一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法与流程

本发明涉及测定方法，具体地说是采用固相微萃取-液相色谱-质谱联用测定花生叶片茉莉酸含量的方法。

背景技术：

目前，农药价格昂贵，并且过度使用农药会使害虫的抗药性增加，害虫天敌的数量不断减少甚至灭绝，还会造成环境的严重污染，农药的使用必然受到极大的限制，促使科学家找到一种方法，将农药用量降到最小化的同时达到抗虫的最佳效果，使农作物高产，高质，高营养。

茉莉酸类物质是一类新型植物激素，能使植物引起多种生理反应，能够通过植物体直接或间接诱导产生并积累，能够促进相关基因表达，诱导产生各种有特殊功能的有机物，例如某些蛋白质，达到抗击病虫害的目的。

茉莉酸是茉莉酸类化合物及其衍生物的前体，是一种内源信号分子，建立一种灵敏、稳定的花生叶中茉莉酸定量分析方法十分重要，利用高效液相色谱-质谱联用对花生叶样品进行分析，找出稳定的前处理纯化方法，建立起高效、稳定的花生叶内源茉莉酸的定量检测方法，并对方法进行优化，找到不同基因改造处理后花生叶中茉莉酸含量规律，对花生研究抗虫具有重要的科学意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足，提供一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法，包括以下步骤：

(1)花生叶片样品制备；(2)标准曲线样品制备；(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液；(4)样品的萃取与富集；(5)LC-MS检测条件的建立；(6)样品检测。

作为优选，本发明包括以下步骤：

(1)取1g花生叶，加入内标200ngDHJA，用液氮研磨；

研磨物用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟，用移液枪移取2.5-5mL上清液于15ml离心管中；

残渣用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟，用移液枪移取2.5-5mL上清液于10ml离心管中，重复此过程1-3次；

合并以上浸提的上清液，于4℃条件下氮气吹干，定溶于1ml 80％甲醇中。

(2)取1g花生叶，加入内标200ngDHJA，再用10ul注射器分别加入5ng/g、10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g、200ng/g、500ng/g、1000ng/g的JA标准品溶液，得到不同浓度的标准样品；将标准样品用液氮研磨，再用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，之后于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟，然后用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中；

残渣用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分钟，用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中，重复2-3次；

合并上述浸提的上清液，于4℃条件下氮气吹干，将其定溶于1ml 80％甲醇中。

(3)配置流动相：95％乙腈+5％水、95％水+5％乙腈以及1‰甲酸+5％乙腈+水的制备，分别制备1ppm、100ppm、1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液，制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液，制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标；

(4)样品的萃取与富集；

(5)质谱条件的建立：使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物；

色谱条件的建立：使用上述配置的流动相作为分析所用的色谱条件；

(6)样品检测：用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描，确定其特征子离子，利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图，然后加入标准品50ng，进行检测。

更进一步的是：所述样品检测还包括定量及回收率测定，包括以下步骤：使用内标法，以DHJA作为内标物，每份样品加入内标200ngDHJA，用浓度分别为：5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ng/g、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液，绘制标准曲线；

分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平，进行HPLC-MS检测，计算回收率。

更进一步的是，所述样品的萃取与富集包括以下步骤：

加2mL超纯水于5mL样瓶中，将样品转移到50mL样瓶中，加入带有磁性的ZZ-SBSE-04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h；

在2mL样瓶中加入内套管，并加入250μL丙酮，将上述固相微萃取搅拌棒放入并封口，然后放入超声仪中超声20min进行解吸。取丙酮解吸液待测。

上述中，本发明还包括花生叶干样处理过程，包括以下步骤：

第一步：向试管中的样品加入1mL甲醇，充分震荡使其溶解；

第二步：用移液枪转移至2mL PC管中；

第三步：用离心机13000r离心10分钟；

第四步：用移液枪吸取上清液，装于2mL样瓶中；

第五步：用封口膜封口，放在零下20摄氏度保存。

本发明优点在于：本发明测试方法稳定性高，数据精确，检测结果可靠，化合物分离度较好。本发明方法能够快速检测花生叶中的茉莉酸含量，操作快速，效率高。通过检测花生叶中茉莉酸含量，科研人员对花生的抗虫能力、生长过程中农药用量、产量甚至环境的保护、恢复生态平衡、保护生物多样性等进行系统的研究，其具有重要的科学意义。

附图说明

图1采用流动相体系(a)时的液相色谱图；

图2茉莉酸标准曲线；

图3 JH1012ck浓度-时间曲线；

图4 JH1012han浓度-时间曲线；

图5 J11han浓度-时间曲线；

具体实施方式

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本实施例使用安捷伦公司生产的型号为(Agilent)1290-6430.的液相色谱-三重四级杆质谱联用仪；Thermo公司生产的2.1mm×150mm×5μm Accucore XL C18色谱柱；安捷伦生产的2.1mm×100mm×1.8μm ZORBAX SB-Aq色谱柱；Mettle-toledo公司生产的型号为EL204-IC的电子天平；sigma公司生产的型号为1-14的小型离心机；90014-S-B手套；eppendorf、smartpipette型移液枪；江苏金坛市环宇科学仪器厂生产的型号为CJJ-931的数显四联恒温磁力搅拌器；上海思博明生产的Vortex-Genie-2型小型漩涡振荡器；昆山生产的5200E单频超声波清洗器。固相微萃取搅拌棒采用青岛贞正分析仪器有限公司生产的ZZ-SBSE-04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒。

选用两种花生品种，分别为J11、JH1012，利用两种不同的基因改造方法，对花生进行基因改造，分别编号为J11han、JH1012han、JH1012ck，每个实验样品做三个平行实验样品。通过本发明检测J11han，JH1012han，JH1012ck实验样品中的茉莉酸含量。

1.1样品制备及分析方案：

第一步：取1g花生叶(每份样品做3份平行实验)，加入内标200ngDHJA(用10ul注射器加入2ul的100ug/ml内标溶液)。

第二步：用液氮研磨。

第三步：研磨液用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，4℃、13000rpm/min离心10分钟，用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中。

第四步：残渣用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，4℃、13000rpm/min离心10min，用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中，此过程重复1次。

第五步：合并第三、四步3次浸提的上清液，4℃条件下氮气吹干。

第六步：定溶于1ml 80％甲醇中。

1.2标准曲线样品制备、分析方案：

第一步：取1g花生叶(每份样品做3份平行实验)，加入内标200ngDHJA(用10ul注射器加入2ul的100ug/ml内标溶液)，用10ul注射器分别加入不同量的JA标准品溶液，得到不同浓度的标准样品：

5ng/g标准样品(加入1ug/ml，5ul)

10ng/g标准样品(加入1ug/ml，10ul)

20ng/g标准样品(加入10ug/ml，2ul)

50ng/g标准样品(加入10ug/ml，5ul)

100ng/g标准样品(加入10ug/ml，10ul)

200ng/g标准样品(加入100ug/ml，2ul)

500ng/g标准样品(加入100ug/ml，5ul)

1000ng/g标准样品(加入100ug/ml，10ul)

第二步：液氮研磨。

第三步：用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，4℃、13000rpm/min离心10分钟，用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中。

第四步：残渣用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜，4℃、13000rpm/min离心10min，用移液枪移取2.5mL上清液放入10ml离心管中，此过程重复1次。

第五步：合并第三、四步3次浸提的上清液，4℃条件下氮气吹干。

第六步：定溶于1ml 80％甲醇中。

1.3制备流动相

95％乙腈+5％水：

第一步：用500ml量筒取475ml乙腈于流动相瓶中。

第二步：用100ml量筒取25ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中，充分震荡后放入超声波清洗器中超声20min。

95％水+5％乙腈

第一步：用500ml量筒取475ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中。

第二步：用100ml量筒取25ml乙腈于流动相瓶中，充分震荡后再用超声波清洗器中清洗二十分钟。

1‰甲酸+5％乙腈+水：

用移液枪取0.5mL甲酸，用100ml量筒取25ml乙腈，用500ml量筒取474.5ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中，充分震荡后再用超声波清洗器中清洗二十分钟。

制备完成流动相后将量筒晾干，倒置，防止污染。

1.4制备茉莉酸和/或二氢茉莉酸甲醇溶液

制备1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液

第一步：用电子天平称取10μgH2JA于100mL量筒中。

第二步：用甲醇定容，小型漩涡振荡器充分震荡后转移至棕色瓶中。

第三步：封口放于-20℃保存。

制备100ppm二氢茉莉酸甲醇溶液

第一步：用移液枪移取1000ppm二氢茉莉酸溶液于20ml样瓶中(分9次，每次1ml甲醇等比例稀释)，用振荡器混匀。

第二步：用移液枪移取1ml装入2ml样瓶中小型漩涡振荡器充分震荡后转移至棕色瓶中。

第三步：封口放于-20℃保存。

制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液

方法同上，封口膜封口，-20℃保存。

制备1ppm二氢茉莉酸甲醇溶液

方法同上，封口膜封口，-20℃保存。

制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标

方法同上，封口膜封口，-20℃保存。

1.5样品的萃取与富集

采用固相微萃取搅拌棒进行萃取富集。方法如下：

第一步：加2mL超纯水于5mL样瓶中。

第二步：将样品转移到50mL样瓶中。

第三步：加入固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h。

第四步：在2mL样瓶中加入内套管，并加入250μL丙酮，将第四步搅拌棒放入，封口。

第五步：放入超声仪中超声20min，进行解吸，解吸液待测

1.6质谱条件的建立

试验使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物。分别使用10ppm茉莉酸和二氢茉莉酸，再分别于正、负电离模式下，分别确定茉莉酸和二氢茉莉酸的母离子分子量，并选择定量子离子。

1.7色谱条件的建立

比较流动相系统，选出上述配置的流动相中能使茉莉酸、二氢茉莉酸出峰效果最好的流动相系统作为分析所用的色谱条件。

1.8样品的定性检测

用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描，确定它们的特征子离子。在已经确定的离子模式(负离子模式)条件下，利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图，确定分离效果。

然后加入标准品50ng，高效液相色谱检测，确定保留时间，同时用质谱得到特征子离子。

1.9定量及回收率测定

定量使用内标法，以DHJA作为内标物，每份样品加入内标200ngDHJA，用浓度分别为：5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液，绘制标准曲线。

分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平，进行HPLC-MS检测，计算回收率。

本实验添加二氢茉莉酸为内标，为排除花生叶中原本存在二氢茉莉酸形成干扰，设置六个空白花生叶样品进行HPLC-MS检测。

2.0实验数据的分析

2.0.1多反应离子监测(MRM)参数优化

采用Optimizer软件自动优化MS检测条件，结果见表1：

表1 MRM检测参数设置

本实施例检测使用超高压液相色谱柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18，2.1mm×100mm×1.8μm)分离，可将茉莉酸与相邻干扰峰完全分离。本实施例质谱用负离子模式对茉莉酸(JA)和二氢茉莉酸(DHJA)检测，灵敏度较高，而且干扰峰少。

流动相的选择

由于茉莉酸和二氢茉莉酸为酸性化合物，采用C18色谱柱进行分离，通常在流动相加入0.1％甲酸，用于增加目标组分在色谱柱固定相上的保留时间，从而改善分离度。

采用超高压液相色谱柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18 2.1mm×100mm×1.8μm)，对比流动相体系(a)A：水相(含0.1％甲酸和5％乙腈)，B：乙腈相(含5％水)和流动相体系(b)A：水相(含5％乙腈)，B：乙腈相(含5％水)的分离效果，如图1所示。结果表明：(1)采用流动相体系(a)时，JA和DHJA的保留时间均较流动相体系(b)有所增加，然而采用流动相体系(b)时，JA和DHJA也可以达到基线分离；(2)采用流动相体系(a)时，JA和DHJA的灵敏度有所下降，原因为当MS采用负离子检测模式时，流动相体系(a)中的甲酸会降低JA和DHJA的离子化效率，导致灵敏度下降。综合考虑，本检测采用不加甲酸的流动相体系(b)。

从图1中得出流动相梯度最佳为：0～8分钟，A:B比值变化情况为4:1～1:9；8～13分钟，A:B＝1:9；13～14分钟，A:B比值变化情况为1:9～4:1；14～20分钟，A:B＝4:1。

2.0.2标准曲线绘制

利用八种不同浓度加内标的茉莉酸样品，以JA浓度为横坐标，JA峰面积与DHJA峰面积平均值之比为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示，R²达到0.9988。

本发明方法评价结果，以信噪比(S/N)为3确定茉莉酸的检出限(LOD)如表2所示：

表2 方法评价结果

数据明显呈线性相关，可以根据标准曲线对花生叶样品中的茉莉酸进行定量。

2.0.3加标回收率

设置5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平，花生叶内源茉莉酸的平均添加回收率在83.26％～92.57％，表明本实验检测的可靠性较高。

2.0.4实验数据

空白样品检测结果

对六个空白样品进行检测的结果，其MRM色谱图显示出空白样品中均不含有二氢茉莉酸，此方法适合用于花生叶的检测，并且大大降低了检测成本。

本实施例样品检测结果

分别对JH1012ck，JH1012han，J11han三种类型共48个样品编号进样检测，测得每个样品中茉莉酸的实际浓度，并计算平均浓度，结果见表3：

表3 实际花生叶中茉莉酸检测结果

图3是JH1012ck浓度-时间曲线图，由图3可知经过此种基因处理方法处理花生叶---JH1012ck中的茉莉酸含量，从12小时开始递减，36小时达到最低浓度，之后又逐渐升高。图4是JH1012han浓度-时间曲线图，由图4可知经过此种基因处理方法处理花生叶—JH1012han中茉莉酸含量，随处理时间变化没有明显规律，但在处理12小时时达到最低浓度，几乎为零，之后逐渐升高。图5是J11han浓度-时间曲线，由图5可知经过此种基因处理方法处理花生叶—J11han中茉莉酸含量，先随处理时间的增长而减少，在处理12小时时达到最低点，几乎为零，之后逐渐升高。对比以上两种处理的样品可知，JH1012han和J11han花生叶中茉莉酸含量在处理12小时左右会达到最低值。

表4所示，为本实施例1、2、3以及对照组的数据对比数据。其本实施例1、2、3的不同之处仅仅是样品处理中的固相微萃取搅拌棒涂层种类的不同，其余步骤及试剂均相同。而对照组没有选择萃取的过程。以上的最低检出限经过测量最高为4，最低为0.5。而对照组的最低检出限是40，与实施例对比明显。

表4 最低检出限数据比较

通过对上述花生叶片中的茉莉酸含量，科研人员可进行数据分析及结果推算，给科研人员带来极大的方便。并且，采用上述检测方法，实验数据准确，检测方法科学合理。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。