专利名称：呋喃唑酮代谢物半抗原、抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种呋喃唑酮代谢物半抗原、抗原及其制备方法和应用。
背景技术：
呋喃唑酮，又名痢特灵，属于硝基呋喃类药物，是一种人工合成的抗菌药，药 效稳定，能抑制或杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌，并对某些原虫、真菌有一定作 用，临床上常应用于防治畜禽肠道感染。据资料报道，呋喃唑酮具有较强的致畸、
致癌、致突变等毒副作用，其在动物性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。1995 年，欧盟禁止呋喃唑酮用于食品动物，随后美国、日本、澳大利亚、中国等均取消 呋喃唑酮在畜禽生产上的使用，但呋喃唑酮残留超标事件时有发生，因此很有必要 建立一种快速筛选呋喃唑酮残留的方法。
呋喃唑酮在动物体内很快代谢成3-氨基-2-恶唑烷基酮(A0Z)，与组织结合的 AOZ在体内滞留时间长，被视为残留标示物。AOZ的分子式为C3HaNA，结构如式(II ) 所示<formula>formula see original document page 4</formula>目前检测AOZ残留的方法有LC-UV， LC-MS和LC-MS-MS，该类技术所需设备要求 较高，不适合高通量样品筛选，仪器价格昂贵，对操作人员的要求较高，难于推广。 免疫分析检测技术是近年来在环境、食品安全监测领域逐渐广泛应用的一种快速、 高通量、低成本的检测技术，已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选监测的 主要方法之一，这为呋喃唑酮代谢物的检测提供了新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种呋喃唑酮代谢物半抗原、抗原及其制备方法和应用。 本发明提供的呋喃唑酮代谢物半抗原，是式(I )所示化合物<formula>formula see original document page 5</formula>本发明还保护式(I )所示化合物的制备方法，包括如下步骤(1) 将3-氨基-2-恶唑烷基酮(AOZ)和5-羟基-2-硝基-苯甲醛20-3(TC反应 6-8小时，干燥后得到粉末；(2) 将步骤(1)的产物与琥珀酸酐于有机溶剂中回流，得到式(I )化合物； 所述3-氨基-2-恶唑烷基酮(AOZ)、所述5-羟基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物质的量的比值可为(1-2) : (3-5) : (6-10)。所述3-氨基-2-恶唑垸基酮、所述5-羟基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物 质的量的比值具体可为l: 3.8: 8.3。步骤(1)中，所述反应可在有机溶剂或有机溶剂溶液中进行，常规有机溶剂 均可采用，如乙醇。实际操作中，可先将3-氨基-2-恶唑烷基酮和5-羟基-2-硝基-苯甲醛分别溶解，再把两个溶液混合，从而避免产物中含有大量未反应完全的原料。步骤(2)中，常规有机溶剂均可采用，既可为单一成分的有机溶剂，也可为 几种有机溶剂的混合物，如可为丙酮和吡啶的混合物。步骤(2)中，所述回流的温度可为6(TC-8(TC、时间可为8-10小时；所述回 流的温度优选为7(TC、时间优选为8小时。所述方法还可包括如下步骤将步骤(2)中回流后的产物在惰性气体环境中吹 干，然后将得到的粉末洗涤后烘干，以去除未反应完全的物质，采用惰性气体环境 是为了避免产物表面发生氧化。本发明提供的呋喃唑酮代谢物抗原，是将式(I )所示化合物与载体蛋白偶联 得到的偶联物。所述呋喃唑酮代谢物抗原的结构示意图见图3。本发明还保护所述呋喃唑酮代谢物抗原的制备方法，包括如下步骤 (1)将式(I )所示化合物、N，N' -二环己基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚5胺在N，N-二甲基甲酰胺中20°C-3(TC反应8-10小时；式(I )所示化合物、N,N， -二环己基碳化二亚胺(DCC)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的物质的量的比值为1: 1: 1: (3-5);(2)将步骤(1)的反应产物的上清液与载体蛋白溶液混合，2(TC-30'C反应4-6小时，得到所述呋喃唑酮代谢物抗原。常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)等。 步骤(2)中，所述载体蛋白溶液可为含有载体蛋白的磷酸盐缓冲液。 所述呋喃唑酮代谢物抗原可以作为免疫原制备呋喃唑酮代谢物特异性抗体。利用所述呋喃唑酮代谢物抗原作为免疫原免疫动物可获得高特异性的抗体，其抗血清效价可达到h 51200。应用所述呋喃唑酮代谢物抗原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。 所述抗体具体可为单克隆抗体。式(I )所示化合物、所述呋喃唑酮代谢物抗原、所述抗体均可应用于检测呋 喃唑酮代谢物。将所得抗体用于ELISA方法检测呋喃唑酮代谢物，检测灵敏度高，最低检测限 可达0.2ng/mL。所得抗体的特异性极好，呋喃唑酮代谢物人工抗原与硝基呋喃类其 它药物及常用抗菌药，如呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、四环素、磺胺二甲嘧啶、 阿莫西林、恩诺沙星、土霉素无交叉反应，交叉反应率都小于O. 01%。本发明提供的制备化合物的方法，操作简单，纯度和产率都很高。将本发明的 化合物免疫动物后产生对呋喃唑酮代谢物高亲和力的特异性抗体，用该抗体建立的 酶联免疫吸附分析法可用于快速、灵敏、简便地检测动物源性食品呋喃唑酮代谢物 的残留量。本发明具有重大经济价值和社会意义。
图1为呋喃唑酮代谢物半抗原负离子质谱图。 图2为呋喃唑酮代谢物人工抗原的紫外光谱图。 图3为所述呋喃唑酮代谢物抗原的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特 殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。产率^实际得到的产物的质量/理论上得到产物的质量X 100%。实施例1、呋喃唑酮代谢物半抗原的制备和鉴定一、 呋喃唑酮代谢物半抗原的制备3-氨基-2-恶唑烷基酮5-羟基-2-硝基-苯甲醛琥珀酸酐二l: 3.8: 8.3 (摩 尔比)。1、 溶液A和溶液B的制备溶液A: 25mg 3-氨基-2-恶唑烷基酮溶解于lmL蒸馏水中，备用。 溶液B: 155mg 5-羟基-2-硝基-苯甲醛，溶解于4mL乙醇中，备用。2、 在室温(20-30°C)条件下，以不断搅拌的方式，把溶液A逐渐加到溶液B 中，反应7小时，得到溶液C。3、 溶液C5000rpm离心10min，取出沉淀，用少量无水乙醇洗涤两次，置干燥 箱中6(TC烘干，得到黄色粉末。4、 将步骤3的产物转移至20mL圆底烧瓶内，加入200mg琥珀酸酐，溶解于5mL 丙酮和lmL吡啶混合溶液中，7(TC回流8小时。5、 将反应产物4CTC氮气吹干，得到固体粉末，用10mL蒸馏水洗涤两次，5000rpm 离心5min，沉淀置干燥箱中6(TC烘干。得到反应产物(呋喃唑酮代谢物半抗原) 41mg，产率为48. 9%。二、 呋喃唑酮代谢物半抗原的鉴定将步骤一制备得到的呋喃唑酮代谢物半抗原进行质谱鉴定和元素分析。 质谱图见图1。呋喃唑酮代谢物半抗原具有分子离子峰366 (M-l)。 半抗原化合物的元素分析结果(％) : C， 45.78; H; 3.57; N， 11.44; 0， 39.21。分析结果表明呋喃唑酮代谢物半抗原的结构如式(I )所示，分子量为367。实施例2、呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备和鉴定 一、呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备1、将实施例1制备的呋喃唑酮代谢物半抗原(式(I )所示化合物)溶解于 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入N，N' -二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温(20-3(TC)搅拌9小时，4'C过夜，离心分出上清 液；呋喃唑酮代谢物半抗原DCC: NHS: DMF 二l: 1: 1: 4 (摩尔比)。72、 将上清液加入到溶有载体蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液中(O.Olmol凡，pH 7.4)，继续搅拌5小时，得到呋喃唑酮代谢物人工抗原。3、 将步骤2的溶液装入透析袋，在4。C用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L， pH7.4) 透析72小时，换水10次。4、 将透析液在无菌条件下通过0.2um的滤膜，分装于安培瓶中，-2(TC保存。 二、呋喃唑酮代谢物人工抗原的鉴定将步骤一制备的呋喃唑酮代谢物人工抗原溶液用PBS溶液稀释，然后进行紫外 (200-400 nm)光谱扫描，以300 u g/mL的BSA作为对照。产物的紫外图谱与BSA 相比发生了明显变化，说明呋喃唑酮代谢物半抗原与载体蛋白BSA成功偶联。呋喃 唑酮代谢物半抗原分子与载体蛋白分子的结合比为14: 1。实施例3、抗血清的制备和特异性鉴定一、 免疫动物制备抗血清采用5只新西兰大白兔为免疫动物，以呋喃唑酮代谢物人工抗原(实施例2制备 的)为免疫原，每次免疫的免疫剂量为lmg/kg。免疫方法如下首免时将免疫原与 等体积弗氏完全佐剂充分乳化，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取将免疫原与弗 氏不完全佐剂混合制成乳化剂，加强免疫一次，共免疫7次，最后一次不加佐剂。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，采血后4。C 冰箱放置5-6小时，然后以5000 rpm离心10min，分离血清，血清经适当稀释后用间 接ELISA测定效价。第7次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的滴度为l: 51200。二、 抗血清最低检测限(LOD值)和半数抑制量(IC5。)的检测3-氨基-2-恶唑垸酮标准品购自Sigma Chemical Co. (St. Louis， M0).; CAS 编号80-65-9。用方阵滴定法确定呋喃唑酮代谢物包被抗原(A0Z-0VA，把载体蛋白换成卵清 蛋白，制备方法同呋喃唑酮代谢物人工抗原)和步骤一制备的抗血清的工作浓度， 呋喃唑酮代谢物包被抗原的工作浓度为500ng/mL，抗血清的工作浓度为1/8X 104。用不同浓度的3-氨基-2-恶唑烷酮标准品溶液做实验溶液，其浓度如下(单位 ng/mL): 0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128、 256。采用8组平行试验(n=8)。间接竞争性ELISA方法用上述工作浓度的抗原包被酶标板，将实验溶液与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将添加的实验溶液用高纯水代替，其它一致)，37'C温 育lh，倒出孔内液体，用洗涤液(10XPBST)洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上 拍打；加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，37'C温育lh，用洗涤液重复洗3-5次， 吸干；加入底物显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10-15min，用酶标仪在波长 450nm处测定吸光度值A。以吸光度值A为纵坐标，以3-氨基-2-恶唑烷酮实验溶液浓 度的loglO值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并 具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准 偏差(变异系数)均在15%以内。根据标准曲线得出10%抑制量和半数抑制量(IC5。)，比较检测灵敏度。抑制率用以下式计算抑制率(%)= (OD隨-OD咖HODx-OD隱) 。(ODmax画ODmin)式中ODmax为不加标准品时的吸光值(即阴性对照)，ODx为标准品x时的吸 光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。由ELISA方法的标准曲线可见，半数抑制量(IC5。)为l.O ng/mL，最低检测限 (LOD)为0.2ng/mL，在O. 2-4. lng/mL范围内，抑制率与药物浓度的对数值呈显著 的线性关系，相关系数为ri.9982。三、抗血清特异性测定抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能 力的比较。常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性 越好。检测呋喃唑酮代谢物人工抗原与如下几种物质的交叉反应率呋喃唑酮、AOZ、 3-(2-硝基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑垸酮(NP-AOZ)、呋喃唑酮代谢物半抗原、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、四环素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩诺沙星、土霉素。用样品稀释液将以上几种物质分别稀释成如下浓度Ong/ml、 0.5ng/ml、lng/ml、 2ng/ml、 4ng/ml、 8ng/ml、 16ng/ml、 32ng/ml、 128ng/ml。(请指明) 按照步骤二中所述方法，各自建立标准曲线，测定抑制中浓度IC5。。 交叉反应率(％)=(引起50%抑制的呋喃唑酮代谢物人工抗原的浓度/引起50%抑制的其它物质的浓度)xioo%。实验设3次重复，结果取平均数。所得特异性抗体与呋喃唑酮、NP-A0Z (呋喃 唑酮残留标识物)、呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃唑酮代谢物半抗原的交叉反应 率分别为5.24%、 100.0%、 3.72%、 113.65%;呋喃唑酮代谢物人工抗原与呋喃它酮、 呋喃妥因、呋喃西林、四环素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩诺沙星、土霉素交叉 反应率都小于0.01%。结果表明说明抗血清的特异性非常好。实施例4、呋喃唑酮代谢物半抗原的制备和鉴定一、 呋喃唑酮代谢物半抗原的制备3-氨基-2-恶唑垸基酮5-羟基-2-硝基-苯甲醛琥珀酸酐=1: 3: 6 (摩尔比)。1、 溶液A和溶液B的制备溶液A: 3-氨基-2-恶唑烷基酮溶解于lmL蒸馏水中，备用。 溶液B: 5-羟基-2-硝基-苯甲醛，溶解于4mL乙醇中，备用。2、 在室温(20-30°C)条件下，以不断搅拌的方式，把溶液A逐渐加到溶液B 中，反应6小时，得到溶液C。3、 溶液C 5000rpm离心10min，取出沉淀，用少量无水乙醇洗涤两次，置干燥 箱中6(TC烘干，得到黄色粉末。4、 将步骤3的产物转移至20mL圆底烧瓶内，加入琥珀酸酐，溶解于5mL丙酮 和lmL吡啶混合溶液中，6(TC回流10小时。5、 将反应产物4(TC氮气吹干，得到固体粉末，用10mL蒸馏水洗涤两次，5000rpm 离心5min，沉淀置干燥箱中60'C烘干。得到反应产物(呋喃唑酮代谢物半抗原)， 产率为50. 8%。二、 呋喃唑酮代谢物半抗原的鉴定将歩骤一制备得到的呋喃唑酮代谢物半抗原进行质谱鉴定和元素分析。 结果表明，同样得到了式(I )所示化合物。实施例5、呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备和鉴定 一、呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备1、将实施例4制备的呋喃唑酮代谢物半抗原(式(I )所示化合物)溶解于 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入N,N， -二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-10羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温(20-30°C)搅拌8小时，4匸过夜，离心分出上清 液；呋喃唑酮代谢物半抗原DCC: NHS: DMF =1: 1: 1: 3 (摩尔比)。2、 将上清液加入到溶有载体蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液中(0.01mol/L， pH 7.4)，继续搅拌4小时，得到呋喃唑酮代谢物人工抗原。3、 将步骤2的溶液装入透析袋，在4。C用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L， pH7.4) 透析72小时，换水10次。4、 将透析液在无菌条件下通过0.2um的滤膜，分装于安培瓶中，-2(TC保存。 二、呋喃唑酮代谢物人工抗原的鉴定将步骤一制备的呋喃唑酮代谢物人工抗原溶液用PBS溶液稀释，然后进行紫外 (200-400 nm)光谱扫描，以300 u g/mL的BSA作为对照。结果表明，得到了呋喃 唑酮代谢物人工抗原。实施例6、呋喃唑酮代谢物半抗原的制备和鉴定一、 呋喃唑酮代谢物半抗原的制备3-氨基-2-恶唑烷基酮5-羟基-2-硝基-苯甲醛琥珀酸酐=2: 5: IO(摩尔比)。1、 溶液A和溶液B的制备溶液A: 3-氨基-2-恶唑烷基酮溶解于lmL蒸馏水中，备用。 溶液B: 5-羟基-2-硝基-苯甲醛，溶解于4mL乙醇中，备用。2、 在室温(20-3(TC)条件下，以不断搅拌的方式，把溶液A逐渐加到溶液B 中，反应8小时，得到溶液C。3、 溶液C5000rpm离心10min，取出沉淀，用少量无水乙醇洗涤两次，置干燥 箱中6(TC烘干，得到黄色粉末。4、 将步骤3的产物转移至20mL圆底烧瓶内，加入琥珀酸酐，溶解于5mL丙酮 和lmL吡啶混合溶液中，80'C回流8小时。5、 将反应产物40。C氮气吹干，得到固体粉末，用10mL蒸馏水洗涤两次，5000rpm 离心5min，沉淀置干燥箱中60'C烘干。得到反应产物(呋喃唑酮代谢物半抗原)， 产率为49. 2%。二、 呋喃唑酮代谢物半抗原的鉴定将步骤一制备得到的呋喃唑酮代谢物半抗原进行质谱鉴定和元素分析。 结果表明，同样得到了式(I )所示化合物。实施例7、呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备和鉴定一、 呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备1、 将实施例1制备的呋喃唑酮代谢物半抗原(式(I )所示化合物)溶解于 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入N，N， -二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温(20-30°C)搅拌10小时，4"C过夜，离心分出上清液；呋喃唑酮代谢物半抗原DCC: NHS: DMF =1: 1: 1: 5 (摩尔比)。2、 将上清液加入到溶有载体蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液中(0.01mol/L， pH 7.4)，继续搅拌6小时，得到呋喃唑酮代谢物人工抗原。3、 将步骤2的溶液装入透析袋，在4。C用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L， pH7.4) 透析72小时，换水10次。4、 将透析液在无菌条件下通过0.2nm的滤膜，分装于安培瓶中，-2(TC保存。二、 呋喃唑酮代谢物人工抗原的鉴定将步骤一制备的呋喃唑酮代谢物人工抗原溶液用PBS溶液稀释，然后进行紫外 (200-400 nm)光谱扫描，以300 u g/mL的BSA作为对照。结果表明，得到了呋喃 唑酮代谢物人工抗原。1权利要求
1、式(I)所示化合物 id="icf0001" file="A2009100856450002C1.tif" wi="96" he="53" top= "34" left = "43" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>式(I)。
2、 式(I )所示化合物的制备方法，包括如下步骤(1) 将3-氨基-2-恶唑垸基酮和5-羟基-2-硝基-苯甲醛20-3(TC反应6-8小时， 干燥后得到粉末；(2) 将步骤(1)的产物与琥珀酸酐于有机溶剂中回流，得到式(I )化合物； 所述3-氨基-2-恶唑烷基酮、所述5-羟基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物质的量的比值为(1-2) : (3-5) : (6-10)。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述3-氨基-2-恶唑垸基酮、所述 5-羟基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物质的量的比值为1: 3.8: 8.3。
4、 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述反应是在有 机溶剂或有机溶剂溶液中进行的；步骤(2)中，所述回流的温度为60'C-8(TC、时间 为8-10小时。
5、 如权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步 骤将步骤(2)中回流后的产物在惰性气体环境中吹干，将得到的粉末洗涤后烘干。
6、 一种呋喃唑酮代谢物抗原，是将式(I )所示化合物与载体蛋白偶联得到的 偶联物。
7、 权利要求6所述呋喃唑酮代谢物抗原的制备方法，包括如下步骤(1) 将权利要求l所述化合物、N，N' -二环己基碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚 胺在N, N-二甲基甲酰胺中20。C-3(TC反应8-10小时；权利要求l所述化合物、N,N' -二环己基碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N-二甲基甲酰胺的物质的量的比值为1: 1: 1:(3-5);(2) 将步骤(1)的反应产物的上清液与载体蛋白溶液混合，20°C-3(TC反应4-6小时，得到所述呋喃唑酮代谢物抗原。
8、 权利要求6所述呋喃唑酮代谢物抗原在制备呋喃唑酮代谢物特异性抗体中的 应用。
9、 应用权利要求6所述呋喃唑酮代谢物抗原制备得到的抗体。
10、 权利要求l所述化合物、权利要求6所述呋喃唑酮代谢物抗原、权利要求9 所述抗体在检测呋喃唑酮代谢物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种呋喃唑酮代谢物半抗原、抗原及其制备方法和应用。本发明提供的呋喃唑酮代谢物半抗原是式(I)所示化合物，用式(I)所示化合物与载体蛋白连接可以得到呋喃唑酮代谢物抗原。所述呋喃唑酮代谢物抗原可应用于在制备呋喃唑酮代谢物特异性抗体。本发明提供的制备化合物的方法，操作简单，纯度和产率都很高。将本发明的化合物免疫动物后产生对呋喃唑酮代谢物高亲和力的特异性抗体，用该抗体建立的酶联免疫吸附分析法可用于快速、灵敏、简便地检测动物源性食品呋喃唑酮代谢物的残留量。本发明具有重大经济价值和社会意义。
文档编号C07D263/00GK101643455SQ20091008564
公开日2010年2月10日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者吴小平, 静 张, 飞 徐, 江海洋, 王亚辉, 王战辉, 阮永磊, 黄思扬 申请人:北京维德维康生物技术有限公司