专利名称：(3s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有抗血栓活性的缀合物，尤其涉及由(3S)-1，2，3，4-四氢异喹 啉-3-羧酸与三肽偶联而得的缀合物，本发明还涉及该缀合物的制备方法以及该缀合物作 为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。血管栓塞性疾病对心脑血管疾病的高死亡率负最重要的责任。血栓形成是血管栓 塞性疾病发病的最重要的病因。寻找抗血栓药物是新药研究的热点之一。发明人注意到，1， 2，3，4-四氢-β -咔啉-3-S-羧酸是中药薤白中的一种成分，具有抗血小板聚集活性(姚新 生等，中国药物化学杂志，1995，5，134)。发明人认为，(3S) _1，2，3，4-四氢-β -咔啉-3-羧 酸结构简化的合理步骤应当是去除吡咯环，简化得到的(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧 酸也具有抗血栓活性。但是(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸在极性溶剂和非极性溶剂 中溶解度都不好，生物利用度低，有待克服。
发明内容
针对(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸虽然具有抗血栓活性，但是存在水溶 度小、生物利用度低等缺陷，本发明将(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸的结构进行修 饰，在保证其抗血栓活性的前提下，改善(3S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸的吸收，提高 (3S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸的生物利用度。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的具有抗血栓活性的(3S)-1，2，3，4_四氢异喹啉_3_羧酸三肽缀合物，其结构式为 通式I所示其中，AAl选自 Gly、Asp 或 Gln ；AA2 选自 Gly、Asp 或 Gin。本发明还提供了通式I化合物的中间体，该中间体的结构为通式II所示 其中，AAl选自 Gly、Asp 或 Gln ；AA2 选自 Gly、Asp 或 Gin。本发明还提供了一种制备上述通式I缀合物的方法，包括以下步骤(1)在 DCC 和 NMM 存在下，将 N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰 基]-AA1 与 AA2-Arg (NO2)-OBzl 偶联制备 N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰
背景技术：
通式I基]-AA1-AA2-Arg (NO2)-OBzl ；其中 AA1 选自 Gly、Asp 或 Gln ；AA2 选自 Gly、Asp 或 Gln ；(2)将 N- [ (3S) -N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1-AA2-Arg (NO2) -OBz 1 脱去保护基，即得。优选的，步骤(2)中在三氟醋酸和三氟甲磺酸存在下，将N-[(3S)-N-Boc-l，2，3， 4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1-AA2-Arg(NO2)-OBzl脱去保护基；其中，三氟醋酸和三氟甲 磺酸的体积比为4 1.其中，所述的N-[ (3S) -N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰基]-AA1参照以 下方法制备得到(1)制备(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；(2)在(Boc)2O存在下 将(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸转化为(3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧 酸；(3)在二环己基羰二亚胺(DCC)和N-甲基吗啉存在下将(3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢 异喹啉-3-羧酸与L-AA1-OMe偶联，制备N- [ (3S) -N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰 基]-AA1-OMe ； (4)将 N-[ (3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1-OMe 水解制备 N-[(3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1 ；其中 AA1 选自 Gly、Asp 或 Gin。所述的AA2-Arg(NO2)-Obzl可参考以下方法制备得到(1)在二环己基羰二亚胺(DCC)和N-甲基吗啉存在下将Boc-AA2与 NH2-Arg (NO2) -OBzl 偶联制备 Boc-AA2-Arg (NO2) -OBzl ； (2)将 Boc-AA2-Arg (NO2) -OBzl 脱 Boc 制备得到 NH2-AA2-Arg (NO2) -OBzl ；其中，AA2 选自 Gly、Asp 或 Gln ；采用大鼠血栓模型上评价了本发明缀合物的抗血栓活性，试验结果表明，本发明 缀合物具有优秀的抗血栓活性，能作为抗血栓剂应用。本发明缀合物可以在水溶液中自组装成纳米颗粒，在水溶液中稳定(可以在水溶 液中稳定存在8天)，本发明缀合物的粒径大多在200 600nm之间。本发明的又一目的是提供一种含有本发明上述通式化合物的药用组合物，该药用 组合物由治疗上有效剂量的本发明缀合物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂组成；即 将有效量的本发明缀合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方 法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也 适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等 液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0. 1% -99%重量，优选 10-60%重量的本发明缀合物。
图1N-1，2，3，4-四氢异喹啉_3_S-甲酰基-AA1-AA2-Arg的合成路线图.I)甲醛和 浓盐酸；II) (Boc)2O, IN 氢氧化钠，四氢呋喃；III) L-AA1-OMe,DCC,HOBt 和 NMM，(AA1 = Gly, Asp, Gln) ；IV) 2N NaOH水溶液；V) NH2-Arg (NO2) OBzl，DCC，HOBt 和NMM(AA2 = Gly，Asp，Gln)； VI) 4N 氯化氢-乙酸乙酯溶液；(AA2 = Gly，Asp，Gin) ；VII)DCC，HOBt 和 NMM ；VIII)三氟醋 酸和三氟甲磺酸·在 la, 2a 中 AA1 = GlyjAA2 = Gly、lb，2b 中 AA1 = GlyjAA2 = Asp、lc，2c 中 AA1 = Gly, AA2 = Gin、Id, 2d 中 AA1 = Asp, AA2 = Gly、le,2e 中 AA1 = Asp, AA2 = Asp、 If, 2f 中 AA1 = Asp, AA2 = Gin、lg, 2g 中 AA1 = Gin, AA2 = Gly、lh, 2h 中 AA1 = Gin, AA2 = Asp、li，2i 中 AA1 = Gin, AA2 = Cln。图2激光粒度分析仪测定的化合物2a_i (I(T3M)在水相组装的纳米球的稳定性。
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图3激光粒度分析仪测定的化合物2a_i (I(T5M)在水相组装的纳米球的稳定性。图4激光粒度分析仪测定的化合物2a_i (I(T7M)在水相组装的纳米球的稳定性。
具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例1制备(3S)-1，2，3，4_四氢异喹啉_3_羧酸往4. Og(24. 2mmol)L-苯丙氨酸中先逐滴加入21.6ml甲醛，再逐滴加入36ml 35% 浓盐酸。得到的混悬液油浴加热至90-10(TC搅拌2两个小时苯丙氨酸完全溶解，反应2. 5 小时后，开始有白色沉淀生成，反应7小时，TLC(CHC13/CH30H = 5/1)显示L-苯丙氨酸消 失，抽滤得4. 2g淡黄色固体，将其晾干，然后将所得蛋黄色固体加入到86ml乙醇(80% ) 中80°C油浴加热至无色固体溶解，冷却至室温，慢慢滴加2mOl/mlNa0H氢氧化钾溶液，有无 色沉淀析出，至沉淀最多时过滤得4. 17g(97. 5% )标题化合物，为无色固体。Mp. 302. 1 302. 5°C，ESI-MS (m/e) 176 [Μ-1Γ. [α ]D25 = -68 (c = 0.6 甲醇)· 1HnmrGOOMHz, DMSO) δ / ppm = 2. 712 2. 919 (m, J = 5. 6Hz，2H) ；4. 136 4. 528 (m, J = 4. 5Ηζ，3Η)，7· 228 (t, J = 7. 7Ηζ，7· 3Hz, 1Η) ；7. 22 (t, J = 8. 2Ηζ，7· 2Hz, 1Η) ；7. 44 (d, J = 8. OHz, 1Η) ；7. 563 (d，J = 7·5Ηζ，1Η) ；8.91 (d, J = 6. 2Ηζ,1Η) ；12. 9(s, 1Η) ;13CWR(300MHZ，DMS0) :30· 2，46. 4，56. 6， 35. 5，125. 6，126. 8，128. 4，127. 2，135. 9，173. 2.实施例2制备(3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉_3_羧酸冰浴下把2. 49g(62. 15mmol)氢氧化钠溶入62. 2ml水，然后加入IOg(56. 49mmol) (3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸制成混悬液。用40ml四氢呋喃溶解14. 8g(67. 8mmol) (Boc)2O,加入混悬液中。反应混合物搅拌24小时，反应过程中不断的抽除反应生成的CO2, 当溶液变澄清，TLC(甲醇/氯仿1 10)示(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸消失，停 反应。反应混合物减压浓缩除去四氢呋喃，得到的油状物用乙酸乙酯溶解。得到的溶液依 次用5% KHSO4和饱和NaCl水溶液洗。有机层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至 干，得到的油状物用乙醚溶解做重结晶，得到的无色固体过滤，得到14. 84g(95% )标题化 合物。ESI-MS (m/e) 278. 2 [Μ+1]+，[α ]D25 = -6 . 78 (c = 0. 5 甲醇)实施例3制备N- [ (3S) -N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰基]-甘氨酸甲酯冰浴下往0. 256g(0. 924mmol) (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉 _3_ 羧酸与 IOml 无水THF的溶液中加0. 151g(l. 109mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，搅拌10分钟后加 Λ 0. 228g(l. 08mmol) 二环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液(I)。把 0. 136g(0. 102mmol) HCl · Gly-OMe悬浮于4ml无水THF中，加ImlN-甲基吗啉(NMM)调PH值8 9，搅拌得 到反应液(II)。把⑴加入(II)中，室温搅拌12h，TLC(乙酸乙酯/石油醚，1 3)显 示(3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸消失。滤出二环己基脲(D⑶)，滤液减压浓 缩至干，残留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5% NaHCO3水溶液洗3次、饱和 NaCl水溶液洗3次，5% KHSO4水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次，饱和NaHCO3水溶液 洗3次，饱和NaCl水溶液洗至中性。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩得 0. 31g(97% )标题化合物，为无色固体。TLC (乙酸乙酯/石油醚，1 3，Rf = 0. 17)，Mp 125. 7 125. 9 °C, ESI-MS (m/e) 349. 2 [M+l]+, 249. 2 [M+l-Boc]+, [α ]D25 = -15 . 83 (c = 0. 7
5甲醇)·实施例4制备N-[(3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]_L_天冬氨酸二 甲酯按照实施例3 的操作，从 0. 6g(2. 186mmol) (3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹 啉-3-羧酸和 0. 512g(2. 8mmol)HCl · Asp-(OMe)2 制得 0. 8g(96 % )标题化合物，为油 状物。TLC(乙酸乙酯 / 石油醚，1 3，Rf = 0. 18)，Mp 105. 6 106. 9 °C，ESI-MS(m/ e) 407. 3 [M+l]307. 3 [M+1-Boc][α ]D25 = -15 . 83 (c = 0.7 甲醇)·实施例5制备N-[(3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]_L_谷氨酰胺甲按照实施例3 的操作，从 0. 6g(2. 186mmol) (3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹 啉-3-羧酸和0. 534g(2. 8mmol)HCl · Gln-OMe制得0. 84g(98 % )标题化合物，为油状 物。TLC(乙酸乙酯 / 石油醚，1 3, Rf = 0. 30) ；Mp 100. 1 101. 5 "C, ESI-MS(m/ e)421. 3[M+2]2+，321. 2[M+l-Boc]2+，[α ]D25 = -28. 78 (c = 0. 6 甲醇)·实施例6制备N-[ (3S) -N-Boc-1,2,3,4-四氢异喹啉_3_甲酰基]-甘氨酸将1. 04g (3mmol) N-[ (3S) -N-Boc-1,2,3,4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-L-甘氨酸甲 酯溶于4ml甲醇，冰浴下向得到的溶液中滴入IOml NaOH(2N)水溶液。，溶液渐变为黄色，5 小时后TLC (乙酸乙酯/石油醚，1 3)显示N-[(3S)-N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲 酰基]-L-丙氨酸甲酯消失，减压浓缩蒸去溶剂，残留物加入30ml饱和KHSO4调PH值为1-2， 用乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯层用饱和NaCl洗1次，用无水Na2SO4干燥。过滤，滤 液减压浓缩，得0.96g(96% )标题化合物，为无色固体。Mp 147. 2 149. 3°C，ESI-MS (m/ e)333. 2[Μ_1Γ，[α ]D25 = -7 . 22 (c = 0. 5 甲醇)·实施例7制备^[(35)4-80(-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]_L_天冬氨酸按照实施例6 的操作，从 0. 736g(l. 75mmol)N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_ 四氢异喹 啉-3-甲酰基]-L-天冬氨酸甲酯制得0. 680g(99% )标题化合物，为油状物。Mp 131. 1 132. 9 °C, ESI-MS (m/e)391. 1[Μ_ Γ，[α ]D25 = -7. 92 (c = 0. 5 甲醇)·实施例8制备^[(35)4-80(-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]_L_谷胺酰胺按照实施例6的操作，从1. 8g(4. 3mmol)制备N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_四氢异喹 啉-3-甲酰基]-L-谷胺酰胺甲酯制得1. 75g(98% )标题化合物，为无色固体。Mp 153. 5 156. 7°C，ESI-MS(m/e)404. 2[Μ-1Γ，809· 3[2Μ-1Γ，[α ]D25 = -45. 38 (c = 0. 5 甲醇)·实施例9 制备 Boc-Gly-Arg (NO2) OBzl冰浴下往1. 73g(9. 885mmol) Boc-Gly-OH 与 IOml 无水 THF 的溶液中加 1. 21g(8. 963mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，搅拌 10 分钟后加入 2. 21g(10. 73mmol) 二 环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液(I)。把3. Ig (8. 973mmol)HCl · Arg(NO2)OBzl悬浮于 3ml无水THF中，加ImlN-甲基吗啉(NMM)调PH值8 9，搅拌得到反应液(II)。把⑴ 加入(II)中，室温搅拌12h，TLC (氯仿/甲醇，50 1)显示HCl · Arg(NO2)OBzl消失。滤 出二环己基脲(D⑶)，滤液减压浓缩至干，残留物用200ml三氯甲烷溶解。得到的溶液依次 用5% NaHCO3水溶液洗3次、饱和NaCl水溶液洗3次，5% KHSO4水溶液洗3次，饱和NaCl 水溶液洗3次，饱和NaHCO3水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗至中性。三氯甲烷层用无 水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩得3. 98g(95% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) 489. 3 [M+23]955. 6 [2M+23]+ ；Mp 124. 5 126. 7 °C, [a ]D25 = -2. 53 (c = 0. 5DMF) ·实施例10 制备 Boc-Asp (Arg (NO2) OBzl) 2按照实施例9 的操作，从 1. 31g(5. 62mmol)Boc-Asp 和 4g(ll. 58mmol) HCl · Arg(NO2)OBzl 制的 4. 5g(95. 3 % )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/ e) 838. 4 [M+23]Mp :185· 2 186. 2°C, [α ]D25 = -11. 38 (c = 0. 7DMF) ·实施例11 制备 Boc-Gln-Arg (NO2) OBz 1按照实施例9 的操作，从 1. 73g(7. 032mmol)Boc-Gln 和 3. 2g(6. 65mmol) HCl · Arg(NO2) OBzl 制的 3. 2g(89. 6 % )标题化合物，为无色固体。ESI_MS(m/ e) 560. 4 [M+23]+.，Mp :158· 2 159. 0°C, [α ]D25 = -21. 08 (c = 0. 5DMF) ·实施例12 制备 HCl · Gly-Arg (NO2) OBzl将2. 33g(5匪ol)Boc-Gly-Arg(NO2)OBzl加入5ml乙醚中，再往得到的溶液 中加25ml氯化氢-乙酸乙酯(4N)溶液。0°C搅拌6h，TLC(氯仿/甲醇，50/1)显示 Boc-Gly-Arg(NO2)OBzl点消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用IOml乙醚搅拌，再减 压浓缩至干。该操作反复三次。得1.86g(92.53% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/ e)367. 3[M+1]+，Mp :97· 2 97. 8°C, [α ]D25 = -12. 58 (c = 0. 6DMF) ·实施例13 制备 HCl · Asp (Arg (NO2) OBz 1) 2按照实施例12 的操作，从 4. 07g(5mmol) Boc-Asp (Arg (NO2) OBzD2 制的 3. 5g(93% )标题化合物，为无色固体。ESI-MS (m/e) 716. 7 [M+l]+，Mp 118. O 118. 2°C, [a ]D25 = -10 . 38 (c = 0. 5DMF).实施例14 制备 HCl · Gln-Arg (NO2) OBzl按照实施例12 的操作，从 3. 2g(6mmol)Boc-Gln-Arg(NO2) OBzl 制的 2. 8g(99. 6% ) 标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)438. 4[M+l]+，Mp 102. 4 103. O "C, [a ]D25 =-11. 38 (c = 0. 7DMF).实施例15制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gly-Gly-Arg (NO2)-OBzl (Ia)冰浴下往1. 102g(3. 3mmol)N-[(3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰 基]-甘氨酸与IOml无水THF的溶液中加0. 405g (3mmol) N-羟基苯并三氮唑(HOBt)， 搅拌10分钟后加入0.742g(3.6mmol) 二环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液(I)。把 1. 208g(3mmol)HCl · Gly-Arg(N02)OBzl 悬浮于 5ml 无水 DMF 中，加 ImlN-甲基吗啉(NMM) 调PH值8 9，搅拌得到反应液(II)。把⑴加入(II)中，室温搅拌24h，TLC(氯仿/甲 醇，50 1)显示HCl · Gly-Arg(NO2)OBzl消失。滤出二环己基脲(D⑶)，滤液减压浓缩至 干，残留物用200ml三氯甲烷溶解。得到的溶液依次用5% NaHC03水溶液洗3次、饱和NaCl 水溶液洗3次，5% KHS04水溶液洗3次，饱和NaCl水溶液洗3次，饱和NaHC03水溶液洗3 次，饱和NaCl水溶液洗至中性。三氯甲烷层用无水Na2S04干燥、过滤、滤液减压浓缩得浅 黄色固体，氯仿甲醇=60 1柱层析得到1. 208g(59% )标题化合物，为无色固体。Mp 98. 7 99. 4 °C, [a ]D25 = -15. 03 (c = 0. 55DMF) ；ESI (m/e) 682 [M+H]705 [M+Na]+.实施例16制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gly-Asp-[Arg (NO2)-OBzl]2 (Ib)按照实施例15 的操作，从 0. 367g(l. lmmol)N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_ 四氢异喹
7啉-3-甲酰基]-甘氨酸和 0. 751g (Immol) HCl .Asp (Arg (NO2) OBzl) 2 制的 0. 648g(62. 58% ) 标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) 1054[M+23]+，Mp 102. 7 102. 9 °C，[α ]D25 =-15. 11 (c = 0. 6DMF).实施例17制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gly-Gln-Arg (NO2) -OBzl (Ic)按照实施例15 的操作，从 1.052g(3. 15mmol) N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_ 四氢异喹 啉-3-甲酰基]-甘氨酸和 1. 42g(3mmol)HCl · Gln-Arg(NO2)OBzl 制的 0. 648g(62. 58% ) 标题化合物，为无色固体。ESI(m/e)754[M+H]+，776[M+Na]+，Mp 101. 9 103. 6 °C, [a ]D25 =-12. 14 (c = 0. 7DMF).实施例18制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Asp-Gly-Arg (NO2)-OBzD2 (Id)按照实施例15 的操作，从 0. 58g(l. 48mmol)N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_ 四氢异喹 啉-3-甲酰基]Asp(OH)2 和 1. 2g(2. 96mmol)HCl 'Gly-Arg(NO2)OBzl 制的 0. 894g(55. 6% ) 标题化合物，为无色固体。ESI (m/e) :1111 [M+Na]+，Mp 111. 2 112.4 °C，[α ]D25 =-17. 89 (c = 0. 6DMF).实施例19 制备 N-[ (3S) -N-Boc-1,2,3,4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Asp-[Asp (Arg (NO2) -OBzD2J2(Ie)按照实施例15 的操作，从 0. 412g(1.05mmol)N-[(3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢 异喹啉-3-甲酰基]-天冬氨酸和 1. 58g(2. ImmoDHCl · Asp [Arg(NO2) -OBzll2 制的 0. 946g(50. 4% )标题化合物，为无色固体。ESI (m/e) :1809[M+Na]+，Mp :112· 9 114. 8°C， [α ]D25 = -20. 78 (c = 0. 85DMF) ·实施例20制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Asp-[GIn-Arg (NO2)-OBz 1 ] 2 (1 f)按照实施例15 的操作，从 0. 58g(l. 48mmol)N-[ (3S) -N-Boc-l,2,3,4-四氢异喹 啉-3-甲酰基]-天冬氨酸和 1. 401g(2. 96mmol)HCl 'Gln-Arg(NO2)OBzl 制的0. 886g(53% ) 标题化合物，为无色固体。ESI (m/e) 1253 [M+Na]+，Mp 101. 7 102. 7 °C，[α ]D25 =-32. 06 (c = 0. 7DMF).实施例21制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gln-Gly-Arg (NO2)-OBzl (Ig)按照实施例15 的操作，从 1.053g(2. 6mmol)N-[(3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹 啉-3-甲酰基]-谷氨酰胺和 1. 098g(2. 73mmol)HCl 'Gly-Arg(NO2) OBzl 制的 1. 42g(63% ) 标题化合物，为无色固体。ESI (m/e) 776 [M+Na]+，Mp 111. 7 111. 9°C，[ α ]D25 = -17 . 60 (c =0. 65DMF).实施例22制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gln-Asp [Arg (NO2)-OBzl] 2 (Ih)按照实施例15 的操作，从 1. 276g(3. 15mmol) N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_ 四氢异喹 啉-3-甲酰基]-谷氨酰胺和 2. 254g(3mmol)HCl · Asp (Arg(NO2) OBzl) 2 制的 2. Ig(70% ) 标题化合物，为无色固体。ESI (m/e) 1103 [M+H]+，1125 [M+Na]+，Mp，108. 7 109. 2°C, [α ] D25 = -20. 93 (c = 0. 6DMF) ·
实施例23制备N-[(3S)-N-Boc_l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gln-Gln-Arg(NO2) -OBzl (Ii)按照实施例15 的操作，从 1. 276g(3. 15mmol) N- [ (3S) -N-Boc-1,2,3,4-四氢异喹 啉-3-甲酰基]-谷氨酰胺和 1. 42g(3mmol)HCl 'GlnArg(NO2) OBzl 制的 1. 98g(78% )标题 化合物，为无色固体。ESI (m/e) :847 [M+Na]+，Mp 101. 6 102. 4 °C, [a ]D25 = -21. 80 (c = 0. 5DMF) ·实施例24制备^[(35)_1，2，3，4_四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gly-Gly-Arg(2a)将500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_ 四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gly-Gly-Arg (NO2) OBzl在冰浴下用20ml三氟醋酸溶解，然后再向反应液中加入5ml的三氟甲磺酸，反应 40分钟TLC监测原料点消失，向反应液中一边搅拌一边加入150ml乙醚，反应液中逐渐 析出白色固体，将乙醚倾倒出，减压抽干得到褐色固体，再将固体用水溶解后，滤除不溶 物，S印dexGlO进行脱盐，得到水溶液冻干得到310mg(94. 2% )标题化合物。ESI (m/e) 448 [M+H]+, Mp 154. 6 155. 8°C, [α ]D25 = -19. 14 (c = 0. 85DMF) ·实施例25 制备 N-[ (3S)-1,2,3,4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gly-Asp- (Arg) 2 (2b)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰 基]-Gly-Asp [Arg (NO2) OBzl]2 中得至Ij 298mg (93% )标题化合物，ESI (m/e) :662 [M+H]+，Mp 136. 6 137. 8 °C, [a Jd25 = -36. 86 (c = 0. 5DMF) ·实施例26制备^[(35)_1，2，3，4_四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gly-Gln-Arg(2c)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gly-Gln-Arg(NO2)OBzl 中得到 320mg(92. 7% )标题化合物，ESI (m/e) :519[M+H]+，Mp 178. 4 178. 8 °C, [a Jd25 = -15. 37 (c = 0. 85DMF) ·实施例27 制备 N-[ (3S)-1,2,3,4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Asp- (Gly-Arg) 2 (2d)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Asp-(Gly-Arg(NO2)OBzD2 中得到 298mg(93% )标题化合物，ESI (m/e) :719[M+H]+， Mp :111. 6 111. 8 °C, [α ]D25 = -29. 69 (c = 0. 65DMF) ·实施例29制备N-[(3S)_1，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Asp-(Asp (Arg)2) 2 (2e)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_四氢异喹啉_3_甲 酰基]-Asp-[Asp-(Arg (NO2) OBzl) 2]2 中得到 300mg(93. 7 % )标题化合物，ESI (m/e) 1147[M+H]+ ；Mp 118. 6 119. 2 °C, [a Jd25 = -20. 27 (c = 0. 5DMF) ·实施例30 制备 N-[ (3S)-1,2,3,4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Asp- (Gln-Arg) 2 (2f)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4_四氢异喹啉_3_甲 酰基]—Asp-[Gln-Arg (NO2)-OBz 1]2 中得到 330mg(94. 2 % )标题化合物，ESI (m/e) 861[M+H]+，Mp 122. 6 123. 8°C, [α ]D25 = -41. 89 (c = 0. 6DMF) ·实施例31 制备^[(35)-1，2，3，4_ 四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gln-Gly-Arg(2g)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰 基]-Gln-Gly-Arg(NO2)-OBzl 中得到 318mg(92. 4% )标题化合物，ESI (m/e) :519[M+H]+， Mp :108·4 108. 8°C，[α ]D25 = -9. 41 (c = 0· 6DMF)，ESI (m/e) :519[M+H]+.实施例32制备^[(3幻-1，2，3，4_四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gin-Asp (Arg) 2 (2h)
按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gln-Asp-[Arg(NO2)-OBzl]2 中得到 314mg(94. 3% )标题化合物，ESI (m/e) :733[M+H]+， Mp :116. 6 117. 8 °C, [α ]D25 = -23. 68 (c = 0. 6DMF) ·实施例33制备^[(35)-1，2，3，4_四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-Gln-Gln-Arg(2i)按照实施例24的操作，从500mg N_[ (3S)-N-Boc-l，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲酰 基]-Gln-Gln-Arg(NO2)-OBzl 中得到 332mg(92.4% )标题化合物，ESI m/e) :590[M+H]+， Mp :142. 6 143. 8°C, [α ]D25 = -27 . 53 (c = 0. 5DMF) ·试验例1本发明化合物(2a_i)的抗血栓活性试验1、供试化合物本发明实施例所制备的化合物，分别编号为2a_i ；2、试验方法及结果测定前将供试化合物2a_I溶于生理盐水。雄性Wistra大鼠 (180-220g)用戊巴比妥钠(5.0mg/ml，3ml/kg)麻醉后分离右颈动脉和左颈静脉。把一根 6cm长的事先精密称重的丝线放在聚乙烯管中，将插管充满肝素钠的生理盐水溶液(50IU/ ml)后，一端插入左侧静脉，从一端加入定量(剂量lml/kg)肝素钠抗凝，并加入3a-i的生 理盐水溶液(剂量为lOnmol/kg ；3ml/kg)，然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯 管流入左侧静脉，15分钟后取出附有血栓的丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好 的离心管中，精确称重并记录。减重法计算出血栓的湿重。并记录湿重。以生理盐水(NS， 3ml/kg)作空白对照，以阿司匹林(剂量12mg/kg)作阳性对照。每个药品重复12次给药。 统计各组的血栓湿重(I 士SD),并做t检验。结果见表1。
表1化合物2a-i作用后血栓的重量(mg)
化合物血栓湿重(X±SDmg)生理盐水(3ml/kg)32.42 士 7.28阿斯匹林(12mg/kg)21.89±3.69a2a (lOnmol/kg)26.12±4.05b2b (lOnmol/kg)24.75±5.16b2c (lOnmol/kg)24.80±4.12b2d (lOnmol/kg)22.17 士 6.08a2e (lOnmol/kg)24.38±6.43b2f(10nmol/kg)27.92±4.52°2g (lOnmol/kg)22.19+5.4532h (lOnmol/kg)27.36±6.59c2i (lOnmol/kg)21.14±4.60a
η = 12 ；a.与生理盐水相比，P < 0. 01. b与生理盐水相比，P < 0. 05.
c与生理盐水相比无差异
试验例2本发明化合物在水溶液中的稳定性试验
1、供试化合物本发明实施例所制备的化合物(2a_i)；
10
2、试验方法及结果为了测定所合成的目标化合物在水溶液中的稳定性，分别称 取一定量供试化合物样品溶于三蒸水中，配制成l(T3m0l/ml水溶液，再将配好的溶液分别 稀释100、10000倍，分别配制成10_5mol/ml和10_7mol/ml的水溶液。用纳米粒径-动电位 测定仪对这三个不同浓度自组装的粒径进行测定，第一天样品为现配现用，并超声后进行 测定，以后对该样品连测八天，但从第二天到第八天的测定过程中不再对样品进行超声。并 记录每天的粒径值，观察其粒径大小随时间变化。由粒径结果表2可知供试化合物可以在水溶液中自组装成纳米颗粒，并可以在水 溶液中稳定存在8天，大部分供试化合物的粒径在200 600nm之间。表2观察2a_i粒径大小随时间变化(10-3M) 表3观察2a_i粒径大小随时间变化(I(T5M) 表4观察2a_i粒径大小随时间变化(I(T7M)
权利要求
具有抗血栓活性的(3S) 1，2，3，4 四氢异喹啉 3 羧酸三肽缀合物，其结构式为通式I所示其中，AA1选自Gly、Asp或Gln；AA2选自Gly、Asp或Gln。F2009100853249C0000011.tif
2.权利要求1所述的(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物的中间体，其结 构为通式II所示其中，AA1 选自 Gly、Asp 或 Gln ；AA2 选自 Gly、Asp 或 Gin。
3.一种制备权利要求1所述的(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物的方 法，包括以下步骤(1)将 四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1 与 AA2-Arg(NO2)-OBzl 偶联制备 N- [ (3S) -N-Boc-I，2，3，4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-AA1-AA2-Arg (NO2) -OBz 1 ；其中 AA1 选自 Gly, Asp 或 Gln ；AA2 选自 Gly, Asp 或 Gln ； 四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-AA1-AA2-Arg(NO2)-OBzl 脱 去保护基，即得。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中在三氟醋酸和三氟甲磺酸存 在下，将^[(35)4-80(-1，2，3，4-四氢异喹啉 _3_ 甲酰基]-AA1-AA2-Arg(NO2)-OBzl 脱去 保护基；其中，三氟醋酸和三氟甲磺酸的体积比为4 1。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的N-[(3S) -N-Boc-1,2,3,4-四氢异 喹啉-3-甲酰基]-AAl按照以下方法制备得到(1)制备(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧 酸；(2)在(Boc)2O存在下将(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸转化为(3S)-N-Boc-1， 2，3，4_四氢异喹啉-3-羧酸；(3)在二环己基羰二亚胺(DCC)和N-甲基吗啉存在下将 (3S) -N-Boc-1,2,3,4-四氢异喹啉 _3_羧酸与 L-AA1-OMe 偶联，制备 N-[ (3S) -N-Boc-1,2,3, 4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1-OMe ； (4)将N-[ (3S)-N-Boc-1，2，3，4-四氢异喹啉_3_甲 酰基]-AA1-OMe水解制备N-[ (3S) -N-Boc-1, 2, 3,4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1 ；其中AA1 选自 Gly、Asp 或 Gin。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的AA2-Arg(NO2) -Obzl按照以下方法 制备得到(1)在二环己基羰二亚胺(DCC)和N-甲基吗啉存在下将Boc-AA2与NH2-Arg (NO2)-OBzl 偶联制备 Boc-AA2-Arg(NO2)-OBzl ； (2)将 Boc-AA2-Arg(NO2)-OBzl 脱 Boc 制备得到 NH2-AA2-Arg (N02)-OBzl ；其中，AA2 选自 Gly、Asp 或 Gin。
7.—种药物组合物，其特征在于由治疗或预防上有效量的权利要求1所述的(3S)-1， 2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物和药学上可接受的载体或辅料所组成。
8.权利要求1所述的(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物在制备抗血栓药 物中的用途。式I所示
全文摘要
本发明公开了(3S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸三肽缀合物及其制备方法和应用。本发明缀合物的制备方法包括将N-[(3S)-N-Boc-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1与AA2-Arg(NO2)-OBzl偶联制备N-[(3S)-N-Boc-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酰基]-AA1-AA2-Arg(NO2)-OBzl；脱去保护基，即得；其中AA1选自Gly、Asp或Gln；AA2选自Gly、Asp或Gln。本发明缀合物具有优秀的抗血栓活性，临床上可作为抗血栓剂应用。本发明缀合物可以在水溶液中自组装成纳米颗粒，在水溶液中稳定，其粒径大多在200～600nm之间。
文档编号C07K5/093GK101899084SQ20091008532
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月26日 优先权日2009年5月26日
发明者姜南, 张建伟, 彭师奇, 赵明 申请人:首都医科大学