一种维生素d抗原包被的反应板的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种维生素D抗原包被的反应板，包括微孔板，所述微孔板的微孔内包被有维生素D抗原层，所述微孔中维生素D抗原的包被量为0.1μg～10μg。本实用新型的反应板制备简单，成本低，操作简便，可用于检测维生素D3、维生素D2、25羟基维生素D3与抗体的结合反应。本实用新型的反应板与普通蛋白分子没有非特异性的结合反应，反应板具有较好的稳定性，37℃7天保存与常规4℃保存的反应板抗原抗体结合效价无明显变化。
【专利说明】一种维生素D抗原包被的反应板
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种维生素D抗原包被的反应板。【背景技术】
[0002]在过去的二十多年里，有关维生素D(vitamin D)以及其代谢产物的知识在爆炸性增长。维生素D在维持机体骨骼系统健康，预防以及治疗一些自体免疫疾病和肿瘤，已经得到广泛共识。WHO也明确制定了在乳制品中添加vitamin D类辅助品的规定。由于vitaminD属于脂溶性维生素类，长期，或者大量应用易引起药物在体内蓄积而产生毒副作用。因此，随时，准确检测食品或人体vitamin D含量的需求也越来越突出。
[0003]常规，并且公认的vitamin D检测方法是HPLC/LC-MS，但是其一次性投入大，有机溶剂消耗高，环境污染大，因此不适合中小企业或临床单位操作或广泛推广使用。随着ELISA技术的发展以及vitamin D抗体的出现,近二十年来,应用ELISA方法检测vitaminD有了长足的发展。
[0004]在ELISA检测方法中，目前已知的96孔反应板绝大多数为维生素D单克隆或多克隆抗体，或D-Binding Protein (维生素D结合蛋白)包被,个别为维生素D-蛋白分子偶联复合物，其代价高，准备过程复杂。
实用新型内容
[0005]本实用新型所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种维生素D抗原包被的反应板。该反应板可用于维生素D3、维生素D2、25羟基维生素D3与抗体的结合反应的检测。
[0006]为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案是:一种维生素D抗原包被的反应板，包括微孔板，其特征在于，所述微孔板的微孔内包被有维生素D抗原层，所述微孔中维生素D抗原的包被量为0.1 μ g?10 μ g。
[0007]上述的一种维生素D抗原包被的反应板，所述微孔板为48孔微孔板、96孔微孔板或384孔微孔板。
[0008]上述的一种维生素D抗原包被的反应板，所述维生素D抗原为维生素D3、维生素D2或25羟基维生素D3。
[0009]本实用新型与现有技术相比具有以下优点:
[0010]1、本实用新型反应板的维生素D抗原直接包被于微孔板内，制备方法简单，成本低，操作简便。
[0011]2、本实用新型的反应板可用于检测维生素D3、维生素D2、25羟基维生素D3与抗体的结合反应。
[0012]3、本实用新型的反应板与普通蛋白分子没有非特异性的结合反应。
[0013]4、本实用新型的反应板具有较好的稳定性，37°C 7天保存的反应板与常规4°C保存的反应板抗原抗体结合效价无明显变化。[0014]下面结合附图和实施例，对本实用新型的技术方案做进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本实用新型实施例1的反应板的结构示意图。
[0016]图2为本实用新型实施例2的反应板的结构示意图。
[0017]图3为本实用新型实施例3的反应板的结构示意图。
[0018]附图标记说明:
[0019]I 一微孔。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021]如图1所示，本实施例的维生素D抗原包被的反应板，包括微孔板，所述微孔板的微孔I内包被有维生素D抗原层，所述微孔I中维生素D抗原的包被量为0.1 μ g?10 μ g(优选 0.1 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g、1.0 μ g、2.5 μ g、5.0 μ g 或 10 μ g)，所述微孔板为 96 孔微孔板。
[0022]本实施例中，所述维生素D抗原为维生素D3、维生素D2或25羟基维生素D3。
[0023]实施例2
[0024]如图2所示，本实施例的维生素D抗原包被的反应板，包括微孔板，所述微孔板的微孔I内包被有维生素D抗原层，所述微孔I中维生素D抗原的包被量为0.1 μ g?10 μ g(优选 0.1 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g、1.0 μ g、2.5 μ g、5.0 μ g 或 10 μ g)，所述微孔板为 48 孔微孔板。
[0025]本实施例中，所述维生素D抗原为维生素D3、维生素D2或25羟基维生素D3。
[0026]实施例3
[0027]如图3所示，本实施例的维生素D抗原包被的反应板，包括微孔板，所述微孔板的微孔I内包被有维生素D抗原层，所述微孔I中维生素D抗原的包被量为0.1 μ g?10 μ g(优选 0.1 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g、1.0 μ g、2.5 μ g、5.0 μ g 或 10 μ g)，所述微孔板为 384 孔微孔板。
[0028]本实施例中，所述维生素D抗原为维生素D3、维生素D2或25羟基维生素D3。
[0029]一、本实用新型的反应板的制备方法:
[0030]步骤一、将维生素D晶体溶解于有机溶剂中，得到浓度为1.0 μ g/mL?100 μ g/mL的维生素D溶液；所述有机溶剂可以是乙醇、正己烷或乙腈；所述维生素D晶体为维生素D3，维生素D2或25羟基维生素D3 ；
[0031]步骤二、向微孔板的每个微孔中均加入100 μ L步骤一中所述维生素D溶液，避光，在4°C孵育16?18小时后清空微孔内的维生素D溶液，然后常温下避光干燥IOmin ；
[0032]步骤三、向步骤二中干燥后的每个微孔内加入350 μ L浓度为lwt%?10wt%的封闭液，避光，常温孵育2小时后清空微孔内的封闭液，然后采用PBS缓冲溶液清洗微孔板4次；所述封闭液为非蛋白类，如甘氨酸、聚乙二醇等；
[0033]步骤四、向步骤三中清洗后的微孔板的每个微孔内加入350 μ L浓度为lwt%?10wt%的蔗糖溶液，避光，常温孵育2小时后清空微孔内的蔗糖溶液，然后在37°C干燥15分钟，得到维生素D抗原包被的反应板，避光，防潮，4°C保存。
[0034]二、本实用新型的反应板的使用方法:
[0035]通过抗原-抗体特异性结合反应，本反应板主要用于检测抗体浓度、和效价反应。实验的详细步骤见抗体滴度试验。
[0036]三、抗体滴度试验:
[0037]以96孔反应板为例，对本实用新型的反应板进行抗体滴度试验，方法为:
[0038]步骤一、向包被抗原的反应板的微孔中加入维生素D单克隆抗体溶液或单抗分泌细胞培养上清液，37°C培养60分钟，弃去孔内溶液，PBS清洗3次；
[0039]步骤二、向步骤一中清洗后的反应板的微孔中加入100 μ LI: 5000 (体积比)稀释的二抗-HRP溶液，37°C培养60分钟，弃去孔内溶液，PBS清洗4次；
[0040]步骤三、向步骤二中清洗后的反应板的微孔加入100 μ L反应底物ΤΜΒ，常温培养20分钟，然后向微孔中加入0.1N盐酸溶液100 μ L终止反应，在450nm读取OD值，结果见表
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[0041]表1不同反应板的检测结果(每组试验重复一次)
【权利要求】
1.一种维生素D抗原包被的反应板，包括微孔板，其特征在于，所述微孔板的微孔(I)内包被有维生素D抗原层，所述微孔(I)中维生素D抗原的包被量为0.1yg?10 μ g。
2.根据权利要求1所述的一种维生素D抗原包被的反应板，其特征在于，所述微孔板为48孔微孔板、96孔微孔板或384孔微孔板。
3.根据权利要求1所述的一种维生素D抗原包被的反应板，其特征在于，所述维生素D抗原为维生素D3、维生素D2或25轻基维生素D3。
【文档编号】G01N33/82GK203732548SQ201320655913
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】韩雅君 申请人:韩雅君