专利名称：伊维菌素人工抗原的合成新方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域的药物残留检测技术。
背景技术：
伊维菌素(Ivermectin，以下简称为IVM)是来自放线菌属Steptomyoesavermitilis的半合成大环内酯类抗生素，为阿维菌素的二氢还原产物(22，23-二氢AVM)。IVM在兽药残留污染源中属于毒性较大、休药期长的药物，在动物体内消除缓慢、残留时间较长。IVM及其代谢产物在动物体内的滞留或蓄积后，其残留成分循环进入人体及生态系统，产生其它对人体有明显危害的作用，还可能存在致畸、致癌、致突变(三致)作用。
目前国内外在IVM的研究主要集中在兽药药理作用方面，对于血药浓度测定方法、药物动力学及药物残留分析的研究报道很少，采用的分析方法也多是高效液相色谱(HPLC)测定法。IVM的使用剂量很小(0.2～0.3μg/kg)，水溶性极低，组织中药物最高残留限量为0.015～0.02μg/kg，因而对IVM残留的检测十分困难。目前，IVM残留的常规分析方法仍是以Tolan等(1980)的荧光衍生化检测为基础的高效液相色谱法(HPLC)，分析过程十分繁琐，操作条件苛刻，严重限制了其在实际中的可操作性。酶联免疫分析(ELISA)方法检测兽药残留简便，可靠、灵敏，但国内未见酶联免疫检测IVM报道，在同类药物中，李俊锁(畜牧兽医学报，1996，27(6)531-538)对阿维菌素抗体制备及其ELISA残留检测方法进行了研究；在已有的研究中，对兽药、农药人工免疫原合成载体多用牛血清白蛋白。何继红、沈建忠(中国兽医杂志，2005，115-17)等对进行了多拉菌素人工抗原的制备与鉴定进行了研究，二者所用人工免疫原合成载体均为牛血清白蛋白。由于牛血清白蛋白立体结构复杂，半抗原和载体蛋白连接，免疫动物后会产生针对载体蛋白部位的抗体，使抗血清的特异性降低，均一性差，在后期的ELISA分析中检测灵敏度低。
发明内容
鉴于目前国内外IVM残留的检测的现状，本发明提供一种伊维菌素人工抗原的合成新方法，为进一步研究IVM酶联免疫残留分析法提供试验手段。
本发明制成模拟IVM特征结构的半抗原，将其与载体蛋白的游离氨基偶联制成人工抗原。制备人工抗原，注射动物后获得抗血清，得到特异性多克隆抗体，是酶联免疫(ELISA)残留分析的主要步骤和核心技术。
其次，本发明选用多聚L-赖氨酸(PLL)作为偶联载体制备伊维菌素人工抗原，多聚L-赖氨酸为线性多肽，结构简单，免疫原性差，克服了半抗原和载体蛋白连接免疫动物后会产生针对载体蛋白部位的抗体。同时多聚赖氨酸游离氨基多，约是牛血清白蛋白的10倍。但由于偶联条件要求较为严格，国内农、兽药人工抗原制备中未见成功报道。
基于上述，本发明的目的通过以下步骤来实现(1)半抗原4″-O-(单)-琥珀酰IVM的合成分为三个步聚第一步用叔丁基二甲基氯硅烷(t-BuMe2SiCl)将IVM的C5-OH选择性保护；取1.0g IVM用6ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，机械搅拌下，加入0.47g咪唑和0.52g t-BuMe2SiCl(以1ml DMF预溶解)。25℃搅拌2.5h后，反应液与100ml的乙酸乙酯混合，50ml蒸馏水洗涤，收集乙酸乙酯层，反复水洗3次，减压浓缩酯层；残余物以1ml二氯甲烷复溶。经硅胶柱GF254(200-400目)分离产物，洗脱液为CH2CI2∶THF(100∶2，v/v)，TLC监控反应，收集Rf为0.47的组分。减压浓缩，真空干燥后，得白色粉末。HPLC分析主要成分含量为95.2％，通过质谱鉴定其分子量。
反应式为IVM+t-BuMe2SiCl→5-t-BuMe2SiO-IVM+HCl第二步在IVM C4″-OH部位构建间隔分子和活性基团取0.5g 5-O-t-BuMe2Si IVM溶解于10ml的二氯甲烷中，依次加入0.28g4-二甲氨基吡啶(DAMP)，0.5ml三乙胺和0.90g琥珀酸酐，在磁力搅拌条件下，回流2.5h，反应液变为黑褐色。通过减压方式除去反应液中的二氯甲烷，残留物用100ml乙醚重溶后过滤，滤液以3.6％盐酸20ml和蒸馏水50ml洗涤醚层，水洗反复3-5次，使pH为中性。收集醚层蒸干，以1ml二氯甲烷复溶，用TLC方法分离产物(GF254，展开剂为CH2Cl2∶THF∶CH3OH 95∶5∶5，v/v/v)，收集Rf为0.5的组分，以甲醇淋洗，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得淡黄色粉末。HPLC分析主要成分含量为94.3％；质谱鉴定其分子量。
反应式为5-t-BuMe2SiO-IVM+C4H4O3→5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM第三步去保护，得到C4″-O-(单)琥珀酰IVM取5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM 0.3g用17ml甲醇溶解，25℃磁力搅拌下加入0.2g对甲基苯磺酸(预先溶于10ml的甲醇)，25℃磁力搅拌25min后，加入100ml的乙酸乙酯，混匀后，用50ml的2％NaHCO3洗涤，再以蒸馏水洗涤3-5次，至pH中性。收集酯层减压浓缩，用二氯甲烷1ml复溶残留物，以TLC方法分离产物(GF254，展开剂为CH2Cl2∶THF∶HAC90∶9.7∶0.3，v/v/v)，收集迁移率(Rf)为0.2的组分，以乙酸乙酯淋洗，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得淡黄色粉末。HPLC分析主要成分含量为93.6％；质谱鉴定其分子量。
反应式为5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM+C7H8O3S→4″-O-琥珀酰IVM(2)人工抗原的合成采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法(NHS)合成人工抗原第一步取10.0mg4″-O-(单)琥珀酰IVM(制备的人工半抗原)置5ml圆底烧瓶中，加1.0mL DMF溶解，再依次加入2.5mgNHS和4.5mgEDC·HCL，混合后，在室温下磁力搅拌10h。
第二步在15ml三角瓶中加入5.4ml缓冲液为硼酸盐(0.2mol/L，pH9.0)，0.6ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，混匀后，将25mg多聚赖氨酸(PLL)溶解于其中。
第三步将第一步反应液在0.5h内逐滴加入第二步配制的溶液中，在25℃下搅拌1h后，转至4℃下搅拌6h。
第四步第三步产物装入透析袋(截止分子量为3500)内，透析液为0.01mol/L的PBS，pH7.2，每隔12小时更换1次透析液，透析72小时。取出透析袋，放入盛有聚乙二醇6000的烧杯中，将透析袋的水份吸干。
第五步用Sephacryl S-200纯化，利用紫外吸收光谱对半抗原与栽体蛋白的连接进行鉴定，经计算其结合比为1∶29，得到较纯IVM人工抗原，在-20℃下冻存。
本发明的优点和产生的有益效果是1.伊维菌素是阿维菌素家族中最优秀的驱虫药，在畜牧业生产中得以广泛应用，其残留检测方法见诸于报道的多为HPLC方法。酶联免疫分析技术作为兽药残留分析中的快速筛选技术，是保障动物性食品安全的主流方向，最为常用的是ELISA方法和试纸条技术，但国内尚没有见到IVM残留分析的酶免疫分析法，究其原因可能是IVM的分子结构比较复杂，对其进行人工改造及制备人工抗原存在着极大的挑战。本发明就IVM的结构特点，成功地合成了IVM的人工抗原，制备了针对IVM的多克隆抗体，为进一步研究IVM酶联免疫残留分析法奠定了基础；2.常用于兽药人工抗原合成的载体蛋白质包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)及钥孔血蓝蛋白(KLH)，其中又以牛血清蛋白最为常用。因为BSA理化稳定，经济易得，分子内自由氨基多，与半抗原偶联率高，并且具有在不同pH值和离子强度下以及在含有某些有机溶剂状态下都能保持较大的溶解度。近年来，国内外都有文献介绍以人工合成的多聚肽做载体(常用多聚L赖氨酸)，自身免疫原性很差但可以增加半抗原的免疫性，有利于机体产生特异性更高的抗体，且具有比BSA更多的自由氨基(与BSA相当分子量的多聚赖氨酸的自由氨基数约是BSA所含数目的10倍)，可以大大提高载体蛋白质与半抗原的偶联率。以多聚赖氨酸做载体来制备兽药人工抗原的报道尚未查到，本发明通过多次对偶联条件实验，成功以多聚赖氨酸PLL(MW3～8万)为载体合成了4″-O-(单)琥珀酰IVM-PLL，作为人工免疫原，为进一步研究IVM酶联免疫残留分析法创造了条件。
实施方式参见发明内容。
权利要求
1.一种伊维菌素人工抗原的合成新方法，其特征包含半抗原4″-O-(单)-琥珀酰IVM的合成和采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法合成人工抗原1)半抗原4′-O-(单)-琥珀酰IVM的合成第一步用叔丁基二甲基氯硅烷将琥珀酰IVM的C5-OH选择性保护取1.0g IVM用6ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，机械搅拌下，加入0.47g咪唑和0.52g t-BuMe2SiCl，以1ml DMF预溶解，25℃搅拌2.5h后，反应液与100ml的乙酸乙酯混合，50ml蒸馏水洗涤，收集乙酸乙酯层，反复水洗3次，减压浓缩酯层；残余物以1ml二氯甲烷复溶；经200-400目硅胶柱GF254分离产物，洗脱液为CH2Cl2∶THF，其体积比100∶2，TLC监控反应，收集Rf为0.47的组分；减压浓缩，真空干燥后，得白色粉末；反应式为IVM+t-BuMe2SiCl→5-t-BuMe2SiO-IVM+HCl第二步在IVM C4″-OH部位构建间隔分子和活性基团取0.5g 5-t-BuMe2SiO-IVM溶解于10ml的二氯甲烷中，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶，0.5ml三乙胺和0.90g琥珀酸酐，在磁力搅拌条件下，回流2.5h，反应液变为黑褐色。通过减压方式除去反应液中的二氯甲烷，残留物用100ml乙醚重溶后过滤，滤液以3.6％盐酸20ml和蒸馏水50ml洗涤醚层，水洗反复3-5次，使pH为中性；收集醚层蒸干，以1ml二氯甲烷复溶，用GF254TLC方法分离产物，展开剂为CH2Cl2∶THF∶CH3OH，其体积比位95∶5∶5，收集Rf为0.5的组分，以甲醇淋洗，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得淡黄色粉末；反应式为5-t-BuMe2SiO-IVM+C4H4O3→5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM第三步去保护，得到C4″-O-(单)琥珀酰IVM取5-r-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM 0.3g用17ml甲醇溶解，25℃磁力搅拌下加入10ml甲醇溶解的0.2g对甲基苯磺酸，25℃磁力搅拌25min后，加入100ml的乙酸乙酯，混匀后，用50ml的2％NaHCO3洗涤，再以蒸馏水洗涤3-5次，至pH中性；收集酯层减压浓缩，用二氯甲烷1ml复溶残留物，以GF254TLC方法分离产物，展开剂为CH2Cl2∶THF∶HAC，其体积比为90∶9.7∶0.3，收集迁移率(Rf)为0.2的组分，以乙酸乙酯淋洗，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，得淡黄色粉末；反应式为5-t-BuMe2SiO-4″-O-(单)琥珀酰IVM+C7H8O3S→4″-O-琥珀酰IVM(2)人工抗原的合成采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法合成人工抗原第一步取10.0mg制备的人工半抗原4″-O-(单)琥珀酰IVM置5ml圆底烧瓶中，加1.0ml DMF溶解，再依次加入2.5mgNHS和4.5mg EDC·HCL，混合后，在室温下磁力搅拌10h；第二步在15ml三角瓶中加入5.4ml 0.2mol/L pH9.0缓冲液为硼酸盐，0.6ml DMF，混匀后，将25mg多聚赖氨酸(PLL)溶解于其中；第三步将第一步反应液在0.5h内逐滴加入第二步配制的溶液中，在25℃下搅拌1h后，转至4℃下搅拌6h；第四步第三步产物装入截止分子量为3500的透析袋内，透析液为0.01mol/L的PBS，pH7.2，每隔12小时更换1次透析液，透析72小时；取出透析袋，放入盛有聚乙二醇6000的烧杯中，将透析袋的水份吸干；第五步用Sephacryl S-200纯化，利用紫外吸收光谱对半抗原与载体蛋白的连接进行鉴定，经计算其结合比为1∶29，得到较纯IVM人工抗原，在-20℃下冻存。
全文摘要
本发明伊维菌素人工抗原的合成新方法，其特征包含半抗原4″－O－(单)－琥珀酰IVM的合成和采用N－羟基琥珀酰亚胺酯法合成人工抗原。本发明通过多次对偶联条件实验，成功以多聚赖氨酸PLL(MW3～8万)为载体合成了4″－O－(单)琥珀酰IVM－PLL，作为人工免疫原，为进一步研究IVM酶联免疫残留分析法创造了条件。
文档编号C07H17/08GK101029067SQ200610041918
公开日2007年9月5日 申请日期2006年3月1日 优先权日2006年3月1日
发明者张继瑜, 张梅, 魏小娟, 李剑勇, 周绪正, 李金善 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所