一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制 备方法。
【背景技术】
[0002] 正常情况下，机体将自身组织成分识别为"自我"，一般不对其产生免疫应答，此为 自身耐受。自身耐受的产生是由于在胚胎期发育的淋己细胞克隆，凡能识别自身组织的均 被破坏或禁忌，即Bumet的禁忌克隆学说。但在某些情况下，自身耐受遭到破坏，禁忌细胞 株活跃，机体免疫系统针对某些自身组织成分产生了免疫应答，就可能导致自身免疫病的 发生。发生自身免疫病的关键是机体产生了针对自身组织成分的自身抗体或致敏的T淋己 细胞，并在体内发生了自身免疫应答，导致自身组织细胞的损伤。机体为什么会产生自身抗 体及致敏T细胞，其原因是非常复杂的，据研究与W下因素有关。
[0003] -、自身抗原的出现
[0004](一）隐蔽抗原的释放
[0005] 隐蔽抗原（sequesteredantigen)是指体内某些组织成分如精子、眼内溶物、脑 等，在正常情况下从未与免疫细胞接触过，其相对应的淋己细胞克隆仍存在，并具免疫活 性。一旦因手术、外伤、感染等原因破坏隔绝屏障，隐蔽抗原释放入血流或淋己液，便与免疫 系统接触。免疫系统将其误认为是"异物"，引发自身免疫应答，导致自身免疫病的发生。
[0006](二）自身成分的改变
[0007]自身成分在受到物理因素（如冷、热、电离福射）、化学因素（如药物）或生物因素 (如细菌、病毒等）作用后，均可使其抗原性发生变化。改变了的自身成分可刺激免疫系统 引起自身免疫应答，导致自身免疫性疾病。
[0008] (H)共同抗原引发的交叉反应
[0009] 某些细菌、病毒与正常人体某些组织细胞上有相类似的抗原决定簇，针对该些细 菌、病毒抗原决定簇产生的自身抗体和致敏淋己细胞可与自身组织细胞发生交叉反应，弓I 起自身免疫性疾病。
[0010] 二、免疫调节异常
[0011] (一）淋己细胞旁路活化
[0012] 正常情况下，体内存在针对自身抗原的T/B淋己细胞克隆。一般化淋己细胞对自 身成分是处于耐受状态，B淋己细胞仍能对自身成分发生应答。由于无化细胞辅助，故正 常情况下不出现自身免疫应答。某些外来抗原具有与自身成分相似或相同的B细胞识别的 决定簇，但由于T细胞识别的载体决定簇不同，识别自身成分载体决定簇的化细胞处于耐 受状态，而识别外来抗原载体决定簇的化细胞能被激活发生反应，故外来抗原可辅助B细 胞产生免疫应答，即称为化细胞旁路活化，从而引发自身免疫应答。
[0013](二）多克隆刺激剂的旁路活化
[0014] 某些多克隆刺激剂如邸病毒和超抗原，可激活处于耐受状态的化细胞或者直接 向B细胞发出辅助信号刺激其产生自身抗体，引发自身免疫应答。
[0015] (H)辅助刺激因子表达异常
[0016] 在免疫应答过程中，免疫活性细胞的激活，除了免疫活性细胞对抗原递呈细胞表 面的抗原肤复合物识别外，还必须有两细胞间辅助刺激因子的相互作用。如抗原递呈细胞 表面辅助刺激因子的异常表达，便可激活自身免疫应答的T细胞，引发自身免疫性疾病。
[0017] 此外，Thl和Th2细胞的功能失衡和自身免疫性疾病的发生也有一定关系。
[001引 H、化s/化sL表达异常
[0019] 化s/化sL表达异常和自身免疫病的发生有关，Fas属TNFR/NGFR家族成员（又称 CD95)，普遍表达于多种细胞包括淋己细胞表面。其配体即化sL(Fasligand)通常出现于 活化的T细胞如CTL和NK细胞膜上，又可W分泌脱落至细胞外。无论是膜结合型或是游离 型的化sU与细胞膜上的Fas结合后均可诱导细胞调亡。在化s/化sL基因缺陷的患者体 内，因为激活诱导自身免疫应答的淋己细胞调亡机制受损，T、B淋己细胞克隆性增殖失控， 故易发生多种自身免疫性疾病。
[0020] 四、遗传因素
[0021] 人类的自身免疫性疾病常有家族遗传倾向。研究中发现多种自身免疫性疾病的发 生率与HLA的某些基因型检出率呈正相关。大多数HLA系统与自身免疫性疾病的相关性表 现在HLA-B或DR抗原上。
[002引如公布号为CN103018436A，公布日为2013-4-3的一种用家兔制备鸡传染性支气 管炎阳性血清的方法，其在经过免疫取血后，仅将血液分离出血清，对血清进行离也过滤就 得到阳性血清。但是，该阳性血清存在使用效果不好的问题。
【发明内容】
[0023] 本发明所要解决的技术问题是提供一种使用效果优良的自身免疫性抗原（自免 原）阳性血清的纯化制备方法。
[0024] 为解决W上技术问题，本发明采取如下技术方案：
[0025] -种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，包括用自身免疫性抗原对健康动 物进行免疫、采血后获得抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤， 所述的纯化的具体方法为：
[0026] 对所述的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将所述的IgG抗体和人源IgG化或 人源IgM化或人源IgA化按质量比为1:1~2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgG化连 接物浓溶液或IgG-IgM化连接物浓溶液或IgG-IgA化连接物浓溶液，将所述的IgG-IgG 化连接物浓溶液或IgG-IgM化连接物浓溶液或IgG-IgA化连接物浓溶液稀释至浓度为 0. 5~1yg/ml，即得所述的阳性血清。
[0027] 优选地，采用琼脂糖亲和介质或者采用免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。
[0028] 进一步优选地，所述的琼脂糖亲和介质为Protein-Ase地arose化-4B。
[0029] 进一步优选地，所述的免疫亲和层析柱为所述的自身免疫性抗原与琼脂糖凝胶连 接成的弟和层析柱。
[0030] 进一步优选地，所述的抗血清先经过硫酸馈处理后，再采用所述的免疫亲和层析 柱进行所述的亲和纯化。
[0031] 优选地，所述的人源IgG化或人源IgM化或人源IgAFc，是将人源IgG或人源 IgM或人源IgA溶解在木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白酶消化，再用楓己醜胺终止消化 反应后，用琼脂糖亲和介质提取获得的。
[0032] 优选地，所述的IgG抗体和所述的人源IgG化或人源IgM化或人源IgA化通过 2-亚胺四氨喔吩偶联剂或4- (N-马来醜亚胺基甲基）环己焼-1-駿酸玻巧醜亚胺醋偶联剂 活化后，在pH7. 2~7. 4的条件下进行所述的偶联。
[003引进一步优选地，所述的2-亚胺四氨喔吩偶联剂的浓度为9~llmg/ml，所述的 4-(N-马来醜亚胺基甲基）环己焼-1-駿酸玻巧醜亚胺醋偶联剂的浓度为4~6mg/ml。 [0034] 进一步优选地，采用Se地adex200凝胶纯化柱进行所述的分离纯化。
[00巧]进一步优选地，采用含质量比为0. 4~0. 6%的牛血清白蛋白、抑7. 5~8. 5、 0.09~0.llmol/L的H轻甲基氨基甲焼缓冲液将所述的IgG-IgG化连接物浓溶液或 IgG-IgM化连接物浓溶液或IgG-IgA化连接物浓溶液进行所述的稀释。
[0036]由于W上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0037] 我们可W根据市场需要来有计划的生产（从几毫升到几千毫升），并且可W有效 的控制批间差异。该是目前流行的阳性血清的制备方法无法做到的。另外，我们用人源的 IgG化或IgM化或IgA化与抗血清中的IgG抗体连接，相比用人源IgG或IgM或IgA与 抗体IgG直接连接分子量要小，该样就可W尽量避免交叉反应的发生。该样我们在提高特 异性的同时，又能够在阳性血清上有效的保留了二抗的结合位点。
[0038] 本发明方法可批量制备各种自身免疫性抗原的阳性血清，解决了检测试剂盒制备 过程中的阳性质