基于微电极生物传感技术的植物体茉莉酸甲酯检测方法与流程

本发明涉及微电极生物传感技术，具体地说，涉及一种基于微电极生物传感技术的植物体茉莉酸甲酯检测方法。

背景技术：

茉莉酸甲酯，广泛存在于植物体的一类生长调节物质，具有多种生理效应，如能提高幼苗对高低温干旱的抵抗能力，可以刺激抗真菌蛋白的合成从而启动或加速与防卫反应有关的次生代谢，抑制生长分化，促进生根成熟衰老等。目前，由于茉莉酸甲酯重要的生理效应和在植物体中相对低的含量，茉莉酸甲酯的检测愈来愈受到重视。

目前用于检测植物体中的茉莉酸甲酯的方法主要是色谱法，包括气质联用，液质联用，高效液相色谱，毛细管液相色谱等，也有酶联免疫检测技术。这些方法所使用的仪器多数操作复杂，成本较高，周期较长，样本破坏性大，无法实现植物生长在线检测。电化学分析法因其操作方便、响应迅速和灵敏度较高等优点，最为适合植物活体在线的定性定量检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于微电极生物传感技术的植物体茉莉酸甲酯检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种微电极生物传感器，所述微电极呈三棱锥形，长1-10cm，其尖端部分长2-20mm，另一端横截面三角形的边长为1-15mm(优选另一端横截面为等边三角形)；所述微电极的基底电极材料为经过绝缘处理的硅片、不锈钢或有机玻璃等；在所述基底的每个面上，一端设置有用于连接电化学工作站的元件，另一端为检测用的电极材料，所述元件与电极材料之间通过导线相连；所述微电极具有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及由铂、石墨烯和全氟磺酸树脂修饰的金工作电极。

所述微电极生物传感器可按如下方法制备得到：

1)采用微机电技术(MEMS)在基底上制备铂对电极、Ag/AgCl参比电极以及金工作电极；

2)所述金工作电极用氧化铝粉末在金相砂纸上抛光，分别用去离子水、乙醇进行超声清洗，随后将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中，在0-1.5V电位下进行循环伏安扫描，得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面干净；

3)配制1mg/ml氧化石墨烯和1mM氯铂酸混合溶液，将所述微电极浸入上述溶液中，在-0.8V电压下通过计时安培法进行电化学还原沉积0.5～2h(优选1h)，然后用去离子水洗净，得到修饰的石墨烯/铂电极；

4)将浓度0.005～0.1％的全氟磺酸树脂溶液(优选0.02％)滴涂在所述石墨烯/铂电极上，在50℃下干燥成膜(干燥温度一般低于100℃，满足干燥成膜的条件即可)，然后用去离子水洗净，得到由铂、石墨烯和全氟磺酸树脂修饰的金工作电极，从而完成所述微电极生物传感器的制备。

本发明还提供所述微电极生物传感器在植物茉莉酸甲酯在线检测中的应用。其是将所述微电极生物传感器插入待测植物组织中，连接电化学工作站进行循环伏安扫描，实现对植物组织进行在线茉莉酸甲酯检测。

检测前选取不同浓度的茉莉酸甲酯标准溶液进行差分脉冲伏安法扫描，根据茉莉酸甲酯浓度与电流关系获得微电极检测茉莉酸甲酯工作曲线；检测条件为：电位0.9-1.4V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s。

其中，所述不同浓度的茉莉酸甲酯标准溶液使用pH6.0的10mM磷酸缓冲液配制。

所述微电极生物传感器最低检测限为0.5μmol/L，线性范围为1-100μM，茉莉酸甲酯溶液浓度与响应峰电流的线性方程为：I＝0.682+1.71C，相关性系数为0.9847；其中，I表示电流，单位为μA，C表示浓度，单位为μM。

本发明的检测对象包括植物的根、茎、叶或果实等部位，插入深度为0.5cm左右。检测目标材料是植物生长的不同时期，例如小麦幼苗的茎部。

前述的应用，还包括检测前对所述微电极生物传感器进行校正的步骤，具体方法如下：对微电极进行清洗，然后分别用两份标准浓度(例如5μM和50μM)的茉莉酸甲酯溶液进行电化学校准，如果工作曲线与标准曲线斜率偏差在15％以内，判定电极可正常工作。

校正后对样品进行差分脉冲伏安扫描，检测条件为：电位0.9-1.4V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s。

连接电化学工作站，系统活化20min后，稳定运行1min-10min采集电流数据代入线性方程，得到植物组织中茉莉酸甲酯的浓度。

本发明提供的一种基于微电极生物传感技术的植物在线茉莉酸甲酯检测方法，该方法具有准确度高、样本破坏小、操作简单、便于携带的特点，在时间和空间层面上，实现植物体中茉莉酸甲酯信息的同步获取，为植物体研究提供了技术支持。与传统的生物鉴定、化学检测方法相比，该方法样品前处理简单，检测部位无需离体、微损、无本质伤害，不会对植物造成实质性的损害，检测结果可靠，灵敏度高。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的微电极生物传感器的结构示意图；其中，A面-工作电极，B面-参比电极，C面-对电极。

图2为本发明实施例1中微电极生物传感器的工作电极修饰示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 微电极生物传感器及其制备方法

本实施例采用微机电技术在经过绝缘处理的不锈钢基底上制备微电极，所述微电极呈三棱锥形，总长度为5cm，尖端部分长度为5mm，另一端横截面为等边三角形，边长为3mm；在所述基底的每个面上，一端设置有用于连接电化学工作站的元件，另一端为检测用的电极材料，所述元件与电极材料之间通过导线相连；所述微电极具有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及由铂、石墨烯和全氟磺酸树脂修饰的金工作电极(图1和图2)。

所述由铂、石墨烯和全氟磺酸树脂修饰的金工作电极可按如下方法制备得到：

1、将金工作电极用氧化铝粉末在金相砂纸上抛光，分别用去离子水、乙醇进行超声清洗，随后将微电极置于0.5M稀硫酸溶液中，在0-1.5V电位下进行循环伏安扫描，得到典型的循环伏安谱图，确保电极表面干净；

2、配制1mg/ml氧化石墨烯和1mM氯铂酸混合溶液，将所述微电极浸入上述溶液中，在-0.8V电压下通过计时安培法进行电化学还原沉积1h，然后用去离子水洗净，得到修饰的石墨烯/铂电极；

3、将浓度0.02％的全氟磺酸树脂溶液滴涂在所述石墨烯/铂电极上，在50℃下干燥成膜，然后用去离子水洗净，得到由铂、石墨烯和全氟磺酸树脂修饰的金工作电极，从而完成所述微电极生物传感器的制备。

实施例2 利用微电极生物传感器对植物茉莉酸甲酯进行实时在线检测

1、实验对象

待测植物为北京市农林科学院种植的小麦品种‘农大6812’，选取两株小麦幼苗的茎部作为检测样本。

清洁后，将实施例1制备的微电极插入待测样本茎部，开始电化学检测。

2、实验仪器及耗材

实验仪器采用上海辰华电化学工作站760e。

3、实验方法

(1)标准曲线的绘制：

检测前选取不同浓度的茉莉酸甲酯标准溶液进行差分脉冲伏安法扫描，根据茉莉酸甲酯浓度与电流关系获得微电极检测茉莉酸甲酯工作曲线；检测条件为：电位0.9-1.4V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s。

其中，所述不同浓度的茉莉酸甲酯标准溶液使用pH6.0的10mM磷酸缓冲液配制。

所述微电极生物传感器最低检测限为0.5μmol/L，线性范围为1-100μM，茉莉酸甲酯溶液浓度与响应峰电流的线性方程为：I＝0.682+1.71C，相关性系数为0.9847；其中，I表示电流，单位为μA，C表示浓度，单位为μM。

(2)实验步骤：

检测前对所述微电极生物传感器进行校正，方法如下：对微电极进行清洗，然后分别用两份标准浓度(5μM和50μM)的茉莉酸甲酯溶液进行电化学校准，如果工作曲线与标准曲线斜率偏差在15％以内，判定电极可正常工作。

校正后对样品进行差分脉冲伏安扫描，检测条件为：电位0.9-1.4V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.02s，脉冲周期0.5s，静止时间20s。

连接电化学工作站，系统活化20min后，稳定运行1min-10min采集电流数据代入线性方程，得到植物组织中茉莉酸甲酯的浓度。

4、实验评价结果

采用HPLC法以及本发明的在线检测分析两株小麦幼苗茎部的茉莉酸甲酯含量比较结果见表1。可以看出，本方法检测结果可靠，通过电化学工作站可以实现茉莉酸甲酯在线动态检测分析，为活体在线研究植物茉莉酸甲酯含量提供了新方法，实现对现有检测手段的补充。

表1小麦幼苗茎部的茉莉酸甲酯测试结果(单位，μg/g)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。