专利名称：磺胺甲噻唑人工抗原及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及磺胺甲噻唑人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术：
磺胺甲噻唑(Sulfamethylthiazole)，又名甲噻磺胺，是一种人工合成的中 效磺胺药，其性质稳定、抑菌谱广、毒性小、口服吸收良好且价格低廉，对畜禽疾 病控制与治疗起重要作用，广泛应用于畜牧业。但是由于它在体内的作用时间和代 谢时间较长，易残留在动物体内，通过任何途径摄入都有可能在人体中蓄积。药物 蓄积浓度超过一定值对人体机能是有害的，长期蓄积则会导致磺胺药抗药性的产 生，造成耐药菌的流行性感染，从而失去了治疗人类疾病的价值，对人类的身体健 康产生很大危害。所以，有必要对动物性食品中的磺胺类药物残留进行监测。我国 以及美国、欧盟等国家规定了动物性食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量 (MRLs)为0.1 mg/kg。
目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理 化分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐， 成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析由于在抗原抗体的定 性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优 点弥补了理化分析的不足，在磺胺药物的残留检测中起着越来越重要的作用。
影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定 于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体 和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。
发明内容
本发明的目的是提供一种磺胺甲噻唑人工抗原及其制备方法与应用。 本发明所提供的磺胺甲噻唑人工抗原，是将磺胺甲噻唑半抗原与载体蛋白偶联 获得的抗原。
磺胺甲噻唑半抗原是一种化合物，其结构为式I所示。
3式I
磺胺甲噻唑半抗原也是属于本发明的保护范围。
其中，所述的化合物与所述载体蛋白以酰胺键偶联。所述载体蛋白为牛血清白 蛋白或卵清蛋白。
所述磺胺甲噻唑半抗原可按如下的方法制备
在乙醇中将磺胺甲噻唑与对醛基苯甲酸反应，获得所述化合物。所述磺胺甲噻 唑与醛基苯甲酸的物质的量比为1: (1-3)。
本发明的磺胺甲噻唑半抗原在磺胺甲噻唑苯环的氨基上引入一个对醛基苯甲 酸结构，既最大程度保留了磺胺甲噻唑的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生活 性偶联的基团-C00H。磺胺甲噻唑半抗原经活性酯法与载体蛋白偶联可制备磺胺甲 噻唑的人工抗原。磺胺甲噻唑的人工抗原在磺胺甲噻唑半抗原与载体蛋白间含有一 个对醛基苯甲酸间隔臂，包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏 度和特异性。用该磺胺甲噻唑人工抗原免疫动物，可获得特性高的特异性抗体。该 磺胺甲噻唑人工抗原与其他已经报道的磺胺甲噻唑人工抗原联合应用于免疫分析， 可提高检测方法的灵敏度和特异性。本发明的磺胺甲噻唑半抗原和磺胺甲噻唑的人 工抗原可用于磺胺药物的残留检测。
图1为磺胺甲噻唑半抗原质谱图。
图2为磺胺甲噻唑人工抗原的紫外光谱图。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径 获得。
实施例l、制备磺胺甲噻唑半抗原 1.磺胺甲噻唑半抗原的制备
1) 称取IOO mg磺胺甲噻唑，置于10mL三角烧瓶中，滴加2mL无水乙醇， 充分搅拌使其完全溶解；
2) 称取100 mg对醛基苯甲酸，置于10mL三角烧瓶，滴加2mL无水乙醇，充分搅拌使其完全溶解；
3)将磺胺甲噻唑乙醇溶液和对醛基苯甲酸乙醇溶液混合，置于室温磁力搅拌 过夜。过夜之后，离心，弃上清液，获得浅黄色沉淀，60° C干燥，获得磺胺甲噻 唑半抗原121 mg，产率为30%。
2.磺胺甲噻唑半抗原的鉴定
取磺胺甲噻唑半抗原进行ESI质谱鉴定。该物质的ESI分子离子峰为405(M-l) 和407 (M+l)，见图1。
元素分析，结果(％，计算值)如下C， 50,36; H， 3.73; N， 10.36; 0， 19.73; S， 15.82。
磺胺甲噻唑半抗原的结构式如式I所示
式I
实施例2、制备磺胺甲噻唑人工抗原
1) 磺胺甲噻唑人工抗原的制备
10 mg实施例1的磺胺甲噻唑半抗原溶解于5 mLN，N-二甲基甲酰胺中，超声使 之完全溶解，并以冷乙醇冷却；加入IO mg的N，N， -二环己基碳化二亚胺(DCC) 和5 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应过夜；最后逐滴加入牛血清白蛋白或 卵清蛋白的PBS溶液(50 mg牛血清白蛋白或卵清蛋白溶解于5 mL 0. 01 M的pH 7. 4 的PBS中)，继续搅拌4小时；然后将反应液装入透析袋，在4° C用PBS溶液透析 72小时，获得磺胺甲噻唑人工抗原(SM2-BSA)或磺胺甲噻唑包被抗原(SM2-OVA)， 分装于安培瓶中，-20° C保存。
2) 磺胺甲噻唑人工抗原的鉴定
磺胺甲噻唑人工抗原用PBS配成溶液进行紫外(200-400 nm)光谱扫描，以l mg/mL的BSA作为对照。
紫外(200-400 nm)光谱扫描结果见图2，磺胺甲噻唑人工抗原的紫外图谱与 BSA相比发生了明显变化，说明磺胺甲噻唑半抗原与载体蛋白BSA成功偶联，经计 算实施例1的磺胺甲噻唑半抗原与载体蛋白的结合比为11: 1。
3) 磺胺甲噻唑人工抗原免疫动物及ELISA竞争抑制实验
5新西兰大白兔10只，随机分成两组，实验组和对照组，实验组以2)制备的磺 胺甲噻唑人工抗原进行免疫，对照组以牛血清蛋白(BSA)进行免疫。每只兔子每 次免疫l mg/mL (以BSA量计)，每两周免疫一次，共免疫7次，第三次免疫之后7 天，耳缘静脉采血，进行间接竞争ELISA分析，具体步骤如下
1. 包被用包被缓冲液将磺胺甲噻唑包被抗原稀释为系列浓度，每一浓度包被 一行，100uL/孔，4"C过夜；
2. 洗涤与封闭倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟；每孔加入
150 UL封闭液，37"C恒温封闭lh，然后洗涤3次，每次3分钟；
3. 加样将50 PL抗血清与等体积倍比稀释的磺胺甲噻唑标准液加到酶标板 上反应，每孔IOO uL， 37。C反应l小时，洗涤同步骤2;然后每孔加入100 uLHRP-羊抗兔IgG， 37"C反应1小时，洗涤同步骤2;
4. 显色测定每孔加入TMB溶液100 ixL， 37X:显色20min，然后每孔加入50 UL 2 mol L—1 H2S04以终止反应，最后用酶标仪测定各孔的0045。 值。
间接竞争ELISA结果表明，第6次免疫之后获得了特异性抗体，效价高达l: 102400。
建立间接ELISA方法，在倍比稀释的实验组(磺胺甲噻唑人工抗原免疫)兔血 清中加入100 ng/mL的磺胺甲噻唑标准品进行抑制检测，将其获得的OD值与未加 磺胺甲噻唑的OD值相比较。
分析结果表明，与阴性对照(未加磺胺甲噻唑标准品)相比，吸光值明显下降， 随着血清稀释倍数的增加，吸光值呈明显的递减梯度。说明获得的兔血清能够特异 性地识别磺胺甲噻唑。
权利要求
1、一种化合物，其结构为式I所示。式I
2、 磺胺甲噻唑抗原，是将权利要求l所述的化合物与载体蛋白偶联获得的抗原。
3、 根据权利要求2所述的磺胺甲噻唑抗原，其特征在于权利要求l所述的化合物与所述载体蛋白以酰胺键偶联。
4、 根据权利要求2或3所述的磺胺甲噻唑抗原，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5、 权利要求1所述化合物在磺胺药物的残留检测中的应用。
6、 权利要求2或3所述磺胺甲噻唑抗原在磺胺药物的残留检测中的应用。
7、 制备权利要求1所述化合物的方法，在乙醇中将磺胺甲噻唑与醛基苯甲酸反 应，获得所述化合物。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述磺胺甲噻唑与对醛基苯甲酸 的物质的量比为1:(1-3)。
9、 制备权利要求2-4中任一所述磺胺甲噻唑抗原的方法，是先制备权利要求l 所述化合物，然后将所述的化合物与载体蛋白偶联获得所述抗原。
全文摘要
本发明公开了一种磺胺甲噻唑人工抗原及其制备方法与应用。该磺胺甲噻唑人工抗原，是将磺胺甲噻唑半抗原与载体蛋白偶联获得的抗原。磺胺甲噻唑半抗原是一种化合物，其结构为式I所示。磺胺甲噻唑的人工抗原在磺胺甲噻唑半抗原与载体蛋白间含有一个对醛基苯甲酸间隔臂，包被原与免疫原结构上的差异可以进一步提高检测的灵敏度和特异性。用该磺胺甲噻唑人工抗原免疫动物，可获得特性高的特异性抗体。该磺胺甲噻唑人工抗原与其他已经报道的磺胺甲噻唑人工抗原联合应用于免疫分析，可提高检测方法的灵敏度和特异性。本发明的磺胺甲噻唑的人工抗原可用于磺胺药物的残留检测。
文档编号C07D277/18GK101643457SQ20091008564
公开日2010年2月10日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者吴小平, 静 张, 娜 李, 江海洋, 王亚辉, 王战辉, 米铁军 申请人:北京维德维康生物技术有限公司