专利名称：一种孕酮人工抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于孕酮检测领域，具体涉及一种孕酮半抗原、孕酮人工抗原和它们的制备方法；以及孕酮人工抗原的应用及其试剂盒。
背景技术：
孕酮(英文名称为Progesterone)是一种留体类激素，主要由黄体及胎盘产生， 血液中的孕酮多半与血浆蛋白结合，只有极少量以游离型存在，机体内主要在肝脏中降解， 主要代谢产物为孕二醇和妊娠烯酮醇。代谢物与葡萄糖醛酸或硫酸结合从尿中和胆汁中排泄，一部分孕酮及其代谢物也可从乳汁中排泄。雌性动物性周期中孕酮水平呈规律性变化， 发情期孕酮水平最低，黄体期孕酮水平较高，妊娠期孕酮水平则一直维持在较高水平上。如母猪发情周期外周血中孕酮含量先升高，到15天达到高峰期，其后下降，到19天时降到低水平Ong/mL。而母猪妊娠周期中，孕酮含量也是先逐渐升高，但是15天后其含量继续维持较高水平。因此，通过检测孕酮水平可以对母猪妊娠进行早期诊断。酶联免疫法(ELISA)基于抗原抗体反应和酶化学反应，具有方便、快捷、环境友好，样品需求量少，对昂贵仪器以及专业操作人员的依赖较低、适于大批量样品的临床检测等优点，因而常用于对孕酮的检测。但是，孕酮属于小分子化合物，这类化合物属于半抗原， 不具有免疫原性，因此，合成孕酮完全抗原就成为对其进行免疫检测的关键。传统上采用二环己基碳二亚胺法制备孕酮人工抗原，即将孕酮衍生物P4-Il α -半琥珀酸酯与载体偶联， (李志源等.中国农学通报.2011. 27 (7)，360-363)。但是根据分子免疫学原理(G00DR0W M H.等.Anal. Chim. Acta. 1998. 376 (1)，83-91)，半抗原与载体蛋白质的连接应在分子的远端，以突出抗原决定簇，并尽量保持原分子结构的特征，以保证抗血清能有效地与目标化合物特异性结合，而碳二亚胺法合成的完全抗原其载体蛋白连在孕酮的11位C上，偶联位点在甾环的中间位置，因此未能充分暴露孕酮的特异性位点，使得抗体对靶标化合物孕酮的识别能力较弱，难以产生针对孕酮的亲和力高、特异性强的孕酮抗体。专利申请《用于奶牛早期妊娠诊断的试纸及其检测方法》(公开号CN1796998A)中公开了以孕烯醇酮作为原料制备的孕酮完全抗原。但是孕烯醇酮的结构和孕酮相比，碳碳双键的位置不同，其空间结构差异很大，所以用孕烯醇酮制备的完全抗原也难以产生特异性强的孕酮抗体。^eraloids Inc.公司(2002)将孕酮-6 β-OH-半琥珀酸盐(郭大智.核农学报，2002，16 (1) :45 48) 作为孕酮半抗原出售，但是从结构上分析，孕酮-6 β -OH-半琥珀酸盐和P4-Il α -半琥珀酸酯一样都是将载体蛋白偶联在留环的中间位置。另据报道，Sigma公司(杨青等.中国生物制品学杂志，2007,20(11) :858 862)、Meraloids公司(王清刚等.分析化学，2000， 28(6) 731 734)和Meraloids公司有P-3-0-CM0的生产，但未见有关其合成方法的报道。从上述可知，现有孕酮人工抗原的免疫原性不强，不能充分暴露孕酮的特异性位点，因而不能产生特异性强的孕酮抗体，导致孕酮检测结果准确性较差。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种孕酮半抗原。本发明第二目的在于提供上述孕酮半抗原的制备方法。该方法简单，原料来源广， 生产成本低。本发明第三目的在于提供一种孕酮人工抗原。该人工抗原充分暴露孕酮留环结构和活性位点，可针对孕酮产生特异性强、效价高的孕酮抗体。将该人工抗原用于孕酮的检测，具有检测速度快、操作简单、成本低等优点。本发明第四目的在于提供上述孕酮人工抗原的制备方法。本发明第五目的在于提供含有上述孕酮人工抗原的孕酮抗体检测试剂盒。本发明第六目的在于提供含有上述孕酮人工抗原的孕酮检测试剂盒。本发明第七目的在于提供利用上述孕酮人工抗原检测孕酮抗体的方法。本发明第八目的在于提供利用上述孕酮人工抗原检测孕酮的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为本发明一种孕酮半抗原，是下述式(I)所示的化合物
权利要求
1. 一种孕酮半抗原，其特征在于是下述式(I)所示的化合物
2.权利要求1所述的孕酮半抗原的制备方法，其特征在于包括将孕酮和吡咯烷溶于甲醇，在20 30°C水浴中搅拌5 lOmin，其中孕酮和甲醇之间的比例为孕酮Immol 甲醇 6mL，孕酮与吡咯烷之间的摩尔比1 2;然后加入吡略烷和羧甲氧基胺半盐酸盐，加热，在 50 60°C下反应4. 5 5. 5h，其中所加入的吡咯烷和羧甲氧基胺半盐酸盐与孕酮之间的摩尔比为2 1 1;真空干燥，得黄棕色固体；将黄棕色固体溶于蒸馏水，其中蒸馏水与孕酮之间的比例为7. 5ml蒸馏水Immol孕酮；用lmol/L HCl调pH至2. 0，出现黄色沉淀，在 IOOOrpm离心5min，将上清液倒掉；用乙酸乙酯溶解黄色沉淀，其中所加入的乙酸乙酯与孕酮之间的比例为7. 5mL乙酸乙酯Immol孕酮；加入浓度为4%的NaOH溶液进行萃取，分为两层，上层为有机层，下层为水层，留取水层，将有机层重复萃取3 6次，然后合并水层， 其中所加入的浓度为4%的NaOH与孕酮之间的比例为7. 5mL NaOH Immol孕酮；冰浴冷却，用lmol/L HCl调pH至3.0，然后用与水层等体积的乙酸乙酯萃取
3.次，取上层的有机层合并；用与合并后的有机层等体积的单蒸水水洗有机层6次，直至有机层的pH值为6. 8 7. 2 ；按照有机层与Na2SO4之间Iml 0. 5 Ig的比例加入Na2SO4进行脱水，真空干燥，得到网格状的黄色晶体，即为孕酮-3-(0-羧甲基)肟。其中R为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白，R通过氨基端与孕酮-3-(0-羧甲基)肟以酰胺键连接。
4.权利要求3所述的孕酮人工抗原的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)按照每0. Immol孕酮-3-(0-羧甲基)肟溶于ImL无水N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) 的比例将孕酮-3- (0-羧甲基)肟溶于无水N，N- 二甲基甲酰胺中，加入三正丁胺，冰浴搅拌下加入溶于DMF的氯甲酸异丁酯(每0. 12mmol氯甲酸异丁酯溶于0. 8mLDMF中)，4°C下搅拌lh，升温，在室温下反应lh，得到反应液I ；其中孕酮-3-(0-羧甲基)肟和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1 1.2，其中三正丁胺的加入量为200 μ L三正丁胺Immol孕酮-3-(0-羧甲基)肟；(2)将反应液I滴加到牛血清白蛋白硼酸缓冲液或鸡卵清白蛋白硼酸缓冲液(用 PH 8.7，0.2mol/L的硼酸缓冲液稀释而成)中，其中反应液I的滴加比例为每0. Immol 孕酮-3-(0-羧甲基)肟滴加到16mL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白硼酸缓冲液或鸡卵清白蛋白硼酸缓冲液中；15 °C下搅拌过夜，得P-3-0-CM0-BSA液或P-3-0-CM0-0VA液；将 P-3-0-CM0-BSA液或P-3-0-CM0-0VA液置于透析袋中，在4°C下于0. 01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7. 4)中透析5天，每6小时换1次磷酸盐缓冲液，透析后得到纯化的 P-3-0-CM0-BSA 液或 P-3-0-CM0-0VA 液。
5.一种孕酮多克隆抗体，其特征在于是以权利要求3中所述的孕酮人工抗原 P-3-0-CM0-BSA为免疫原制备而得。
6.一种用于检测孕酮抗体的试剂盒，其特征在于包括用P-3-0-CM0-0VA包被的酶标板，样品稀释液，二抗稀释液，空白对照，阳性对照，阴性对照，洗涤液，HRP标记的二抗，底物溶液，终止液；其中所述的阴性对照是指未经免疫而得的哺乳动物血清；所述的阳性对照是指经P-3-0-CM0-BSA免疫哺乳动物而获得的孕酮抗血清。
7.一种用于检测孕酮含量的试剂盒，其特征在于包括用P-3-0-CM0-0VA包被的酶标板，孕酮标准品，样品稀释液，二抗稀释液，空白对照，阴性对照，洗涤液，孕酮多克隆抗体， HRP标记的二抗，底物溶液，终止液；所述的孕酮多克隆抗体是指用P-3-0-CM0-BSA免疫哺乳动物所得抗孕酮血清，再经纯化。
8.按照权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于所述的HRP标记的二抗是指山羊抗小鼠IgG、山羊抗大鼠IgG、山羊抗豚鼠IgG、山羊抗兔IgG、山羊抗人IgG、山羊抗猪IgG、山羊抗马IgG或山羊抗牛IgG。
9.利用权利要求3所述的孕酮人工抗原检测孕酮抗体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)向酶标板中加入浓度为0.30 5. 00 μ g/mL的P-3-0-CM0-0VA碳酸盐缓冲液 100 μ L/孔，4°C包被过夜，或37°C孵育Ih然后再4°C过夜；用PBST洗涤3次，每次3min，并用滤纸吸干；(2)加入2%明胶200μ L/孔，37°C封闭60 120min，洗涤3次；(3)将待检血清样品、阳性对照、阴性对照、空白对照加入酶标板不同的孔中，IOOyL/ 孔，37 °C作用30 90min，洗涤3次；(4)用PBS缓冲液将HRP标记的二抗稀释后加入酶标板中，100μ L/孔；37°C作用60 90min，洗涤5次；所述的HRP标记的二抗是指HRP-山羊抗小鼠IgG、HRP-山羊抗大鼠IgG、 HRP-山羊抗豚鼠IgG、HRP-山羊抗兔IgG、HRP-山羊抗人IgG、HRP-山羊抗猪IgG、HRP-山羊抗马IgG、HRP-山羊抗牛IgG ；(5)加入底物溶液100μ L/孔，室温避光作用5 20min，阴性对照稍有蓝色时加入终止液50 μ L/孔，在酶标仪上读取OD45tl值；Ρ/Ν值大于等于2. 1判为阳性，其中P指待检血清样品OD45tl值，N指阴性对照OD45tl值。
10.利用权利要求3所述的孕酮人工抗原检测孕酮含量的方法，其特征在于按照如下步骤进行(1)向酶标板中加入浓度为0.55 μ g/mL的P-3-0-CM0-0VA碳酸盐缓冲液100 μ L/孔， 4°C过夜；用PBST洗涤3次，每次3min，用滤纸吸干。(2)加入4%明胶200μ L/孔，37°C放置90min ；洗涤3次；(3)将不同浓度的孕酮标准液、阴性对照、和待检样品分别加入酶标板中，50yL/孔； 然后每孔中加入权利要求5的浓度为1. 43 μ g/mL的孕酮多克隆抗体50 μ L/孔，混勻，37°C 孵育1小时；设空白对照IOOul/孔；洗涤3次；(4)加入HRP标记的二抗100μ L/孔，37 °C孵育90min ；洗涤5次；所述的二抗是指 HRP-山羊抗小鼠IgG、HRP-山羊抗大鼠IgG、HRP-山羊抗豚鼠IgG、HRP-山羊抗兔IgG、 HRP-山羊抗人IgG、HRP-山羊抗猪IgG、HRP-山羊抗马IgG、HRP-山羊抗牛IgG ；(5)加入底物溶液100μ L/孔，避光放置5min ；(6)加入2M的H2S0450μ L/孔，测OD45tl值；以LgC为横坐标，以抑制率为纵坐标建立标准曲线，根据线性回归方程计算所测样品浓度，所得浓度就是样品孕酮含量；其中C各孕酮标准浓度；抑制率的计算公式为抑制率=(N-P)/NX 100%，N表示阴性对照OD45tl值，P表示孕酮标准品的OD45tl值。
11.权利要求3所述的的孕酮人工抗原在制备孕酮抗体检测药物上的应用。
12.权利要求3所述的的孕酮人工抗原在制备孕酮含量检测药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了属于孕酮检测领域的一种孕酮半抗原孕酮-3-(O-羧甲基)肟和孕酮人工抗原P-3-O-CMO-BSA和P-3-O-CMO-OVA及其制备方法，还公开了利用所述孕酮人工抗原制备的孕酮多克隆抗体及其制备方法，以及孕酮抗体和孕酮含量检测试剂盒。本发明人工抗原是将牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白通过氨基共价连接在在孕酮的3位C上，与现有的孕酮人工抗原相比，本发明孕酮人工抗原更有利于突出抗原决定簇，本发明人工抗原免疫原性强，所得到的孕酮抗体特异性强、效价高；其次，本发明孕酮半抗原的制备方法简单、成本低；此外，本发明适于大批量的血清、尿液样品的孕酮定性和定量检测。适于进行妊娠早期诊断。
文档编号G01N33/74GK102504002SQ20111038669
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者万荣峰, 季辉, 张军忍, 彭麟, 施宗傲, 江善祥, 董婷, 蔡冬 申请人:南京农业大学, 南京威泰珐玛兽药研究所有限公司