孔雀石绿人工抗原和抗体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明申请提供孔雀石绿人工抗原和抗体的制备，涉及三苯甲烷类化学物质孔雀石绿人工半抗原、人工抗原及抗体的制备。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂、成本较高、分析速度慢的问题，提供了简便、快速、灵敏、准确的免疫分析技术。以4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸和5-{4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸为半抗原，分别与血蓝蛋白、卵清蛋白等载体蛋白连接合成人工抗原，再经动物免疫、取血、分出抗血清、纯化制得抗体。该抗体稳定、具有良好的特异性和灵敏度，可用于孔雀石绿的快速免疫检测，具有良好的应用前景。
【专利说明】孔雀石绿人工抗原和抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明申请涉及具有三苯甲烷类结构的孔雀石绿人工半抗原、特异性抗原的合成及特异性抗体的制备，属于小分子化合物免疫化学和残留分析【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着国民经济的快速发展，城乡居民生活水平不断提高，人们的饮食结构正发生深刻的变化。水产品以其低脂肪、低胆固醇、高蛋白、营养丰富、味道鲜美等优点，正成为广大消费者所青睐的食品之一。
[0003]与其它肉类产品相比，微生物更易于在水产品体内繁殖，在水产品的肠道、皮肤、肌肉中我们很容易发现各种致病菌、病毒和寄生虫，养殖户为了预防和防治水产动物患病或受微生物污染，在养殖过程中会使用杀虫剂、杀菌剂等，这些药物的违规使用或不合理使用又会引发药物残留等质量安全问题。因此，加快水产品安全快速检测技术研究，提高水产品质量，建立健全水产品质量监督体系，对提高我国水产品在全球市场的竞争力，具有重要的现实意义和深远的战略意义。
[0004]孔雀石绿是人工合成的有机化合物,其是由I摩尔分子的苯甲醒(Benzaldehyde)和2摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱(Leuco base)，在酸性条件下加过氧化铅使其氧化，并在碱性液中沉淀出色素碱，它属于三苯甲烷型的绿色染料。孔雀石绿以往仅在制陶业、纺织业、皮革业、食品着色剂等方面有所使用。自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产养殖中出现，而后因为其具有价格低廉、效果显著等优点，被广泛应用于预防与 治疗各类水产动物的水霉病和对原虫的控制。但随着研究的深入，发现孔雀石绿进入生物机体后可影响其生长和繁殖能力，造成肝、脾、肾和心脏的病变，对皮肤、眼睛及肺部都有一定的损伤，还具有致癌、致畸和致突变等副作用。鉴于孔雀石绿的危害性，国内外对其残留量制定了严格标准，包括美国、加拿大和欧盟在内的许多国家都规定，不能在水产品中使用孔雀石绿。欧盟确定孔雀石绿和隐色孔雀石绿的最低执法限量为2ug/kg;加拿大水产品养殖全程禁止使用孔雀石绿，并规定了鱼产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量须在Ippb以下，2002年12月农业部对农牧发[1999] 17号文《动物性食品中兽药残留限量》进行了重新修订(235号公告)中规定孔雀石绿为不得检出。日本于2006年实施的《肯定列表制度》，其中规定孔雀石绿不得检出。但由于孔雀石绿的抗菌效果较好，价格便宜，不少水产养殖户仍偷偷使用，因此对孔雀石绿的残留监控工作依然是一项艰巨而重大的任务。
[0005]目前孔雀石绿及隐孔雀石绿残留检测主要是气相色谱法和高效液相色谱法，仪器检测法虽然准确率较高，但因其设备昂贵，操作繁琐，不适用于现场快速检测。因而迫切需要开发一种简便、快速、灵敏的检测孔雀石绿残留的方法。
[0006]酶联免疫吸附分析，即ELISA法，利用了抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用，即保持了抗原抗体的特异性，又保持了酶催化反应的敏感性，因而极大的提高了反应灵敏度。同时它又属于一种非均相免疫分析，即在反应中的每一步都通过洗涤除去了未反应物质和干扰物质。利用ELISA方法不仅可以定性而且可以定量检测样品中的微量残留物，这种分析方法对仪器设备要求不高，具有简便快速，灵敏度高，特异性强，易于标准化、自动化和适于大容量样本分析等优点。20世纪80年代后，免疫分析技术已成为优先研究、开发和利用的兽药残留快速检测技术，美国化学学会已经将免疫分析方法与GC、 HPLC方法一起列为化学兽药残留分析的三大支柱技术，这也为食品中微量孔雀石绿残留检测提供了新的技术。
[0007]半抗原是指能与对应抗体结合可以发生抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原，即它只有反应原性，不具有免疫原性，故又称作不完全抗原。通常，具有免疫原性的物质分子量应大于10000，而一般兽药的分子量均小于1000，不能刺激机体产生针对兽药抗原决定簇的特异性抗体，因此小分子物质必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性，这也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的结构直接影响了抗体的选择性，半抗原分子的设计与合成是小分子免疫分析技术的关键所在。半抗原分子的设计应以兽药亲体以及有毒理学意义的代谢产物的分子结构为目标化合物，设计中应相应地突出特定兽药的分子结构，制备相应的单一特异性抗体或族特异性抗体。一般理想的半抗原分子应尽量具备与待测物类似的立体化学特征，以减少免疫交叉反应性，提高抗体的特异性；同时，要保证半抗原与载体的大分子偶联后，半抗原的特征结构能最大限度地被免疫活性细胞所识别，以制备出具有预期选择性和高亲和力的抗体。
[0008]人工抗原是半抗原与大分子载体蛋白偶联得到的完全抗原。使用载体不仅仅是简单地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其较强的免疫原性诱导机体产生免疫应答，从而使机体产生针对半抗原及人工抗原的特异性抗体。因此，免疫分析技术的关键是半抗原的分子设计、合成、人工抗原及抗体的制备。
【发明内容】
[0009]本发明申请的目的是通过设计合成具有三苯甲烷结构的兽药孔雀石绿的半抗原和人工抗原，突出了这类兽药分子特异性抗原决定簇，然后免疫动物产生亲和性很高的特异性抗体，并以此为基础建立了快速免疫方法，准确检测兽药孔雀石绿。
[0010]本发明申请的设计思路是，先合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效的人工抗原，免疫动物制备针对特定小分子分析物的特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性和定量的检测样本中超微量小分子目标物。其选择性在于免疫学反应的测定性，其灵敏度取决于抗体的亲和性和标记物的可检性，因此可以快速准确的检测兽药孔雀石绿在样`本中的残用量。其关键在于半抗原的分子设计，合成和全抗原及抗体的制备。
[0011]孔雀石绿的结构如图2所示所示.从免疫学角度分析，电子云密度较高的二甲氨基取代的两个苯环系统可能是产生特异性抗体的决定性特征结构区。因此，半抗原设计中必须要保留这部分特征结构，而在远离该药物特征结构区的非取代苯环的对位上衍生化与载体蛋白偶联的间隔臂。本发明申请在设计合成孔雀石绿半抗原时，在非取代苯环的对位引入吸电子性质的羧基，同时分别设计了长短不一的间隔臂。
[0012]本发明申请的目的之一是提供孔雀石绿半抗原。[0013]本发明的半抗原包括:(a) 4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸，和 (b)5-{4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，其中，
(a)4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的结构如下:
【权利要求】
1.一种孔雀石绿半抗原，其特征在于:所述的半抗原包括(a)4_[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸，和(b)5-{4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，其中，(a)4-[双 (4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的结构如下:
2.权利要求1所述的孔雀石绿半抗原与载体蛋白连接形成的完全抗原，其特征在于: 以4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸和5-{4_[双(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸为半抗原，分别与卵清蛋白或血蓝蛋白偶联，其结构如下:
3.权利要求1所述的4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸的合成方法如下，其特征在于，包括如下步骤:称取对-甲酰基苯甲酸甲酯和氯化锌于烧瓶中，然后加入N，N-二甲基苯胺，加热到120-140°C，搅拌反应4-6小时，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯/正己烷= 1:2 的硅胶柱层析纯化18_24h后，得到目标化合物4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基苯甲酸。
4.权利要求1所述的5-{4-[双(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸的合成方法如下，其特征在于，包括如下步骤:称取对-羟基苯甲酸溶于二氯甲烷中，(TC加入溴化苄及三乙胺，室温搅拌反应1-2天， (TC加入饱和氯化铵淬灭反应，二氯甲烷萃取，浓缩，硅胶柱纯化(乙酸乙酯/正己烷=1:3) 得到化合物4-羟甲基苯甲酸苯甲酯；将该产物溶于二氯甲烷中，(TC加入三氯异氰尿酸、NaHCO3及2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物，反应5-8分钟，硅胶柱纯化(乙酸乙酯/正己烷=1:2)，洗脱液浓缩得到化合物4-甲酰基苯甲酸苯甲酯；称取wittig试剂溶于四氢呋喃中，慢慢加入六甲基二硅基胺基锂，在-80—75°C搅拌0.5-2.0小时，加入4-甲酰基苯甲酸苯甲酯，两小时内温度由-80—75°C升到-25°C，TLC监测，浓缩，硅胶柱纯化(乙酸乙酯/正己烷=1:4)得到中间产物；将中间产物溶于无水甲醇， 加入钯碳，氢气保护，常温搅拌反应4-6小时，TLC监测，加入少量乙酸乙酯，硅胶柱纯化(甲醇)，浓缩得化合物4- 丁酸乙酯基苯甲酸；将上述产物溶于无水四氢呋喃，0-4°C加入氯甲酸异丁酯及三乙胺，搅拌反应1-2小时，加入硼氢化钠，继续搅拌反应3-5小时，0-4°C加入HC l淬灭反应，浓缩，乙酸乙酯萃取， 浓缩，硅胶柱纯化(乙酸乙酯/正己烷=1:5)得到化合物5-(4-羟甲基-苯基)-戊酸乙酷；将该化合物溶于二氯甲烷中，0-4°C加入三氯异氰尿酸、NaHCO3及2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物，反应5-8分钟后迅速过硅胶短柱(乙酸乙酯/正己 烷=1:4)，得到化合物5-(4-羟基_苯基)-戍酸乙酯；称取氯化锌和化合物5- (4-羟基-苯基)-戊酸乙酯于烧杯中，加入N，N- 二甲基苯胺， 加热到110-130°C，搅拌反应1-2天，TLC监测，乙酸乙酯萃取，硅胶柱纯化(甲醇/ 二氯甲烷 =1:10)，得目标化合物5-{4_[双(4-二甲胺基)苯基]甲基}苯基戊酸，产率25%。
5.权利要求2所述的完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:取权利要求1所述半抗原以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于烧瓶内加入无水四氢呋喃， 在N2保护下，逐滴加入溶有N，N- 二环己基碳二亚胺DCC的无水四氢呋喃溶液，边滴边搅拌，室温(18-25°C)下搅拌反应4-6 h，硅胶柱纯化得到半抗原活化酯；取权利要求1所述半抗原的活化酯溶于DMF配成溶液A，载体蛋白溶于磷酸缓冲溶液中配成溶液B，然后在冰浴下将溶液A缓慢加入溶液B中，经搅拌后在4°C下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4°C，ph=7.4的PBS溶液中透析三天，精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20 V下贮藏。
6.使用权利要求2所述完全抗原制备抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)免疫:免疫动物采用雄性新西兰大耳白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，共进行6次免疫,加强免疫分别在初次免疫后第2周,第4周和第6周进行三次，以后两次为一个月进行一次，从第3次免疫后开始采血测效价，采血时间为免疫后第10天； 初次免疫:取Img上述人工抗原溶于0.9%的NaCl和弗式完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； 加强免疫:取0.5mg上述人工抗原溶于0.9%的NaCl和弗式不完全佐剂等体积配制的溶液中，进行动物免疫； (2)抗体纯化:定时检测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用Protein A-Sepharose 4B蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备IgG抗体。
7.权利要求6所述方法制备得到的本发明申请还提供上述方法得到的特异性抗体用于间接竞争ELISA方法的建立，为在食品`中检测微量孔雀石绿残留中的应用奠定基础。
【文档编号】G01N33/53GK103524362SQ201310352708
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】胡章立 申请人:深圳大学