一种植物光调控型启动子及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，更具体的说，涉及一种来源于玉米的受光调控的特异启动子的克隆、表达及其在植物中的应用。

背景技术：

启动子是位于基因5’端上游区的一段DNA序列，它包含有增强、启动或阻遏基因表达的序列和响应外界环境中激素或胁迫应答作用的顺式作用元件，转录因子通过与这些元件相互作用来实现对某种基因的转录调控。

植物启动子按其转录方式可以分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组成型启动子广泛应用于植物转基因，常用的如CaMV35S启动子，ubiquitin启动子和actin启动子等，它们能高效、持续和非特异的启动外源基因表达，但外源蛋白在转基因植物中组成型表达也增加植物的代谢负担，直接影响了植株的生长发育；同时，组成型启动子可能诱发基因沉默，影响转基因技术应用；与组成型启动子相比，诱导型启动子只在某些物理或化学信号的刺激下或者植物发育到特定的阶段，才启动外源基因的转录。它不仅能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性，同时可避免由组成型启动子启动外源基因过量表达引起的对植株发育的负面影响，也可以在一定程度上解决转基因应用中的基因沉默问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的重要启动子。

光是影响植物生长发育最重要的因素之一，因为它不仅作为植物感知环境的信号来源，还作为光合作用的能量来源。因此，对光诱导型启动子的研究有助于了解植物基因在光下的转录调控表达模式及其调控机制，可应用于基因工程中使外源基因伴随光照和植物生理状态进行表达，维持转基因植株的健康生长。

技术实现要素：

本发明从玉米中克隆一种受光调控的启动子，其核苷酸序列全长2058bp，名称为PZm169o，来源于玉米B73，核苷酸序列全长如下：

GAGAGGGAGAGGGAAGTTGCTGCGCGGGAAAAGAAAATGAGATAGGGGAGGGGGCGCATGGGGGAAGGGGCGCCAGGGGCCGGGTTGGGCCACGGGCCGGGCCGGACCACGAGCTGGGCCGAAAACCCACTGCACGCACGACCACTAATCGAAAACAAATCATGATTCGAAGACCAAAACGAGACGGACGCGCGATTAGACACAACATTAGACAAAAGAAATATGCTTCAGCATGAAGCAAAACCTATGTCAACTTAGGTTTTTGTTTACACGCGATACGGACACCAGTCACTATACTGCTTTGAAAATTAGAAGAAGGAGCAAAACGGGAAGAGAAAAGAGAGTAACGCCTGAATTTGCTGAGTATCGGAGAAGAAAAATTATACTCCCAAATTCAGGGCGTTACAACATCTCTTGGTCAAGGTGTGACATGCTGGCTATAGAGGATGGTACTCTGCTTCCCAATTATGGAACATAGAGTGAGGGAGATACTAGATGCGACGAGGGTGAGGAAGACCGGTGGTGGCGATGGCAACCTCGGGGAGAGGCAGGAGAAACTGCAGTAGTGGGCCAAGCGTGTAGATGCGAAGGGGTATAGGGGTATTCTCACGGGAACCGCTCGTTTCGTCCCAAAGAGGCCTGTAAACCGATTTGGCATTCACCTTGAAAACCAAGCTACCGGAAAAATCAGTTCAGGGAAAAACTGACCCAAAATCAGAGCGTTTTGCACTCAGATCAGCTTTTGGCGGTCACAATCTAAAAAAGGGGTTCCAAACGGGGCATGCACTACAACTCTCTATAGCTCTTGGAAGAGGTTCAAATAATATTCTAGCAATCAGGGCTATGCCTAAGATTTTAGGGGCCCTGGGCGAAAGCTTATATGGATGCCCTTTTGGCCGATGTATATACAATAACTATATACATAGACACATTTTGATGGGCCAAATAGTAAATGCAATTAGCTAGCTCCTACATATGGTATACATGTATGTGCGAAGGTTGATCGTCGATGGCATGTCTTGGCGTTTGCAACCGTGTCTAGACTGTCCAGTTCTTTGGCAACATGGTGGTGGCACCACGACATGAATTAGGTTTTCTAGATGTATTCTATTATGAGTCCTGACTTGGGATCTGGCTTACATGAACATGCTAGCATTTGCTTCCGATTTACGTTACATGAGCAAGATAGTAGAGGCTGAGCTACCCGCTTATGTGAGCATGATAGCAGTTCATAGTAAGGATGACAATAAGTACCCGAAACCCGAACACCCAACAGATTTTACCTAATTAGAAGGTAGGTATGAGATAATTTCTTTAACCGTGAGTATGTTAATAGGTAATACCCATACTCGTCTAACCGCGGGTAAAATATACCGACATCATATCACTATTACCATCTAATAACTCATCTTAGCTAAAAGAAAATCCGTATTCGACTATTGTTTGTTTAAATACCATATTATGTAATCATATGAGATGTTATATTTGAAGTTAAACTTATTTTTATATGTTTGTTTGATATTTTGAGTGATTGATATATTACAATTTAAGATTTTCTTAATGGGTGCCTTAATGGGTAAAATTACACCCGCGGATATGGGTACGGATGGGATTCTATACCCGCGAGTGTGCATGGTAACCTAATGGATATAATTTTTTTACGAATAACGGCATAAAATGGTACTAGATATATTCCATTTCGTAGCAGTGGACGGTTGAACCAACCAAGTGAACACTATTTAAACTGATGAAATGATTAAATATTATACTTAGATATATACTTAAGGGGACTTCAACATTTTGAGACGCTTTAGCCTGCTAGTTCAATCCTTGAAACTGAAGAACAAGATATGGCAGAAGCTGCTCACCCAAAATACCTGACCCCTCTCCTTGTCCACACCATAAATACCAGGCGTATGCAACCAGTGCTGCCACACACACACACACAGACACCAAACGCCACAGAACTTGCAGGCATGGCTGAAGGTTAAGAAGAAAAAGAGGAGGGCGGCCTCACATGGAGATGGAGAGCCCCTTTTG

上述序列中加黑部分“”、“”、“”为光响应元件。

本发明还提供了上述光调控型基因启动子的构建方法，具体步骤为:以玉米B73系基因组DNA为模板，根据Zm-miR169o基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，获得上述光诱导型基因启动子。

本发明还提供了含上述光调控型启动子的植物表达载体，命名为pPZm169o::GUS。

本发明还提供上述启动子在植物基因工程中获得光调控表达目的基因的转基因玉米植株中的应用。

本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光调控的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的特异性表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为利用PZm169o驱动GUS表达的载体pPZm169o::GUS示意图；

图2为实施例4中不同玉米株系叶片中GUS染色结果图；

图3为实施例5中PZm169o::GUS转基因玉米植株经弱光和远红光处理之后GUS的表达图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1 启动子的克隆

根据玉米遗传学和基因组学数据库(maizeGDB)中提供的玉米B73全基因组序列，根据Zm-miR169o基因的上游2058bp序列设计扩增引物，引物序列如下：

PZm169oF：5’-GAGAGGGAGAGGGAAGTTGC-3’；

PZm169oR：5’-CAAAAGGGGCTCTCCATCTC-3’。

其中，PCR扩增程序如下：

72℃延伸10min。4℃保存。扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收，克隆至pEASY-T1载体。酶切并测序鉴定，命名为pTP169o，测序结果表明：得到启动子序列为图1所示，将该启动子命名为PZm169o。

实施例2 植物表达载体的构建

1)重新设计扩增PZm169o全长的引物，在引物两端各添加20nt载体同源序列，

PZm169oF2：

5'-TATGACCATGATTACGAATT GAGAGGGAGAGGGAAGTTGC-3'；

PZm169oR2：

5'-TACCCTCAGATCTACCATGG CAAAAGGGGCTCTCCATCTC-3'。

以pTP169o质粒为模板，进行PCR扩增；

2)扩增产物进行回收，回收后产物与经EcoRI/NcoI双酶切的pCAMBIA3301进行重组反应，所用试剂为GBclonart Seamless Cloning Kit，反应体系如下：

3)酶切鉴定阳性克隆，阳性克隆即为pPZm169o::GUS载体。将阳性克隆进行测序验证，获得阳性质粒如图1所示，用于后续实验。

实施例3 pPZm169o::GUS转基因玉米的获得

1)农杆菌转化及玉米转化

将实施例2中获得的植物表达载体pPZm169o::GUS转化到农杆菌EHA105中。玉米转化方法参照Frame et al.,进行。

转基因玉米PCR检测

正向引物：PZm169oFW:5’-GGACGGTTGAACCAACCAAGTG-3’

反向引物：GUS3R:5’-CGGCGAACTGATCGTTAAAACT-3’

反应体系：

反应条件如下：

72℃延伸5min。筛选出PCR阳性植株。

2)转基因玉米Basta叶面喷洒检测及纯系的获得

待PCR阳性植株长至5-6片叶时，用1000倍稀释的Basta喷施，每周一次，连续喷施3周后观察植株存活情况。存活的阳性苗自交获得T2代纯系，种植待取不同组织器官进行GUS分析。

实施例4 GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA et al.,1987)方法，将待染色组织浸入组织液然后抽真空，37℃染色过夜，次日用95％乙醇脱色，至阴性对照材料成白色。

通过GUS组织染色，检测启动子PZm169o在玉米转基因植株中对GUS的启动活性。图2为不同玉米株系叶片中GUS染色结果。结果显示，正对照pCAMBIA3301(来自pCAMBIA公司)(A)转基因玉米植株各组织中，均检测到GUS活性，有明显染色。而PZm169o::GUS(B)和阴性对照(C)中均未检测到GUS活性。

实施例5 PZm169o::GUS转基因玉米植株经弱光和远红光处理之后GUS表达分析

对长至三叶一心的PZm169o::GUS转基因玉米幼苗，分别进行16h/8h弱光/黑暗培养和50μmol/m2/s远红光处理15分钟，分别取处理后幼苗叶片和处理前的叶片进行GUS活性分析，图3为转基因玉米植株经弱光和远红光处理之后GUS的表达结果，结果表明弱光/黑暗处理(A)和远红光处理15min(B)后转基因株系中的GUS活性明显增强，未转基因的野生型对照(C)没有GUS活性，说明PZm169o启动子受远红光和黑暗诱导表达，是一个光调控的诱导型启动子。

显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 深圳市农科集团有限公司、中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种植物光调控型启动子及应用

<130>

<160> 1

<210> 1

<211> 2058

<212> DNA

<213> 玉米品种“B73”

<400> 1

GAGAGGGAGA GGGAAGTTGC TGCGCGGGAA AAGAAAATGA GATAGGGGAG GGGGCGCATG 60

GGGGAAGGGG CGCCAGGGGC CGGGTTGGGC CACGGGCCGG GCCGGACCAC GAGCTGGGCC 120

GAAAACCCAC TGCACGCACG ACCACTAATC GAAAACAAAT CATGATTCGA AGACCAAAAC 180

GAGACGGACG CGCGATTAGA CACAACATTA GACAAAAGAA ATATGCTTCA GCATGAAGCA 240

AAACCTATGT CAACTTAGGT TTTTGTTTAC ACGCGATACG GACACCAGTC ACTATACTGC 300

TTTGAAAATT AGAAGAAGGA GCAAAACGGG AAGAGAAAAG AGAGTAACGC CTGAATTTGC 360

TGAGTATCGG AGAAGAAAAA TTATACTCCC AAATTCAGGG CGTTACAACA TCTCTTGGTC 420

AAGGTGTGAC ATGCTGGCTA TAGAGGATGG TACTCTGCTT CCCAATTATG GAACATAGAG 480

TGAGGGAGAT ACTAGATGCG ACGAGGGTGA GGAAGACCGG TGGTGGCGAT GGCAACCTCG 540

GGGAGAGGCA GGAGAAACTG CAGTAGTGGG CCAAGCACGT GCGTGTAGAT GCGAAGGGGT 600

ATAGGGGTAT TCTCACGGGA ACCGCTCGTT TCGTCCCAAA GAGGCCTGTA AACCGATTTG 660

GCATTCACCT TGAAAACCAA GCTACCGGAA AAATCAGTTC AGGGAAAAAC TGACCCAAAA 720

TCAGAGCGTT TTGCACTCAG ATCAGCTTTT GGCGGTCACA ATCTAAAAAA GGGGTTCCAA 780

ACGGGGCATG CACTACAACT CTCTATAGCT CTTGGAAGAG GTTCAAATAA TATTCTAGCA 840

ATCAGGGCTA TGCCTAAGAT TTTAGGGGCC CTGGGCGAAA GCTTATATGG ATGCCCTTTT 900

GGCCGATGTA TATACAATAA CTATATACAT AGACACATTT TGATGGGCCA AATAGTAAAT 960

GCAATTAGCT AGCTCCTACA TATGGTATAC ATGTACGTGT ATGTGCGAAG GTTGATCGTC 1020

GATGGCATGT CTTGGCGTTT GCAACCGTGT CTAGACTGTC CAGTTCTTTG GCAACATGGT 1080

GGTGGCACCA CGACATGAAT TAGGTTTTCT AGATGTATTC TATTATGAGT CCTGACTTGG 1140

GATCTGGCTT ACATGAACAT GCTAGCATTT GCTTCCGATT TACGTTACAT GAGCAAGATA 1200

GTAGAGGCTG AGCTACCCGC TTATGTGAGC ATGATAGCAG TTCATAGTAA GGATGACAAT 1260

AAGTACCCGA AACCCGAACA CCCAACAGAT TTTACCTAAT TAGAAGGTAG GTATGAGATA 1320

ATTTCTTTAA CCGTGAGTAT GTTAATAGGT AATACCCATA CTCGTCTAAC CGCGGGTAAA 1380

ATATACCGAC ATCATATCAC TATTACCATC TAATAACTCA TCTTAGCTAA AAGAAAATCC 1440

GTATTCGACT ATTGTTTGTT TAAATACCAT ATTATGTAAT CATATGAGAT GTTATATTTG 1500

AAGTTAAACT TATTTTTATA TGTTTGTTTG ATATTTTGAG TGATTGATAT ATTACAATTT 1560

AAGATTTTCT TAATGGGTGC ACGTTCCTTA ATGGGTAAAA TTACACCCGC GGATATGGGT 1620

ACGGATGGGA TTCTATACCC GCGAGTGTGC ATGGTAACCT AATGGATATA ATTTTTTTAC 1680

GAATAACGGC ATAAAATGGT ACTAGATATA TTCCATTTCG TAGCAGTGGA CGGTTGAACC 1740

AACCAAGTGA ACACTATTTA AACTGATGAA ATGATTAAAT ATTATACTTA GATATATACT 1800

TAAGGGGACT TCAACATTTT GAGACGCTTT AGCCTGCTAG TTCAATCCTT GAAACTGAAG 1860

AACAAGATAT GGCAGAAGCT GCTCACCCAA AATACCTGAC CCCTCTCCTT GTCCACACCA 1920

TAAATACCAG GCGTATGCAA CCAGTGCTGC CACACACACA CACACAGACA CCAAACGCCA 1980

CAGAACTTGC AGGCATGGCT GAAGGTTAAG AAGAAAAAGA GGAGGGCGGC CTCACATGGA 2040

GATGGAGAGC CCCTTTTG 2058