进行了工程改造，以便提高所述途径的代谢效率，这一目的是通过整合各种能抑制碳形成非生产化合物的缺失突变而实现的。如上文所述，通过甘油脱氢酶或甘油激酶将甘油转化成dha或G3P，可以使其不被转化成3HPA(图5)。因此，本发明的生产菌株在gldA和glpK基因含有缺失突变。类似地，通过磷酸丙糖异构酶可将dhaP转化成3-PG，因此，本发明的生产微生物还含有在该基因上的缺失突变。本发明的方法还采用了一种可将甘油转化成3HPA的脱水酶，这种酶与由dha调节子的orfX和orfZ所编码的再活化因子协调作用(图5)。尽管3HPA向1，3-丙二醇的转化通常是通过1，3-丙二醇氧化还原酶完成的，本发明的方法采用了一种非专一性催化活性，它能产生更高效价和产量的最终产物1，3-丙二醇(图5)。在这种方法中，1，3-丙二醇的效价至少可达到10克/升，其中，预计其效价为200克/升。
另外，一种生产1，3-丙二醇的改进方法可以用甘油或二羟基丙酮作底物，其中，该途径仅包括最后的三种底物，甘油→3HPA→1，3-丙二醇。在这种方法中，再次消除了氧化还原酶以便有利于非专一性催化活性(预计为醇脱氢酶)，不过，对缺失突变的需要被向培养物中添加甘油的能量因素所抵消。在这种方法中，1，3-丙二醇的效价至少可达到71克/升，其中，预期效价为200克/升。
类似地，本发明的范围还包括提供通过dhaT活性的缺失或突变而修饰过的野生型微生物的突变体，以便产生改进的1，3-丙二醇生产菌。例如，可以对天然含有dha调节子的所有因子的微生物进行操作，以便使编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT基因失活。预计这些微生物能产生更高效价和产量的1，3-丙二醇。这种效果是由于一种内源催化活性的存在介导的，这种活性预计为醇脱氢酶。
所述微生物的例子包括，但不限于克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌和梭菌。培养基和碳底物本发明的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的碳底物可以包括，但不限于单糖，如葡萄糖和果糖，寡糖，如乳糖或蔗糖，多糖，如淀粉或纤维素或其混合物以及源于可再生饲料的未纯化过的混合物，如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖浆和大麦麦芽。另外，所述碳底物还可以是单碳底物，如二氧化碳，或甲醇，业已证实了可将其代谢转化成关键的生物化学中间体。业已报导了在甲基营养酵母(K.Yamada等，农业生物化学53(2)，541-543，1989)和细菌(Hunter等，生物化学，24，4148-4155，1985)中由单碳源(例如，甲醇、甲醛或甲酸)生产甘油。所述微生物可以同化单碳化合物，在氧化状态下将甲烷转化成甲酸，并产生甘油。所述碳同化途径可以通过核酮糖单磷酸，通过丝氨酸，或通过木酮糖单磷酸(Gottschalk，细菌代谢，第2版，Springer-Verlag纽约，1996)。核酮糖单磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合成六碳糖，由它形成果糖和最终的三碳产物甘油醛-3-磷酸。类似地，丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶酸将单糖化合物同化到糖酵解途径。
除了单碳和二碳底物之外，已知甲基营养微生物还可利用多种其他含碳化合物，如甲胺、葡糖胺和代谢活性的多种氨基酸。例如，已知甲基营养型酵母能利用来自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion等，微生物生长C1化合物，[国际会议]，7th，1993，415-342。作者Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.出版Intercept，Andover，UK)。类似地，各种甲丝酵母能代谢丙氨酸或油酸(Sulter等，Arch.Microbiol.153，5，485-489，1990)。因此，预计用于本发明的碳源可以包括多种含碳底物，并且仅仅局限于微生物或方法的选择。
尽管预计上述所有碳底物及其混合物(共饲养)都适用于本发明，但优选的碳底物是葡萄糖、果糖、蔗糖、或甲醇，其中，该方法目的是生产内源甘油，以及甘油或二羟基丙酮，其中，该方法预期甘油或二羟基丙酮饲养。
除了合适的碳源之外，发酵培养基必须含有合适的矿物质、盐、辅助因子、缓冲物和本领域技术人员所公知的其他成分，这些成分适合于培养物的生长，并且能促进1，3-丙二醇生产的必需酶促途径。特别重要的是Co(II)盐和/或维生素B12或其前体。
腺苷钴胺(辅酶B12)是脱水酶活性的必要辅助因子。辅酶B12的合成出现在原核细胞中，某些原核细胞能够从头合成该化合物，例如，蟑螂埃希氏菌、克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌、和梭菌，而其他的细菌能进行部分反应。例如，大肠杆菌不能产生咕啉环结构，但能够催化钴胺向类咕啉的转化，并引入5’-脱氧腺苷基团。因此，本领域众所周知的是，需要在大肠杆菌发酵中提供辅酶B12前体，如维生素B12。
向大肠杆菌发酵液中添加维生素B12可以以恒定的速度连续添加，或者与细胞团的产生一致分阶段添加，或者可以一次或多次集中添加。添加到细胞团(OD550)中的维生素B12的优选比例(毫克)为0.06-0.60。添加到细胞团(OD550)中的维生素B12的最优选比例(毫克)为0.12-0.48。
尽管将维生素B12添加到本发明的转化过的大肠杆菌，但可以理解的是，能够从头合成B12的其他微生物也是合适的生产细胞，并且没有必要向这种微生物中添加B12。培养条件通常细胞是在35℃下在合适的培养基中生长。本发明的优选生长培养基是常用的商业制备的培养基，如LB营养液，SD营养液或YM营养液。还可以使用其他确定的或合成的生长培养基，特定微生物的合适的生长培养基为微生物学或发酵科学领域的技术人员所公知。可以用已知制剂直接或间接调节分解代谢产物抑制，例如，环化腺苷2’3’单磷酸，可将其添加到反应培养基中。类似地，还可将已知能调节酶促活性(例如，甲基viologen)导致1，3-丙二醇产量提高的制剂用于与遗传操作结合或者取代遗传操作。
发酵的合适pH范围在pH5.0-9.0之间，其中，pH6.0-8.0是优选的起始条件。
反应可以在有氧或厌氧条件下进行，其中，优选厌氧或微生物厌氧条件。
补料分批发酵可以通过添加碳进行，例如有限的或过量的葡萄糖。分批和连续发酵本发明的工艺采用分批发酵方法。典型的分批发酵是一种封闭的系统，其中，培养基的组成是在发酵开始时确定的，并且在发酵期间不进行认为的改变。因此，在发酵开始时，用需要的微生物接种所述培养基，并且在不向该培养基中添加任何东西的情况下进行发酵。不过，分批发酵通常是相对添加碳源的批次，并且通常试图控制诸如pH和氧气浓度的因素。在分批系统中，到发酵停止为止，分批系统中分解代谢产物和该系统的生物物质组成都是一直在变化的。有分批培养中，细胞通过静态置后期向高生长对数期调节，并最终达到稳定期，此时，生产速度降低或停止。如果不进行处理，稳定期的细胞会最终死亡。对数期的细胞通常决定着最终产物或中间产物的大量产生。
标准分批系统的一个变量是补料分批系统。补料分批发酵方法也适用于本发明中，并且包括一种典型的分批系统，所不同的是，随着发酵的进行逐渐增加所添加的底物。当分解代谢产物抑制能够抑制细胞的代谢并且希望在培养基中有有限数量的底物时，补料分批系统是有用的。要测定补料分批系统中的实际底物浓度是困难的，因此，根据诸如pH、溶解氧和诸如二氧化碳的废气的分压力的可测定的因素的变化进行估算。分批发酵和补料分批发酵是常用的，并且为本领域所公知，其例子见Brock，同上。
尽管本发明是以分批形式进行的，可以理解的是，本方法适用于连续的发酵方法。连续发酵是一个开放系统，向一个生物反应器中连续添加确定的发酵培养基，与此同时，取出等量的条件培养基进行加工。连续发酵通常将培养物保持在稳定的高密度，其中，细胞主要是处在对数期生长。
连续发酵可以对能影响细胞生长或最终产物浓度的一个因素或多种因素的任一种进行调节。例如，一种方法可以将诸如碳源或氮含量的有限的养分保持在固定的比例，并容许对所有其他参数降低。在其他系统中，可以连续改变多种影响生长的因素，而通过培养基浊度衡量的细胞浓度保持稳定。连续系统要尽量保持稳态生长条件，因此，由于排放培养基所导致的细胞减少必须与发酵中的细胞生长速度平衡。调节连续发酵方法的养分和生长因素的方法以及提高产物形成速度的技术为工业微生物学领域的技术人员所熟知，并且，Brock(同上)详细披露了多种方法。
可以理解的是，本发明可以用分批、补料分批或连续方法完成，并且任何已知的发酵方法都是适用的。另外，还可以将细胞固定在一种基质上作为全细胞催化剂，并在发酵条件下生产1，3-丙二醇。1，3-丙二醇的鉴定和纯化从发酵培养基中纯化1，3-丙二醇的方法在本领域中所公知的。例如，通过用有机溶剂提取反应混合物、蒸馏和柱层析可以从细胞培养基中获得丙二醇(US5356812)。用于这种方法的一种特别好的有机溶剂是环己烷(US50008473)。
可以通过对所述培养基进行高压液相层析(HPLC)分析直接鉴定1，3-丙二醇。本发明优选的方法是在分析离子交换柱上对发酵培养基进行分析，使用0.01N硫酸的移动相，以等度洗脱方式洗脱。
实施例一般方法磷酸化、连接和转化方法为本领域所公知。适用于以下实施例中的技术可以参见Sambrook，J.等，分子克隆实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社，1989。
适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法为本领域所公知。适用于以下实施例中的技术可以参见以下文献普通细菌学方法手册(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，EugeneW.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips(著)，美国微生物学协会，华盛顿特区，1994，或Thomas，D.Brock，生物技术工业微生物学教材，第2版，1989，Sinauer Associates公司，Sunderland，MA。用于细菌细胞生长和维持的所有试剂和材料均获得Aldrich化学公司(Milwaukee，WI)，DIFCO实验室(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化学公司(St.Louis，MO)，除非另有说明。
缩略语的含义如下“h”表示小时，“min”表示分钟，“sec”表示秒，“d”表示天数，“mL”表示毫升，“L”表示升，50amp是50微克/毫升氨苄青霉素，而LB-50amp是含有50微克/毫升氨苄青霉素的LB营养液。
在表中使用了以下缩略语“Con.”是转化，“Sel.”是碳的选择性，而“nd”是未检测。使用和构建的菌株和载体在下面的表中示出
酶测定脱水酶测定用甘油或1，2-丙二醇作底物测定无细胞提取物中的脱水酶活性。通常，无细胞提取物是通过用弗氏压碎器破坏细胞，然后对细胞碎片进行离心而制备的。Forage和Foster业已披露了基于醛与甲基苯并-2-噻唑酮hydrazone的反应的上述测定(生物化学生物物理学学报，569，249，1979)。
Honda等(细菌杂志143，1458，1980)披露了一种测定脱水酶再活化的方法。脱水酶活性是用甘油或1，2-丙二醇作底物在有或没有ATP的条件下在甲苯化全细胞中测定的。再活化是通过在添加或不添加ATP的条件下所形成的产物的比例测定的。产物生成(在用甘油或1，2-丙二醇作底物时产物分别为3-HPA或丙醛)是用HPLC直接测定的，或者用甲基苯并-2-噻唑酮hydrazone试剂间接测定的。另外，产物形成还可以这样测定将醛向其相应醇的转化与NADH连接的醇脱氢酶联系在一起，并监测NADH的消失。测定1，3-丙二醇氧化还原酶业已披露了(Johnson和Lin，细菌学杂志169，2050，1987)用1，3-丙二醇和NAD+作底物在溶液或板凝胶中测定无细胞提取物的1，3-丙二醇氧化还原酶活性，有时称之为1，3-丙二醇脱氢酶。另外，通过NADH的消失测定3-HPA和NADH向1，3-丙二醇和NAD+的转化。板凝胶测定具有通过大小分离1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)活性和非专一性醇脱氢酶的潜在优点。源于弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和巴氏梭菌的1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)的天然分子量通常较大，在330000-440000道尔顿的数量级上。短乳杆菌和布氏乳杆菌含有与1，3-丙二醇氧化还原酶相关的脱水酶，其特性类似于已知的1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)。测定甘油-3-磷酸脱氢酶活性采用由Bell等所披露的方法(生物学化学杂志250，7153，1975)的改进方法。该方法包括在30℃下在样品槽中培养无细胞提取物样品，该样品槽含有0.2mM NADH，2.0mM二羟基丙酮磷酸，和存在于0.1MTris-HCl，pH7.5缓冲液中的酶，以及5mM DTT，总体积为1.0毫升。首先在340纳米下测定酶和NADH反应的背景速度至少3分钟。然后添加第二种底物dhaP，并继续监测吸收值随时间的变化至少3分钟。通过从总速度中扣除背景速度确定G3PDH活性。测定甘油-3-磷酸酶活性
酶活性的测定是通过在Bis-Tris或MES和镁缓冲液，pH6.5中与一种有机磷酸底物一起培养所述提取物而进行的。所使用的底物是1-α-甘油磷酸或d，1-α-甘油磷酸。在该测定中有关试剂的最终浓度为缓冲物(20mM Bis-Tris或50mM MES)；氯化镁(10mM)；和底物(20mM)。如果该样品中的总蛋白很少，并且在用酸冷却时没有可见的沉淀出现，就在样品槽中对该样品进行常规测定。该方法包括在含有20mM底物(50微升，200mM)，50mM MES，10mM氯化镁，pH6.5缓冲液的样品槽中培养一种酶样品。最终的磷酸酶测定体积为0.5毫升。将含有酶的样品添加到反应混合物中；混合样品槽中的内含物，然后将样品槽放入37℃的循环水浴中5-120分钟，时间的长度取决于该酶样品中磷酸酶活性是否在2-0.02U/毫升范围内。通过添加钼酸(0.4毫升)终止该酶促反应。在添加Fiske SubbaRow试剂(0.1毫升)和蒸馏水(1.5毫升)之后，混合该溶液，并让其显影。10分钟之后，使颜色显现充分，在660纳米下用Cary219UV/vis分光光度计读出该样品的吸收值。将所释放的无机磷酸的量与标准曲线进行比较，标准曲线是用无机磷酸母液(0.65mM)制备的，并制备六种最终无机磷酸浓度为0.026-0.130微摩尔/毫升的标准物。测定甘油激酶活性将适量的酶，通常为无细胞粗制提取物添加到25℃的反应混合物中，该混合物含有40mM ATP，20mM硫酸镁，21mM13C均匀标记的甘油(99％，剑桥同位素实验室)，和0.1M Tris-HCl，pH9，培养75分钟。通过13C-NMR(125MHz)检测甘油向甘油-3-磷酸的转化甘油(63.11ppm，σ，J＝41Hz和72.66ppm，t，J＝41Hz)；甘油-3-磷酸(62.93ppm，σ，J＝41Hz；65.31ppm，brd，J＝43Hz；和72.66ppm，dt，J＝6，41Hz)。NADH连接的甘油脱氢酶测定在通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白之后测定来自大肠杆菌菌株的无细胞提取物中的NADH连接的甘油脱氢酶活性(gldA)。甘油和NAD+向二羟基丙酮和NADH的转化与3-[4，5-二-甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)向深颜色的甲*的转化相关联，使用PMS作介体(Tang等，细菌学杂志140，182，1997)。
电泳是用天然凝胶通过标准方法重复进行的(8％-16％TG，1.5毫米，15泳道凝胶，购自Novex，San Diego，CA)。通过用50mM Tris或碳酸钾缓冲液pH9洗涤三次10分钟除去凝胶中的残余甘油。在有和没有甘油的条件下(大约0.16M最终浓度)在15毫升测定溶液中对重复的凝胶进行显影，所述测定溶液含有50mM Tris或碳酸钾，pH9，60毫克硫酸铵，75毫克NAD+，1.5毫克MTT和0.5毫克PMS。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳之后还测定了大肠杆菌菌株中NADH连接的甘油脱氢酶活性(gldA)的存在与否，是通过与抗纯化的肺炎克雷伯氏菌甘油脱氢酶(dhaD)的多克隆抗体起反应测定的。1，3-丙二醇的分离和鉴定通过HPLC监测甘油向1，3-丙二醇的转化。分析是用层析领域技术人员可以获得的标准技术和材料进行的。一种合适的方法使用Waters Maxima820HPLC系统，使用UV(210纳米)和RI检测。将样品注射到装有Shodex SH-1011P预柱(6毫米×50毫米)的ShodexSH-1011P柱(8毫米×300毫米，购自Waters，Milford，MA)上，将温度控制在50℃，用0.01N硫酸作移动相，流速为0.5毫升/分钟。在需要定量分析时，用已知量的三甲基乙酸作外部标准物制备样品。通常，葡萄糖(RI检测)、甘油、1，3-丙二醇(RI检测)和三甲基乙酸(UV和RI检测)分别为15.27分钟，20.67分钟，36.08分钟和35.03分钟。通过GC/MS证实1，3-丙二醇的产生。分析是使用GC/MS领域技术人员可以获得的标准技术和材料进行的。一种合适的方法使用与Hewlett Packard5971系列质量选择检测仪(EI)和HP-INNOWax柱(长度30米，内径0.25毫米，膜厚度0.25微米)连接的HewlettPackard5890系列II气相层析。将所产生的1，3-丙二醇的保留时间和质谱与正规1，3-丙二醇的结果进行比较(m/e57，58)。
GC/MS的另一种方法涉及样品的衍生化。向1.0毫升样品(例如，培养上清液)中添加30微升浓缩的(70v/v)过氯酸，混合之后，冷冻样品并冻干。将bis(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺∶吡啶的1∶1的混合物(300微升)添加到冻干的材料中，剧烈搅拌并在65℃下放置1小时。通过离心使该样品中的不溶性材料澄清。所得到的液体分成两种相，将上部相用于分析。在DB-5柱(48米，内径0.25毫米，膜厚度0.25微米；购自J&W Scientific)上对样品进行层析，并将由培养上清液所获得的1，3-丙二醇衍生物的保留时间和质谱与用真正的标准物所获得的结果进行比较。TMS衍生的1，3-丙二醇的质谱含有205、177、130和155AMU的特有离子。细胞裂解通过测定发酵液中胞外可溶蛋白的浓度估算细胞裂解。在台式离心机上对发酵样品进行离心(通常在Eppendorf，5415C型微型离心机上以12000rpm的速度离心3-5分钟，以便分离细胞。然后用市场上销售的试剂(Bio-Rad蛋白测定，Bio-Rad，Hercules，CA)通过Bradford方法分析所得到的上清液的蛋白浓度。生活力通过以合适的稀释比例将从发酵罐中获得的细胞铺平板到非选择性LB琼脂平板上测定细胞生活力。比较不同发酵实验之间的细胞生活力，用每毫升发酵液的生活细胞除以OD550(AU)的比例。
例1用粘粒DNA克隆并转化大肠杆菌速度细胞，以便表达1，3-丙二醇培养基将合成的S12培养基用于筛选具有产生1，3-丙二醇的能力的细菌转化体。S12培养基含有10mM硫酸铵，50mM磷酸钾缓冲液，pH7.0，2mM氯化镁，0.7mM氯化钙，50μM氯化锰，1μM三氯化铁，1μM氯化锌，1.7μM硫酸铜，2.5μM氯化钴，2.4μM钼酸钠和2μM盐酸硫胺素。
用于生长和发酵的培养基A包括10mM硫酸铵，50mM MOPS/KOH缓冲液，pH7.5；5mM磷酸钾缓冲液，pH7.5；2mM氯化镁；0.7mM氯化钙；50μM氯化锰；1μM三氯化铁；1μM氯化锌；1.72μM硫酸铜；2.53μM氯化钴；2.42μM钼酸钠；2μM盐酸硫胺素；0.01％酵母提取物；0.01％酪蛋白氨基酸；0.8微克/毫升维生素B12；和50微克/毫升氨苄青霉素。根据需要向培养基A补充0.2％甘油或0.2％甘油+0.2％D-葡萄糖。细胞肺炎克雷伯氏菌ECL2106(Ruch等，细菌学杂志124，348，1975)(在文献中又被称为K.aerogenes或Aerobacter aerogenes)是从E.C.C.Lin处获得的(哈佛医学院，剑桥，MA)，并作为实验室培养物保持。
肺炎克雷伯氏菌ATCC25955是从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)购买的。
大肠杆菌DH5α是从Gibco/BRL购买的，并且用从肺炎克雷伯氏菌ATCC25955中分离的粘粒DNA转化。该DNA含有编码甘油或二醇脱水酶的基因。含有甘油脱水酶的粘粒被确定为pKP1和pKP2，而含有二醇脱水酶的粘粒被确定为pKP4。转化过的DH5α细胞被确定为DH5α-pKP1、DH5α-pKP2、和DH5α-pKP4。
大肠杆菌ECL707(Sprenger等，遗传微生物学杂志135，1255，1989)是从E.C.C.Lin(哈佛医学院，剑桥，MA)处获得的，并且同样用来自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA转化。这些转化体被确定为含有甘油脱水酶基因的ECL707-pKP1和ECL707-pKP1，和含有二醇脱水酶基因的ECL707-pKP4。
在tpi基因上含有突变的大肠杆菌AA200(Anderson等，遗传微生物学杂志62，329，1970)是从大肠杆菌遗传资源中心购买的，耶鲁大学(New Haven，CT)，并用克雷伯氏菌的粘粒DNA转化，以便得到含有甘油脱水酶基因的AA200-pKP1和AA200-pKP2，以及含有二醇脱水酶基因的AA200-pKP4。DH5α用5毫升LB培养基洗涤含有大约1000个用肺炎克雷伯氏菌DNA传染过的大肠杆菌L1-BlueMR菌落的6个转化平板，并离心。使细胞沉淀，并重新悬浮在5毫升LB培养基+甘油中。将一等份(50微升)接种到装有S12合成培养基和0.2％甘油+400纳克/毫升维生素B12+0.001％酵母提取物+50amp的15毫升试管中。用该培养基填充试管至顶部，并用石蜡膜封口，在30℃下培养。48小时之后观察到轻微的混浊度。分析过的在78小时和132小时能产生上述产物分布的试样是1，3-丙二醇的阳性试样，以后的时间点上含有较大量的1，3-丙二醇。
将测试为1，3-丙二醇产生阳性的细菌进行系列稀释，并铺平板到LB-50amp平板上，以便分离单菌落。分离了48个菌落，并再次检查1，3-丙二醇的产生。从6个独立的克隆中分离粘粒DNA，并转入大肠杆菌菌株DH5α中，再次检查转化体所产生的1，3-丙二醇。对两种转化体作进一步的鉴定，并命名为DH5α-pKP1和DH5α-pKP2。
将源于pKP1的12.1kb的EcoRI-SalI片段亚克隆到pIBI31(IBI生物系统，New Haven，CT)上，测序，并被命名为pK28-26(SEQ IDNO1)。测序发现了dha调节子编码甘油脱水酶的相关开放读框和调控所需基因的基因座。参见SEQ ID NO1，编码二羟基丙酮激酶的dhaK1的一段开放读框出现在1-399号碱基上(互补)；编码甘油脱氢酶的开放读框dhaD出现在1010-2107号碱基上；编码抑制剂的开放读框dhaR出现在2209-4134号碱基上；编码一种未知功能的蛋白的开放读框orfW出现在4112-4642号碱基上(互补)；编码脱水酶再活化蛋白的开放读框orfX出现在4643-4996号碱基上(互补)；编码1，3丙二醇氧化还原酶的开放读框dhaT出现在5017-6180号碱基上(互补)；编码一种未知功能的蛋白的开放读框orfY出现在6202-6630号碱基上(互补)；编码α亚基甘油脱水酶的开放读框dhaB1出现在7044-8711号碱基上；编码β亚基甘油脱水酶的开放读框dhaB2出现在8724-9308号碱基上；编码γ亚基甘油脱水酶的开放读框dhaB3出现在9311-9736号碱基上；编码脱水酶再活化蛋白的开放读框dhaBX出现在9749-11572号碱基上；以及编码甘油摄取促进蛋白的开放读框glpF的片段出现在11626-12145号碱基上。
将用源于肺炎克雷伯氏菌的包装粘粒DNA转染过的大肠杆菌XL1-Blue MR的单菌落接种到含有200微升S15培养基(硫酸铵，10mM；磷酸钾缓冲液，pH7.0，1mM；MOPS/KOH缓冲液，pH7.0，50mM；氯化镁2mM，氯化钙，0.7mM；氯化锰，50μM；三氯化铁，1μM；氯化锌，1μM；硫酸铜，1.72μM；氯化钴，2.53μM；钼酸钠，2.42μM；和盐酸硫胺素，2μM)+0.2％甘油+400纳克/毫升维生素B12+0.001％酵母提取物+50微克/毫升氨苄青霉素的微量滴定孔中。除了微量滴定孔之外，还要接种含有LB-50amp的主平板。96小时之后，取出100微升，并且在装有0.2微米尼龙膜过滤器的Rainin微型离心管中离心。保留细菌，并对过滤液进行处理以便进行HPLC分析。在筛选大约240个菌落之后鉴定能产生1，3-丙二醇的阳性克隆。鉴定了3个阳性克隆，其中的2个在LB-50amp上生长，另一个没有。从生长在LB-50amp上两个阳性克隆中分离了一个单一菌落，并证实能产生1，3-丙二醇，将其命名为pKP4。从含有pKP4的大肠杆菌菌株中分离粘粒DNA，并转化大肠杆菌菌株DH5α。证实了被称为DH5α-pKP4的一个独立转化体能产生1，3-丙二醇。ECL707用相当于pKP1、pKP2、pKP4之一的粘粒肺炎克雷伯氏菌DNA或Supercos载体本身转化大肠杆菌菌株ECL707，并分别命名为ECL707-pKP1，ECL707-pKP2，ECL707-pKP4，和ECL707-sc。ECL707的glpK、gld和ptsD是无效的，这些基因分别编码ATP-决定型甘油激酶、NAD+-连接甘油脱氢酶和作为于烯醇磷酸丙酮酸决定型磷酸转移酶系统的二羟基丙酮的酶II。
将从LB-50amp平板上分离的每一种粘粒转化的20个单菌落和Supercos载体本身(负对照)转化的5个菌落转移到LB-50amp主平板上。还测定了这些分离物将甘油转化成1，3-丙二醇的能力，以便确定其是否含有脱水酶活性。用消过毒的牙签将转化体转移到含有200微升补充了0.2％的甘油或0.2％甘油+0.2％D-葡萄糖的培养基A的微量滴定板上。在30℃下培养48小时，通过0.45微米的尼龙滤膜过滤微量滴定板孔中的内含物，并通过HPLC进行层析。该测试的结果在表2中给出。
表2由转化过的ECL707将甘油转化成1，3-丙二醇转化体甘油*甘油+葡萄糖*ECL707-pKP1 19/2019/20ECL707-pKP2 18/2020/20ECL707-pKP4 0/20 20/20ECL707-sc 0/5 0/5*(阳性分离物的数量/测试过的分离物的数量)AA200用相当于pKP1、pKP2、pKP4之一的粘粒肺炎克雷伯氏菌DNA或Supercos载体本身转化大肠杆菌菌株AA200，并分别命名为AA200-pKP1，AA200-pKP2，AA200-pKP4，和AA200-sc。菌株AA200的磷酸丙糖异构酶是无效的(tpi-)。
分离每一种粘粒转化的20个单菌落和空载体转化的5个菌落并测试其将甘油转化成1，3-丙二醇的能力，如在说明大肠杆菌菌株ECL707时所述。该测试的结果在表3中给出。
表3由转化过的AA200将甘油转化成1，3-丙二醇转化体 甘油* 甘油+葡萄糖*AA200-pKP117/20 17/20AA200-pKP217/20 17/20AA200-pKP42/20 16/20AA200-sc 0/5 0/5*(阳性分离物的数量/测试过的分离物的数量)例2大肠杆菌FM5的甘油激酶突变体的工程改造，以便由葡萄糖生产甘油构建用于在大肠杆菌FM5中进行甘油激酶基因取代的整合质粒用PuregeneDNA分离试剂盒(Gentra系统，Minneapolis，MN)制备大肠杆菌FM5(ATCC53911)基因组DNA。使用引物SEQ ID NO2和SEQ ID NO3通过PCR(Mullis和Faloona，酶学方法155，335，1987)由FM5基因组DNA扩增含有部分glpF和glpK基因的1.0kb的DNA片段。用引物SEQ ID NO4和SEQ ID NO5通过PCR由FM5基因组DNA扩增含有部分glpK和glpX基因的1.1kb的DNA片段。将一个MunI位点插入引物SEQ ID NO4。引物SEQ ID NO4的5’末端是引物SEQ ID NO3的反向互补体，以便能够随后进行重叠延伸PCR。使用上述两种PCR片段作模板和引物SEQ ID NO2和SEQ ID NO5通过PCR将通过重叠延伸技术剪接的基因(Horton等，生物技术8528，1990)用于制备2.1kb的片段。这种片段表示从1.5kb glpK基因的中央部分去掉了0.8kb。总体上讲，该片段在MunI克隆位点(在部分glpK内部)两侧具有1.0kb和1.1kb的旁侧区，以便可以通过同源重组进行染色体基因置换。
将上述2.1kb PCR片段的末端补平(使用绿豆核酸酶)，并用GeroBlunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)克隆到pCR-Blunt载体上，以便得到含有卡那霉素和Zeocin抗性基因的5.6kb的质粒pRN100。将源于pLoxCat1(结果未公开)的含有其旁侧为噬菌体P1loxP位点的氯霉素抗性基因(Snaith等，基因166，173，1995)的1.2kb HincII片段用于破坏质粒pRN100上的grpK片段，将其连接在用MunI消化过的(和末端补平)质粒pRN100上，得到6.9kb的质粒pRN101-1。用引物SEQ ID NO6和SEQ ID NO7通过PCR扩增来自载体pGP704(Miller和Mekalanos，细菌学杂志170，2575-2583，1988)的含有R6K起始的376bp片段，将末端补平，并连接到源于pRN101-1的5.3kb Asp718-AatII片段(末端补平)上，含有卡那霉素和氯霉素抗性基因的5.7kb质粒pRN102-1。用R6K起始取代pRN101-1上的ColE1起始区产生同样包括缺失了大部分Zeocin抗性基因的pRN102-1。pRN102-1复制的宿主是大肠杆菌SY327(Miller和Mekalanos，细菌学杂志170，2575-2583，1988)，该细菌含有R6K起始起作用所必需pir基因。氯霉素抗性基因被破坏了的甘油激酶突变体RJF10m的工程改造用非复制整合质粒pRN102-1电转化大肠杆菌FM5，并且在含有1mM甘油的M9基础培养基上筛选氯霉素抗性(12.5微克/毫升)和卡那霉素敏感型(30微克/毫升)的转化体对甘油的非利用。在通过Southern分析(Southern，分子生物学杂志98，503-517，1975)用完整的glpK基因检测源于上述一种突变体RJF10m的基因组DNA的EcoRI消化物时，发现它是双交换整合体(glpK基因取代)，因为观察到了由于在氯霉素抗性基因内存在另一个EcoRI位点而出现的7.9kb和2.0kb的带。野生型对照产生单一预期的9.4kb的带。对突变体RJF10m进行的13C NMR分析证实，它不能将13C标记过的甘油和ATP转化成甘油-3-磷酸。用引物组合SEQ ID NO8和SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQID NO11、以及SEQ ID NO8和SEQ ID NO11通过基因组PCR进一步分析该glpK突变体，所述PCR分别得到了预期的2.3kb、2.4kb和4.0kb PCR片段。在使用引物SEQ ID NO8和SEQ ID NO11时野生型对照产生了预期的3.5kb的带。用质粒pAH48电转化glpK突变体RJF10m。根据布达佩斯条约的规定业已于1997年11月24日将glpK突变体大肠杆菌RJF10m交由ATCC保藏。消除了对氯霉素抗性基因破坏的甘油激酶突变体RJF10的工程改造
在37℃下在YENB培养基(0.75％酵母提取物，0.8％营养液)中生长一夜之后，用质粒pJW168(结果未发表)对悬浮在水中的大肠杆菌RJF10m进行电转化，所述质粒含有受IPTG诱导型lacUV5启动子控制的噬菌体P1Cre重组酶基因，温度敏感型pSC101复制子和氨苄青霉素抗性基因。在30℃下在SOS培养基中过度生长之后，在30℃下(pJW168复制的允许温度)在补充了羧苄青霉素(50微克/毫升)和IPTG(1mM)的新鲜的LB琼脂培养基上连续两次过夜转移合并的菌落，以便在Cre重组酶的作用下在loxP位点上进行的重组剪切染色体氯霉素抗性基因(Hoess和Abremski等分子生物学杂志181，351-362，1985)。将所得到的菌落复制到补充了羧苄青霉素和IPTG的LB琼脂培养基上和补充了氯霉素(12.5微克/毫升)的LB琼脂培养基上，以便鉴定抗羧苄青霉素并且对氯霉素敏感的菌落，表明标记基因已经被除去。将上述一个菌落的在30℃下培养一夜的培养物用于接种10毫升LB培养基。在30℃下生长到OD(600纳米)为0.6AU时，在37℃下将该培养物培养一夜。将若干稀释液铺平板在预热的LB琼脂培养基上，并在42℃下将该平板培养过夜(PJW168不允许复制的温度)。将所得到的菌落复制到补充了到LB琼脂培养基和补充了羧苄青霉素(75微克/毫升)的LB琼脂培养基上，以便鉴定对羧苄青霉素敏感的菌落，表示了质粒pJW168。用引物SEQ ID NO8和SEQ ID NO11通过基因组PCR对上述glpK突变体之一RJF10作进一步的分析，并得到了预期的3.0kb的带，证实了标记基因被切除。通过其不能在含有1mM甘油的M9基础培养基上生长证实突变体RJF10不能利用甘油。用质粒pAH48对jlpK突变体RJF10进行电转化，以便由葡萄糖生产甘油。
例3构建剔除了gldA基因的大肠杆菌菌株使用分别整合了末端Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO12和SEQ ID NO13通过PCR从大肠杆菌中分离gldA基因(K.B.Mullis和F.A.Faloona，酶学方法155，335，350，1987)，并克隆到pUC18的Sph1和Xba1位点之间(T.Maniatis，1982，分子克隆，实验室手册，冷泉港，冷泉港，NY)，以便产生pKP8。裂解pKP8上gldA基因内的独特的SalI和NcoI位点，用Klenow将末端补平，并重新连接，导致缺少gldA的中央部分的109bp，并再生独特的SalI位点，以便产生pKP9。用整合了末端SalI位点的引物SEQ ID NO14和SEQ IDNO15通过PCR从pET-28a(+)(Novagen，Madison，Wis)上分离1.4kb的DNA片段，该片段含有产生卡那霉素抗性(kan)的基因，并包括翻译起始密码子上游的大约400bp DNA和翻译终止密码子下游大约100bp DNA，并将其亚克隆到pKP9的独特的SalI位点上，产生pKP13。用分别整合了末端SphI和Xba1位点的引物SEQ ID NO16和SEQ ID NO17通过PCR从pKP13上分离2.1kb的DNA片段，该片段始于gldA翻译起始密码子下游204bp，并终止于gldA翻译终止密码子上游178bp，将其亚克隆到pMAK705上Sph1和Xba1之间(Genencor国际，Palo Alto，CA)，以便产生pMP33。用pMP33转化大肠杆菌FM5，并在30℃下在20微克/毫升kan上选择，该温度是允许pMAK705复制的温度。在30℃下让一个菌落在补充了20微克/毫升kan的液体培养基中增殖一夜。将大约32000细胞铺平板到20微克/毫升kan上，并在44℃下培养16小时，该温度是pMAK705复制的限制温度。在44℃下生长的转化体具有整合到其染色体上的质粒，这种现象的发生频率大约为0.0001。通过PCR和Southern印迹(E.M.Southern，分子生物学杂志98，503-517，1975)分析确定在所述转化体中染色体整合事件的性质。通过Western印迹分析(Towbin等，美国科学院院报76，4350，1979)确定在转化体中是否产生了gldA的产物甘油脱氢酶蛋白。通过活性测定确定在转化体中是否保留了甘油脱氢酶活性。用吩嗪甲磺酸酯作介体通过将甘油+NAD+向二羟基丙酮+NADH的转化与四唑染料MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑]转化成深色钾*联系起来测定天然凝胶上甘油脱氢酶带的活性。甘油脱氢酶还需要30mM硫酸铵和100mM Tris，pH9的存在(Tang等，细菌学杂志，140，182，1997)，在8个分析过的转化体中，有6个被确定为是剔除了gldA的。业已根据布达佩斯条约规定于1997年11月24日将大肠杆菌MSP33.6交由ATCC保藏。
例4构建具有glpK和gldA基因剔除的大肠杆菌菌株用分别整合了Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO18和SEQ IDNO19通过PCR从大肠杆菌中分离1.6kb的DNA片段，该片段含有gldA基因，并包括翻译起始密码子上游的228bp的DNA，和翻译终止密码子下游的220bp的DNA，并将其克隆到pUC18的Sph1和Xba1位点之间，产生pQN2。裂解pQN2的gldA基因上的独特Sal1和Eco1位点，用Klenow将其末端补平，并重新连接，导致缺失了gldA中部的109bp，并再生独特的Sal1位点，产生pQN4。以Stu1/Xho1片段形式从pLoxKan2(Genencor国际，Palo Alto，CA)上分离1.2kb的DNA片段，该片段含有产生卡那霉素抗性的基因(kan)以及旁侧的loxP位点，用Klenow补平末端，并在用Klenow补平末端之后亚克隆到pQN4上的Sal1位点上，产生pQN8。用分别整合了末端Sph1和Xba1位点的引物SEQ ID NO20和SEQ ID NO21通过PCR从pGP704(Miller和Mekalanos，细菌学杂志170，2575-2583，1988)上分离含有R6K复制起点的0.4kb的DNA片段，并连接到含有来自pQN8的gldAkan框的2.8kb Sph1和Xba1 DNA片段上，产生pKP22。以Xba1片段形式从pLoxKan2(Genencor国际，Palo Alto，CA)上分离1.0kb的DNA片段，该片段含有产生氯霉素抗性的基因(cam)以及旁侧的loxP位点，并亚克隆到pKP22上的Xba1位点上，产生pKP23。用pKP23转化glpK-的大肠杆菌菌株RJF10(参见例2)，并分离具有kanRcamS表型的转化体，表明发生了双交换整合，这一结果是通过Southern印迹分析证实的。甘油脱氢酶凝胶活性测定(如例3所述)表明，有活性的甘油脱氢酶不存在于这些转化体中。如例2所示，用能产生Cre的质粒pJW168从染色体上除去kan标记，以便产生菌株klp23。若干具有kanS表型的分离物没有表现出甘油脱氢酶活性，并且Southern印迹分析证实了kan标记的消失。
例5构建用于表达甘油3-磷酸脱氢酶(DAR1)和/或甘油3-磷酸酶(GPP2)的质粒和菌株构建甘油3-磷酸酶的表达框(gpp2)酿酒酵母染色体Vλ克隆6592(GenBank，保藏号U18813X11)是从ATCC获得的。克隆3-磷酸酶基因(GPP2)，是通过用合成引物(SEQID NO22和SEQ ID NO23)克隆来自λ克隆的靶DNA而实现的，在5’末端整合了BamHI-RBS-Xba1位点，并在3’末端整合了Sal1位点。将该产物亚克隆到pCR-Script(Stratagene，Madison，WI)上的Srf1位点上，产生含有GPP2的质粒pAH15。质粒pAH15含有处于无活性方向的GPP2基因，以便由pCR-ScriptSK+上的lac启动子表达。将来自pAH15的含有GPP2基因的BamHI-Sal1片段插入pBlueScriptIISK+上，产生质粒pAH19。pAH19含有正确方向的GPP2基因，以便由lac启动子表达。将来自pAH19的含有GPP2基因的Xba11-pST1片段插入pPHOX2上，产生质粒pAH21。PAH21/DH5α是表达质粒。构建甘油3-磷酸脱氢酶的表达框(DAR1)用合成引物(SEQ ID NO24和SEQ ID NO25)通过PCR克隆从酿酒酵母基因组DNA中分离DAR1。成功的PCR克隆将一个Nco1位点插入DAR1的5’末端，其中，Nco1内部的ATG是DAR1的起始甲硫氨酸。在DAR1的3’末端紧随翻译终止子之后引入一个BamHI位点。用Nco1+BamHI消化该PCR片段，并克隆到表达质粒pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的相同位点上，产生pDAR1A。
为了在DAR1的5’末端产生一个更好的核糖体结合位点，将通过退火合成引物(SEQ ID NO26和SEQ ID NO27)获得的Spe1-RBS-Nco1接头插入pDAR1A的Nco1位点，产生pAH40。质粒pAH40含有正确方向的新的RBS和DAR1基因，以便pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc启动子表达。将来自pDAR1A的Nco1-BamHI片段和第二套通过退火合成引物(SEQ ID NO28和SEQ ID NO29)获得的Spe1-RBS-Nco1接头插入pBC-SK+(Stratagene，Madison，WI)的Spe1-BamHI位点上，产生质粒pAH42。质粒pAH42含有氯霉素抗性基因。构建dar1和gpp2的表达框DAR1和GPP2的表达框是用标准分子生物学方法由上述独立的DAR1和GPP2亚克隆组装而成的。将来自pAH19的含有核糖体结合位点(RBS)和GPP2基因的BamHI-Pst1片段插入pAH40，产生pAH43。将来自pAH19的含有RBS和GPP2基因的BamHI-Pst1片段插入pAH42，产生pAH45。
按以下方式修饰GPP2 5’末端的核糖体结合位点。通过将合成的引物GATCCAGGAAACAGA(SEQ ID NO30)和CTAGTCTGTTTCCTG(SEQ IDNO31)与来自pAH19的含有GPP2基因的Xba1-Pst1片段退火获得的Spe1-RBS-Nco1接头插入pAH40的BamHI-Pst1位点上，产生pAH48。质粒pAH48含有DAR1基因，修饰过的RBS和正确方向的GPP2基因，以便由pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc启动子表达。转化大肠杆菌用标准分子生物学技术将上述质粒转入大肠杆菌DH5α、MF5和KRP23。通过其DNA RFLP形式证实转化体。
例6构建用于转化大肠杆菌的具有源于肺炎克雷伯氏菌dha调节子的基因的表达质粒构建表达载体pTacIQ通过将lacIq基因(Farabaugh，自然274，5673，765-769，1978)和tac启动子(Amann等，基因25，167-178，1983)插入pBR322(Sutcliffe，冷泉港定量生物学会议，43，77-90，1979)的EcoRI限制内切酶位点上制备大肠杆菌表达载体pTacIQ。用多克隆位点和终止序列(SEQ ID NO32)取代pBR322上从EcoRI到SPHL的序列。亚克隆甘油脱水酶基因(dhaB1、2、3、X)用在5’末端整合了EcoRI位点在3’末端整合了Xba1位点的引物(SEQ ID NO33和SEQ ID NO34)通过PCR扩增来自pHK28-26的dhaB3基因的开放读框。将产物亚克隆到pLitmus29(新英格兰生物实验室公司，Beverly，MA)上，产生含有dhaB3的质粒p dhaB3。
用限制酶Kpn1和EcoRI将源于pHK28-26的含有编码dhaB调节子的dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaBX的完整编码区的片段亚克隆到pBluescriptIKS+(Stratagene，La Jo11a，CA)上，产生质粒pM7。通过用Apa1和Xba1消化质粒pM7除去dhaBX基因，纯化5.9kb片段，将其与源于质粒的p dhaB3的325bp的Apa1-Xba1片段连接，产生含有dhaB1、dhaB2和dhaB3的pM11。用在5’末端整合了HindIII位点和一个共有核糖体结合位点并在3’末端整合了Xba1位点的引物(SEQ ID NO35和SEQ ID NO36)通过PCR扩增来自pHK28-26的dhaB1基因的开放读框。将该产物亚克隆到pLitmus28(新英格兰生物实验室公司，Beverly，MA)上，产生含有dhaB1的质粒pDT1。
将来自pM11的含有部分dhaB1基因、dhaB2基因和dhaB3基因的Not1-Xba1片段插入pDT1上，产生dhaB表达质粒pDT2。将来自pDT2的含有dhaB(1、2、3)基因的HindIII-Xba1片段插入pTacIQ上，产生pDT3。亚克隆1，3-丙二醇脱氢酶基因(dhaT)将pHK28-26的含有1，3-丙二醇脱氢酶(dhaT)基因的Kpn1-Sac1片段亚克隆到pBluescriptIIKS+上，产生质粒pAH1。用pAH1作模板DNA和在其5’末端整合了Xba1位点在其3’末端整合了BamHI位点的合成引物(SEQ ID NO37和SEQ ID NO38)通过PCR扩增dhaT基因。将该产物亚克隆到pCR-Script(Stratagene)的Srf1位点上，以便产生含有dhaT的质粒pAH4和pAH5。质粒pAH4含有正确方向的dhaT基因，以便由pCR-Script上的lac启动子表达，而pAH5含有相反方向的dhaT基因。将来自pAH4的含有dhaT基因的Xba1-BamHI片段插入pTacIQ上，以便产生质粒pAH8。将来自pAH8的含有RBS和dhaT基因的HindIII-BamHI片段插入pBluescriptIIKS+上，产生pAH11。构建dhaT和dhaB(1、2、3)的表达框用标准分子生物学方法由上述单独的dhaB(1、2、3)和dhaT亚克隆组装dhaT和dhaB(1、2、3)的表达框。将含有来自pDT3的dhaB(1、2、3)基因的Sp1-Sac1片段插入pAH11的Sp1-Sac1位点上，产生pAH24。将Sal1和Xba1接头(SEQ ID NO39和SEQ ID NO40)插入用限制酶Sal1-Xba1消化过的pAH5上，产生pDT16。所述接头破坏了Xba1位点。然后将来自pDT16的1kb的Sal1-Mlu1片段插入pAH24上，取代现有的Sal1-Mlu1片段，产生pDT18。将来自pDT18的Sal1-Nto1片段和来自pM7的Nto1-Xba1片段插入pCL1920(SEQ IDNO41)上构建pDT21。通过PCR克隆来自酵母属的葡萄糖异构酶启动子序列(SEQ ID NO42)，并插入pLitmus28的EcoRI-HindIII位点上，构建pDT5。通过将pDT5的EcoRI-PvuII片段插入pCL1920的EcoRI-PvuI位点上构建pCL1925。通过将pDT21的HindIII-MluII片段和pDT21的MluI-Xba1片段克隆到pCL1925的HindIII-Xba1位点构建pDT24。构建dhaT和dhaB(1、2、3、X)的表达框通过将pDT18的Sal1-Nto1片段和pM7的Nto1-Xba1片段插入pCL1920上构建pDT21(SEQ ID NO41)。通过PCR克隆来自酵母属的葡萄糖异构酶启动子序列(SEQ ID NO42)，并插入pLitmus28的EcoRI-HindIII位点上，构建pDT5。通过将pDT5的EcoRI-PvuII片段插入pCL1920的EcoRI-PvuI位点上构建pCL1925。通过将pDT21的HindIII-MluII片段和pDT21的MluI-Xba1片段克隆到pCL1925的HindIII-Xba1位点构建pDT24。构建dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW和dhaB(1、2、3、X)的表达框通过将pHK28-26的Sac1-EcoRI片段插入pCL1925的Sac1-EcoRI位点构建pDT29。
构建dhaR、orfY、orfX、orfW和dhaB(1、2、3、X)的表达框构建质粒pDT29的衍生物，其中，通过已知技术，如PCR介导的重叠延伸去掉了除了基因dhaT的头5个和最后5个密码子(加上终止密码子)的所有密码子。使用pDT29作模板，两种一级PCR产物是用以下引物制备的SEQ ID NO43＝5′GAC GCA ACA GTA TTC CGT CGC3′；SEQ ID NO44＝5′ATG AGC TAT CGT ATG TTC CGC CAG GCA TTC TGAGTG TTA ACG3′；SEQ ID NO45＝5′GCC TGG CGG AAC ATA CGA TAG CTC ATA ATATAC3′；SEQ ID NO46＝5′CGG GGC GCT GGG CCA GTA CTG3′.
将SEQ ID NO45和SEQ ID NO46进行配对，以便制备931bp的产物，该产物含有包括5’dhaB1(至独特的Sca1位点)所有的orfY、和dhaT的头5个密码子的核酸。将SEQ ID NO43和SEQ ID NO44进行配对，以便制备1348bp的产物，该产物含有包括dhaT的头5个密码子(加上终止密码子)、所有orfX、所有orfW和5’dhaR(至独特的Sap1位点)的核酸。SEQ ID NO44的5’末端的15个碱基构成了一个尾巴，它是SEQ ID NO45的15个碱基部分的反向互补体。类似的，SEQ ID NO45的5’末端的11个碱基构成了一个尾巴，它是SEQ IDNO44的41个碱基部分的反向互补体。因此，两种一级PCR产物在退火之后连接在一起(通过26bp的尾巴重叠)，并通过PCR延伸，产生2253bp的第三种核酸产物。用Sap1和Sca1消化第二种PCR产物，并连接到同样用Sap1和Sca1消化的pDT29上，制备质粒pKP32，除了在dhaT内部有较大的框内缺失之外，它与pDT29相同。
例7用大肠杆菌菌株KLP23/pAH48/pDT29将葡萄糖转化成1，3-丙二醇，以及利用KLP23/pAH48/pKP32的改进方法预培养对KLP23/pAH48/pDT29和KLP23/pAH48/pKP32进行预培养，以便接种装在发酵罐中的含有200毫克/升羧苄青霉素(或氨苄青霉素)和50毫克/升壮观霉素的2YT培养基(10克/升酵母提取物，16克/升胰化蛋白胨，和10克/升氯化钠)。KLP23/pAH48/pKP32与KLP23/pAH48/pDT29相同，所不同的是缺失了dhaT。
培养物来自冷冻的母液(用10％DMSO作防冻剂)，在2升三角烧瓶中的500毫升培养基中在35℃下生长，在摇床上以250rpm的速度摇动，直到OD550达到大约1.0AU，并将其用于接种发酵罐。发酵培养基在发酵容器中对同时对以下成分进行消毒45克磷酸二氢钾，12克柠檬酸，12克7水硫酸镁，30克酵母提取物，2.0克柠檬酸铁铵，5毫升Mazu DF204作为抗泡末剂，1.2克2水氯化钙，和7.3毫升硫酸。用20％-28％的氢氧化铵将pH提高到6.8，然后添加以下成分1.2克羧苄青霉素或氨苄青霉素，0.30克壮观霉素，60毫升微量元素溶液和葡萄糖(占添加量的60％-67％)。在培养之后，其体积为6升，葡萄糖的浓度为10克/升。微量元素的溶液含有(克/升)1水柠檬酸(4.0)，1水硫酸锰(3.0)，氯化钠(1.0)，7水硫酸铁(0.10)，6水氯化钴(0.10)，7水硫酸锌(0.10)，5水硫酸铜(0.010)，硼酸(0.010)和2水钼酸钠(0.010)。发酵生长用上述培养基制备15升搅拌箱式发酵罐。将温度控制在35℃，并用氨水(重量百分比为20-28％)将pH控制在6.8。设定空气流速(将最低值设定为6-12标准升/分钟)和搅拌速度(将最低值设定为350-690rpm)的初始值，以便当OUR达到大约140mM/升/小时时，启动到溶解氧气(DO)的控制。反压力控制在0.5巴，DO控制在10％。除了有很小的误差之外，葡萄糖保持在占饲养物量的60％或67％，在0-10克/升之间。按照下面的说明添加维生素B12和辅酶B12。用KLP23/pAH48/pDT29发酵在表5中给出了用大肠杆菌菌株KLP23/pAH48/pDT29将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵方法的概述。从接种后3小时开始添加维生素B12(0.075克/升，500毫升)，添加速度为16毫升/小时。所获得的1，3-丙二醇的产量为24wt％(1，3-丙二醇克数/消耗的葡萄糖克数)，效价为68克/升1，3-丙二醇。
表4用大肠杆菌菌株KLP23/pAH48/pDT29将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述时间(小时)OD550(AU)DO(％)葡萄糖(g/L)甘油(g/L)1，3-PD(g/L)0 0 150 12.9 0.00617 80 8.3 3.111242 53 2.8 12.591898 9 5.7 12.6 3224 136 11 32.8 12.0 5130 148 10 12.3 13.3 6232 152 11 12.5 14.3 6538 159 11 1.5 17.2 68在发酵期间以2倍的浓度添加维生素B12或集中添加维生素B12获得了类似的结果。所获得的最高效价为77克/升。使用KLP23/pAH48/pKP32的改进发酵在表4中给出了用大肠杆菌菌株KLP23/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述。从接种后3小时开始添加维生素B12(0.150克/升，500毫升)，添加速度为16毫升/小时。36小时之后，对大约2升发酵液进行净化，以便可以连续添加葡萄糖饲养物。所获得的1，3-丙二醇的产量为26wt％(1，3-丙二醇克数/消耗的葡萄糖克数)，效价为112克/升1，3-丙二醇。
表5用大肠杆菌菌株KLP23/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述时间(小时)OD550(AU)DO(％)葡萄糖(g/L)甘油(g/L)1，3-PD(g/L)0 0 148 12.8 0.00622 84 6.9 3.301234 90 9.7 10.471866 43 9.3 5.9 2424 161 9 0.2 2.5 4630 200 10 0.2 6.0 6736 212 10 1.2 9.7 8842 202 2 0.1 15.5 9848 197 12 1.2 23.8 112在发酵期间以1/2的浓度添加维生素B12或集中添加维生素B12获得了类似的结果。所获得的最高效价为114克/升。
例8为了提高由葡萄糖产生1，3-丙二醇的产量而对大肠杆菌KLP23的磷酸丙糖异构酶突变体进行的工程改造构建用于置换大肠杆菌KLP23中磷酸丙糖异构酶基因的质粒用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra系统，Minneapolis，MN)制备大肠杆菌KLP23基因组DNA。用引物SEQ ID NO47和SEQ ID NO48通过PCR(Mullis和Faloona，酶学方法，155，335-350，1987)由KLP23基因组DNA扩增cdh和翻译磷酸丙糖异构酶(tpiA)基因的3’末端的1.0kb DNA片段。用引物SEQ ID NO49和SEQ ID NO50通过PCR由KLP23基因组DNA扩增含有tpiA、yiiQ的5’末端和tiiR基因的5’末端的1.0kb DNA片段。在引物SEQ ID NO49上整合一个Sca1位点。引物SEQ ID NO49的5’末端是引物SEQ ID NO48的反向互补体，以便随后能够进行重叠延伸PCR。将通过重叠延伸技术进行的基因剪接(Horton等，生物技术，8，528-535，1990)用于通过PCR制备2.0kb的片段，使用上述两种PCR片段作模板和引物SEQ ID NO47和SEQ ID NO50。该片段代表具有768bp tpiA结构基因缺失了73％。总体上讲，该片段在Sca1克隆位点(在部分tpiA内部)两侧具有1.0kb的旁侧区，以便能够通过同源重组进行染色体基因置换。
用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)将上述平端2.0kb的PCR片段克隆到pCR-Blunt载体上，得到含有卡那霉素和Zeocin抗性基因的5.5kb的质粒pRN106-2。通过将其连接在Sca1消化过的质粒pRN106-2上，用来自pLoxCat1(结果未公开)的含有其旁侧为噬菌体P1loxP位点(Snaith等，基因166，173-174，1995)的氯霉素抗性基因1.2kb HincII片段，破坏质粒pRN106-2上的tpiA片段，得到6.8kb的质粒pRN107-1。通过线性DNA转化对磷酸丙糖异构酶突变体RJ8m进行工程改造使用pRN107-1作模板和引物SEQ ID NO47和SEQ ID NO50对含有tpiA旁侧区和loxP-CmR-loxP框的3.2kb片段进行PCR扩增和凝胶提取。用至多1微克这种3.2kb的线性DNA片段对大肠杆菌KLP23进行电转化，在M9基础培养基上对氯霉素抗性(12.5微克/毫升)和卡那霉素敏感(30微克/毫升)的转化体作进一步的筛选，筛选其在1mM葡萄糖上对葡萄糖的利用较茶，能正常利用1mM葡萄糖酸，以及确保宿主KLP23在1mM甘油上的甘油非利用表型。在通过Southern分析(Southern，分子生物学杂志98，503-517，1975)用完整的tpiA基因检测源于上述突变体RJ8m的基因组DNA的EcoRI消化物时发现，它是双交换复合体(tpiA基因置换)，因为观察到了由于在氯霉素抗性基因上存在另一个EcoRI位点而出现的两个预期的6.6kb和3.0kb的带。正如所预料的，宿主KLP23和野生型FM5分别控制所产生的单一的8.9kb和9.4kb的带。用引物SEQ ID NO51和SEQ ID NO52通过基因组PCR对tpiA突变体作进一步的分析，它能产生预期的4.6kbPCR片段，而对于相同的引物对来说，KLP23和野生型FM5菌株都产生预期的3.9kb PCR片段。在用甘油醛3-磷酸作底物检测来自tpiA突变体RJ8m和所述KLP23的无细胞提取物的tpiA活性时，在RJ8m上没有观察到活性。用质粒pH48对tpiA突变体RJ8m进行电转化，以便由葡萄糖产生甘油，同样用质粒pAH48和PDT29或pKP32进行转化，以便由葡萄糖产生1，3-丙二醇。消除RJ8m上的氯霉素抗性标记以便得到RJ8。
例9用大肠杆菌菌株RJ8/pAH48/PDT29将葡萄糖转化成1，3-丙二醇以及利用RJ8/pAH48/PKP32的改进的方法预培养对RJ8/pAH48/PDT29和RJ8/pAH48/PKP32进行预培养，以便按例7所述接种发酵罐。RJ8/pAH48/PKP32与RJ8/pAH48/PDT29相同，是不同的是缺失了dhaT。发酵培养基发酵培养基如例7所述。发酵生长发酵生长如例7所述，所不同的是设定空气流速(将最低值设定为5-6标准升/分钟)和搅拌速度(将最低值设定为300-690rpm)的初始值，以便当OUR值达到60-100mM/升/小时时开始对溶解氧气(DO)的控制。按下文所述添加维生素B12或辅酶B12。用RJ8/pAH48/PDT29进行发酵用大肠杆菌菌株RJ8/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述在表6中示出。分别在2、8和24小时集中添加2、16和18毫克维生素B12。所获得的1，3-丙二醇的产量为35wt％(1，3-丙二醇克数/消耗的葡萄糖克数)，效价为50.1克/升1，3-丙二醇。
表6用大肠杆菌菌株RJ8/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述时间(小时)OD550(AU)DO(％)葡萄糖(g/L) 甘油(g/L)1，3-PD(g/L)00 140 10.6 0.1 0.065 107 11.1 0.5 0.410 16 90 8.5 1.7 1.314 25 86 1.8 2.4 5.919 38 53 3.5 5.9 15.425 53 38 0.1 9.2 26.731 54 10 4.5 7.4 39.037 37 23 17.2 6.0 45.043 21 13 9.9 7.7 50.1用大肠杆菌菌株RJ8/pAH48/pKP32的改进发酵用大肠杆菌菌株RJ8/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述在表7中示出。分别在大约26和44小时集中添加48和16毫克维生素B12。所获得的1，3-丙二醇的产量为34wt％(1，3-丙二醇克数/消耗的葡萄糖克数)，效价为129克/升1，3-丙二醇。
表7用大肠杆菌菌株RJ8/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的代表性发酵概述时间(小时)OD550(AU)DO(％)葡萄糖(g/L)甘油(g/L)1，3-PD(g/L)0 0 150 12.60.10612 113 6.02.601224 99 0.0 10.601851 76 2.4 28.902478 82 2.4 44.2530 114 70 3.8 26.9 3336 111 72 0.0 20.0 5742 139 65 0.1 21.9 6948 157 36 0.1 22.4 7955 158 25 0.2 21.4 9464 169 14 0.1 15.8 11372 169 12 0.1 13.4 11974 162 14 0.1 14.8 129例10在改进的1，3-丙二醇方法中鉴定大肠杆菌非专一性催化活性(yqhD)在具有改进了的催化剂的1，3-丙二醇生产发酵液中证实非专一性催化活性通过测定完整细胞的1，3-丙二醇脱氢酶活性证实在发酵条件下，在添加维生素B12并产生3-羟基丙醛之后，而不是之前在大肠杆菌中存在非专一性催化活性。基本上按例7所述在10升的发酵罐中生长分别含有甘油生产质粒pAH48和1，3-丙二醇生产质粒pKP32的重组大肠杆菌菌株。当发酵容器中OD550达到大约100时添加维生素B12药团(48毫克)。在添加维生素B12之前和2小时之后马上从该容器中采集细胞样品。通过离心回收细胞，并用含有150微克/毫升氯霉素的PBS缓冲液重新悬浮至其原有体积，以便抑制新的蛋白合成。将合适体积的用氯霉素处理过的细胞添加到含有一种反应混合物(PBS缓冲液，含有10克/升葡萄糖，10克/升甘油，1毫克/升辅酶B12，和150微克/毫升氯霉素)的250毫升的隔板烧瓶中，使最终体积为50毫升，OD550大约为10。对所述烧瓶遮光，在35℃下以250rpm的速度摇动。随时间对试样进行HPLC分析。在含有从添加维生素B12之前或之后的发酵罐中回收的细胞的烧瓶中观察到了3-HPA依赖于时间的产生。相反，仅在装有从添加维生素B12之后的发酵罐中回收的细胞的烧瓶中观察到了较高含量的1，3-丙二醇。检测无细胞提取物中的非专一性催化活性通过天然凝胶活性菌株测定证实无细胞提取物中非专一性催化活性。在添加维生素B12之前和之后从分别采用了含有甘油生产和1，3-丙二醇生产质粒pAH48和pKP32的重组大肠杆菌菌株的相应的10升发酵物中回收细胞。用弗氏破碎器破碎细胞，以便制备无细胞提取物。将所述无细胞提取物、纯的肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脱氢酶(dhaT)的制剂、和分子量标准物加样到天然梯度聚丙烯酰胺凝胶上并展开。然后让所述凝胶接触底物1，3-丙二醇和NAD+或乙醇或NAD+。正如所预料的，在所述凝胶上，当用1，3-丙二醇作底物时，观察到了dhaT的活性菌株，它在所述天然凝胶上的迁移位置大致为340千道尔顿。该活性仅在添加了纯的肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脱氢酶的泳道上出现。相反，当用1，3-丙二醇作底物并添加维生素B12之后的无细胞提取物时，非专一性催化活性出现在大约90千道尔顿处。当用乙醇作底物时，观察不到所述dhaT带和非专一性催化活性带，但在添加维生素B12之前和之后出现了一个大约为120千道尔顿的独立的带。这种新的带极有可能造成对乙醇底物具有专一性的醇脱氢酶，它通常存在于所有生物中。
这种天然凝胶测定在酶促测定步骤之前通过分子量将蛋白分离，这样提供了在用具有低活性的结构还原1，3-丙二醇时的更高的灵敏度和准确性，并且该活性很有可能与对乙醇底物有专一性的醇脱氢酶不同，已经对大肠杆菌的醇脱氢酶作过充分的鉴定，并发现它存在于所有生物中。醇脱氢酶测定的原理是，醇脱氢酶能催化电子1，3-丙二醇(或其他醇)向NAD+转移。然后由PMS偶连NADH和溴化四唑染料之间的电子转移，它在凝胶中形成一种沉淀物。在所述底物中浸泡1夜之后，洗涤所述凝胶，以便除去试剂和可溶性染料。在所述凝胶上有活性脱氢酶的带上形成一种不溶性兰色染料。该测定的各个方面业已由Johnson和Lin披露(细菌学杂志169，2050，1987)。纯化并鉴定大肠杆菌中的非专一性催化活性用来自典型的1，3-丙二醇生产产物中收获的细胞进行非专一性催化活性的大规模部分纯化，如例7中使用KLP23/pAH48/pKP32的改进方法中所述。洗涤细胞沉淀(16克)并重新悬浮在20毫升50mM HEPES缓冲液，pH7.5，共进行3次。通过超声波裂解悬浮液中的细胞。通过离心获得无细胞提取物(10分钟，20000xg，10℃)，并通过添加200毫克硫酸鱼精蛋白同时在冰上搅拌将上清液进一步澄清。通过离心(20分钟，20000xg，10℃)获得上清液，并通过用HEPES缓冲液平衡的Superdex200制备级柱(6×60厘米)进行分离。收集分别为10毫升的级份，用10000MW截断Centricon膜将每一份样品浓缩25倍，然后将天然凝胶活性菌株进行测定。在107-112号级份中鉴定到了所述非专一性催化活性，高峰活性出现在108-109号级份中，将108和109号级份的较大的试剂样(各7毫升)浓缩50倍，并加样到有12个泳道的天然凝胶的所有泳道中。将所述凝胶一分为二，将一半用于对脱氢酶活性进行染色，其中，所出现的深兰色带表现非专一性催化活性。将未染色的凝胶与染过色的凝胶从顶部对齐，并切除未染色凝胶上相应于非专一性催化活性的带。将所述凝胶条粉碎，并提取可溶性蛋白将粉碎的颗粒浸泡在0.5毫升2D-加样缓冲液中，加热到95℃5分钟，并离心以便除去凝胶颗粒。将上清液加样到等电点聚焦(IEF)带上，进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)，使用在Swiss2D数据库(http///www.expasy.ch/ch2d/；Tonella等，电泳191960-1971，1998)中所披露的用于大肠杆菌提取物的2D-PAGE的条件。通过电吸印将所述凝胶转移到PVDF膜上。用胶体兰色凝胶染料对所述膜上的蛋白进行染色。在图6中示出了用于获得非专一性催化活性性质的染色的印迹。用氨基末端肽测序的标准方法鉴定斑点。只有一个斑点(斑点A)编码氧化还原酶活性。通过用yqhD的氨基末端进行FASTA检索，19轮斑点A(图6)得到了百分之百的相同性，所述yqhD是具有推测的氧化还原酶活性的大肠杆菌开放读框。在SEQ ID NO57中示出了由yqhD所编码的蛋白的完整氨基酸序列；相应的氨基酸序列在SEQ IDNO58中示出。YqhD基因与梭菌属中的基因adhB具有40％的相同性，后者可能是NADH依赖型丁醇脱氢酶2。破坏大肠杆菌KLP23中的yqhD基因生物化学测定和氨基末端氨基酸测序表明，所述非专一性催化活性可能是由大肠杆菌yqhD基因编码的。这种具有未知功能的基因编码一种假设的氧化还原酶，并含有两种醇脱氢酶标记，这种标记还存在于由dhaT基因所编码的弗氏柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脱氢酶中。
为了破坏该基因，用Taq聚合酶和以下引物通过PCR由大肠杆菌KLP23(例4)基因组DNA扩增yqhD和830bp的5’旁侧DNA序列和906bp的3’旁侧DNA序列。(SEQ ID NO59)5’-GCGGTACCGTTGCTCGACGCTCAGGTTTTCGG-3’(SEQ ID NO60)5’-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3’该反应在94℃下进行1分钟，50℃下1分钟，72℃下3分钟共35轮，然后在72℃下进行最终的延伸5分钟。纯化所得到的3.7kb的DNA片段，用SacL和Kpn1消化，并在16℃下用16小时将其连接到进行过相似消化的pBluescripII KS(+)(Strategene)上。将连接的DNA用于转化大肠杆菌DH5α(Gibco/BRL)，并从在含有X-gal(40微克/毫升)和氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB琼脂(Difco)上出现白色菌落的转化体中分离需要的质粒pJSP29。用AflII和NdeI消化质粒pJSP29，以便释放出包括363bp yqhD基因和46bp 3’旁侧DNA序列的409bp的DNA片段。纯化其余的5350bp DNA片段，并连接到含有卡那霉素抗性基因的来自pLoxKan2(Genencor国际，PaloAlto，CA)的1374bp AflII/NdeI DNA片段上，在16℃下反应16小时。用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α，并从含有卡那霉素(50微克/毫升)的LB琼脂培养基上筛选的转化体中分离质粒pJSP32-Blue。用KpnI和Sac1消化质粒pJSP32-Blue，并纯化3865bp的yqhD破坏框，并连接到作过类似消化的pGP704(Miller和Mekalanos，细菌学杂志1702575-2583，1988)上，在16℃下反应16小时。将连接的DNA用于转化大肠杆菌SY327(Miller和Mekalanos，细菌学杂志1702575-2583，1988)，并从含有卡那霉素(50微克/毫升)的LB琼脂培养基上筛选的转化体中分离质粒pJSP32。将质粒pJSP32转入大肠杆菌KLP23，并在含有卡那霉素(50微克/毫升)的LB琼脂上筛选转化体。在筛选的200个卡那霉素抗性转化体中，有2个表现出氨苄青霉素敏感表型，这是双交换重组事件的预期现象，这会导致由yqhD破坏框取代yqhD基因。
用从以上两种转化体中分离的基因组DNA作模板和下列类型的引物对通过PCR证实yqhD基因的破坏Set #1(SEQ ID NO61)5′-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3′(SEQ ID NO62)5′-CAGCTGGCAATTCCGGTTCG-3′Set #2(SEQ ID NO63)5′-CCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGT-3′(SEQ ID NO64)5′-GGCGACCCGACGCTCCAGACGGAAGCTGGT-3′Set #3(SEQ ID NO65)5′-CCGCAAGATTCACGGATGCATCGTGAAGGG-3′(SEQ ID NO66)5′-CGCCTTCTTGACGAGTTCTGAGCGGGA-3′Set #4(SEQ ID NO67)5′-GGAATTCATGAACAACTTTAATCTGCACAC-3′(SEQ ID NO68)5′-GTTTGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGCGGC-3′所述反应是用扩增高宝真聚合酶(Boehringer Manheim)或含有Taq聚合酶的Platinum PCR Supermix(Gibco/BRL)进行的，94℃1分钟，50℃1分钟，和72℃2分钟，进行35轮，然后在72℃下进行最后的延伸5分钟。通过1.0％(w/v)琼脂糖上进行凝胶电泳，分析所得到的PCR产物。在表8中归纳的结果证实了在这两种转化体中yqhD基因的破坏。
表8
所述yqhD破坏缺失了yqhD的3’末端，包括46bp的3’旁侧基因间DNA序列。该缺失去掉了相当于121个氨基酸的363bp的3’yqhD编码序列。在卡那霉素抗性框内的残余的yqhD编码序列下游15bp处存在一个终止密码子。
将pAH48和pKP32同时转入大肠杆菌KLP23(yqhD-)，并在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和壮观霉素(50微克/毫升)的LB琼脂上筛选含有这两种质粒的转化体。测定代表性的转化体在有或没有维生素B12的情况下在10升发酵液中将葡萄糖转化成1，3-丙二醇的能力。证实yqhD是在大肠杆菌KLP23/pAH48/pKP32中大量产生1，3-丙二醇所需要的大体上按例7所述进行生产1，3-丙二醇的发酵，使用大肠杆菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32，以便检验yqhDPY对1，3-丙二醇生产的影响。
在表9中示出了使用非专一性催化活性剔除的大肠杆菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32进行的代表性10升的发酵。所述生物稳定地积累细胞物质和甘油，直到添加维生素B12时OD550超过30A为止(10.4h)。在10.4小时时，以8毫克的药团形式添加维生素B12，然后以1.32毫克/小时的速度连续添加。在添加B12之后的4小时内，葡萄糖的消耗放缓，氧气的利用速度下降，并且光学密度不再进一步提高。葡萄糖的发酵停止，而发酵罐中葡萄糖的浓度积累。所获得的1，3-丙二醇的最高效价为0.41克/升。通过将所述细胞的稀释系列铺平板在含有氨苄青霉素和壮观霉素的琼脂平板上检测其生活力。在30℃下培养箱中培养所述平板24小时。在来自大肠杆菌KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32的发酵液的平板上没有有活力的菌落，表11。相反，来自没有添加维生素B12的对照发酵罐的细胞悬浮液继续增加细胞物质和甘油，直到由于完全添加葡萄糖饲养液而使得10升的发酵罐变满(表10)。在该发酵结束时通过细胞悬浮液的稀释系列测定的琼脂糖平板生活力表现出的有活力的细胞数与通过光学密度值估算的总细胞数吻合(表11)。
表9使用大肠杆菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32不能将葡萄糖转化成1，3-丙二醇(1，3-PD)的代表性发酵概述
表10使用大肠杆菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32将葡萄糖转化成甘油的代表性发酵概述
表11在没有和有维生素B12的条件下用大肠杆菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32对葡萄糖进行发酵结束时有生活力的平板记数的代表性概述
序列表<110>纳幕尔杜邦公司(E.I.du Pont de Nemours and Company)<120>用于生产高效价1，3-丙二醇的生物学方法<130>BC1020 PCT<140><141><150>60/149,534<151>1999-08-08<160>68<170>Microsoft Office 97<210>1<211>12145<212>DNA<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)<400>1gtcgaccacc acggtggtga ctttaatgcc gctctcatgc agcagctcgg tggcggtctc60aaaattcagg atgtcgccgg tatagttttt gataatcagc aagacgcctt cgccgccgtc 120aatttgcatc gcgcattcaa acattttgtc cggcgtcggc gaggtgaata tttcccccgg 180acaggcgccg gagagcatgc cctggccgat atagccgcag tgcatcggtt catgtccgct 240gccgccgccg gagagcaggg ccaccttgcc agccaccggc gcgtcggtgc gggtcacata 300cagcgggtcc tgatgcaggg tcagctgcgg atgggcttta gccagcccct gtaattgttc 360attcagtaca tcttcaacac ggttaatcag ctttttcatt attcagtgct ccgttggaga 420aggttcgatg ccgcctctct gctggcggag gcggtcatcg cgtaggggta tcgtctgacg 480gtggagcgtg cctggcgata tgatgattct ggctgagcgg acgaaaaaaa gaatgccccg 540acgatcgggt ttcattacga aacattgctt cctgattttg tttctttatg gaacgttttt 600gctgaggata tggtgaaaat gcgagctggc gcgctttttt tcttctgcca taagcggcgg 660tcaggatagc 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权利要求
1.一种编码用于将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的并且选自下列一组的分离的核酸片段(a)编码SEQ ID NO57的氨基酸序列的全部或主要部分的分离的核酸片段；(b)基本上类似于编码SEQ ID NO57的氨基酸序列的全部或主要部分的分离的核酸片段的分离的核酸片段；(c)编码具有至少387个氨基酸并且与SEQ ID NO57的氨基酸序列有至少80％相同性的多肽的分离的核酸片段；(d)能在0.1XSSC、0.1％SDS，65℃的杂交条件下，并用2XSSC、0.1％SDS洗涤，然后用0.1XSSC、0.1％SDS洗涤的条件下与(a)杂交的分离的核酸片段；和(e)互补于(a)、(b)、(c)或(d)的分离的核酸片段。
2.如SEQ ID NO58所示的分离的核酸片段。
3.一种由权利要求1的分离的核酸片段所编码的多肽。
4.如SEQ ID NO57所示的权利要求3的多肽。
5.一种嵌合基因，包括可操作地与合适的调控序列连接的权利要求1的分离的核酸片段。
6.一种用权利要求5的嵌合基因转化过的微生物，其中，所述微生物选自下列一组柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、气杆菌属属、链霉菌属和假单胞菌属。
7.一种用于生产1，3-丙二醇的重组微生物，包括(a)编码一种具有脱水酶活性的多肽的至少一个基因；(b)编码一种脱水酶再活化因子的至少一个基因；和(c)编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的至少一个外源基因；其中，在所述重组微生物中不存在有功能的编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT基因，并且所述微生物选自下列一组柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、气杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属、和假单胞菌属。
8.如权利要求7的重组微生物，还包括(a)编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个基因；和(b)编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的至少一个基因；
9.如权利要求7或8的重组微生物，其中，所述脱水酶再活化因子是由从dha调节子中分离的orfX和orfZ编码的。
10.如权利要求9的重组微生物，其中，orfX和orfZ是分别从克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌或梭菌中分离的。
11.如权利要求8的重组微生物，还包括一组内源基因，这些基因各自具有一个使该基因失活的突变，该组基因包括(a)编码一种具有甘油激酶活性的多肽的第一个基因；(b)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的第二个基因；和(c)编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的第三个基因。
12.如权利要求8或11的重组微生物，其中，该重组微生物可以将选自下列一组的碳源转化成1，3-丙二醇单糖、寡糖、多糖、和单碳底物。
13.如权利要求7的重组微生物，其中，该重组微生物可以将选自甘油和二羟基丙酮的碳源转化成1，3-丙二醇。
14.如权利要求8或11的重组微生物，其中，所述编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的基因选自下列一组GPD1、GPD2、GPD3、DAR1、gpsA、GUT2、glpD和glpABC。
15.如权利要求8或11的重组微生物，其中，所述编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的基因选自GPP1和GPP2。
16.如权利要求7、8或11的重组微生物，其中，所述编码一种具有脱水酶活性的多肽的基因选自甘油脱水酶和二醇脱水酶。
17.如权利要求7、8和11的重组微生物，其中，所述编码一种具有脱水酶活性的多肽是从克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌或梭菌中分离的。
18.一种重组大肠杆菌，包括(a)一组外源基因，包括(i)编码一种具有脱水酶活性的至少一个基因；(ii)编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个基因；(iii)编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的至少一个基因；和(iv)编码一种脱水酶再活化因子的至少一个基因；和(b)编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的至少一个内源基因；其中，在该重组大肠杆菌中不存在有功能的编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT基因。
19.一种重组大肠杆菌，包括(a) 一组外源基因，包括(i)至少一个编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的基因；(ii)至少一个编码具有甘油-3-磷酸酶活性的基因；和(iii)编码dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ的基因产物的至少一小类基因，和(b)编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的至少一个内源基因；其中，在该重组大肠杆菌中不存在有功能的编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT基因。
20.如权利要求19的重组大肠杆菌，还包括一组内源基因，每一个基因各自具有一个使该基因失活的突变，该组基因包括(a)编码一种具有甘油激酶活性的多肽的基因；(b)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；(c)编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的基因。
21.一种生物生产1，3-丙二醇的方法，包括(a)在合适条件下让权利要求19或20的重组大肠杆菌与选自下列一组的至少一种碳源接触，以便产生1，3-丙二醇单糖、寡糖、多糖、和单碳底物；和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3-丙二醇。
22.一种生物生产1，3-丙二醇的方法，包括(a)让权利要求19或20的重组大肠杆菌或还含有以下成分的权利要求19或20的重组大肠杆菌与选自甘油和二羟基丙酮的至少一种碳源接触(i)编码一种具有脱水酶活性的多肽的至少一个外源基因；(ii)编码一种具有脱水酶再活化因子的至少一个外源基因；(iii)编码将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的至少一个内源基因，(b)可选地回收在(a)中产生的1，3-丙二醇。
23.一种生产1，3-丙二醇的方法，包括(a)让重组大肠杆菌与第一种碳源和第二种碳源接触，所述重组大肠杆菌包括(i)编码一种具有脱水酶活性的多肽的至少一个外源基因；(ii)编码一种具有脱水酶再活化因子的至少一个外源基因；(iii)编码足于将3羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的非专一性催化活性的至少一个内源基因，其中，在该重组大肠杆菌中不存在有功能的编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT基因，并且，所述第一种碳源选自甘油和二羟基丙酮，而第二种碳源选自下列一组单糖、寡糖、多糖和单碳底物，和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3-丙二醇。
24.如权利要求23的方法，其中，所述重组大肠杆菌还包括(a)一组外源基因，包括(i)编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个基因；(ii)编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的至少一个基因；和(iii)编码dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ的基因产物的至少一亚类基因，和(b)一组内源基因，每一个基因各有一个使该基因失活的突变，该组基因包括(i)编码一种具有甘油激酶活性的多肽的基因；(ii)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；和(iii)编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的基因。
25.载体pDT29，包括如SEQ ID NO1所示的一组基因dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ。
26.载体pKP32，包括如SEQ ID NO1所示的dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ。
27.一种重组大肠杆菌菌株KLP23，包括(a)两个一组的内源基因，每一个基因具有一个使该基因失活的突变，该基因组包括(i)编码一种具有甘油激酶活性的多肽的基因；和(ii)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；(b)编码一种具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的多肽的至少一个外源基因；(c)编码一种具有甘油-3-磷酸酶活性的至少一个外源基因；和(d)质粒pKP32。
28.一种重组大肠杆菌菌株RJ8，包括(a)三个一组的内源基因，每一个基因具有一个使该基因失活的突变，该基因组包括(i)编码一种具有甘油激酶活性的多肽的基因；(ii)编码一种具有甘油脱氢酶活性的多肽的基因；和(iii)编码一种具有磷酸丙糖异构酶活性的多肽的基因。
29.一种生产1，3-丙二醇的方法，包括(a)在合适的条件下让包括dha调节子但缺乏有功能的编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT基因的重组大肠杆菌与至少一种碳源接触，其中，所述碳源选自下列一组单糖、寡糖、多糖和单碳底物，和(b)可选地回收在(a)中产生的1，3-丙二醇。
全文摘要
本发明提供了一种用单一微生物由可发酵的碳源生物学生产1,3－丙二醇的改进方法。在本发明的一个方面,一种用于将葡萄糖转化成1,3－丙二醇的改进方法是通过使用由肺炎克雷伯氏菌dha调节子基因dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ转化过的大肠杆菌而实现的,以上所有基因的排列方式与野生型肺炎克雷伯氏菌中的遗传组构相同。在本发明的另一方面,提供了一种与使用含有编码G3PDH,G3P磷酸酶、脱水酶、脱水酶再活化因子和1,3－丙二醇氧化还原酶(dhaT)的重组大肠杆菌的相同的方法相比用于通过含有编码G3PDH,G3P磷酸酶、脱水酶和脱水酶再活化因子基因的重组大肠杆菌由葡萄糖生产1,3－丙二醇的改进方法。明显改善的方法取决于编码一种非专一性催化活性的基因在大肠杆菌中的存在,该活性足于将3－羟基丙二醇转化成1,3－丙二醇。
文档编号C12N15/09GK1379818SQ00814436
公开日2002年11月13日 申请日期2000年8月18日 优先权日1999年8月18日
发明者M·埃姆普塔格, S·海尼, L·拉芬德, J·普茨, G·怀特 申请人:纳幕尔杜邦公司, 詹伦卡国际有限公司