专利名称：兔抗人cide－3蛋白多克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种蛋白的多克隆抗体，特别是一种兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体。
背景技术：
诱导细胞死亡的DFF45样效应因子(cell death-inducing DFF45-likeeffector，CIDE)-3于2003年发现，位于人类3p25染色体上，全长约169 kb。其过表达时可诱导人肾上皮细胞系293T细胞和乳腺癌细胞系MCF-7细胞的凋亡。CIDE家族蛋白可裂解为N端(CIDE-N)和C端(CIDE-C)。CIDE-N是相互作用的结构域，CIDE家族蛋白可与其他含有CIDE-N结构的蛋白形成同二聚体或异二聚体，CIDE-C为功能结构域，发挥诱导凋亡的功能。在人类其家族成员有3种CIDE-A、CIDE-B及CIDE-3，其中CIDE-A和CIDE-B可诱导非Caspase依赖的细胞凋亡，但可被DFF45阻断。而作为同一家族成员的CIDE-3是否也可通过相同的途径诱导细胞凋亡？根据申请人所进行的资料检索，目前尚未发现有相关的文献报道。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于，提供一种兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体。申请人构建了人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E.coli BL21(DE3)中成功地了表达蛋白，经过纯化后免疫兔，获得了效价高、特异性较强的兔抗人CIDE-3蛋白血清，为进一步研究人CIDE-3奠定了实验基础。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案
一种兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体，该抗体为重组的人CIDE-3N端172个氨基酸重组蛋白，其基因及氨基酸序列如下1 atggaatacgccatgaagtcccttagccttctgtaccccaagtccctctccaggcatgtgM E Y A M K S L S L L Y P K S L S R H V60 tcagtgcgtacctctgtggtgacccagcagctgctgtcggagcccagccccaaggcccccS V R T S V V T Q Q L L S E P S P K A P120 agggcccggccctgccgcgtaagcacggcggatcgaagcgtgaggaagggcatcatggctR A R P C R V S T A D R S V R K G I M A180 tacagtcttgaggacctcctcctcaaggtccgggacactctgatgctggcagacaagcccY S L E D L L L K V R D T L M L A D K P240 ttcttcctggtgctggaggaagatggcacaactgtagagacagaagagtacttccaagccF F L V L E E D G T T V E T E E Y F Q A300 ctggcaggggatacagtgttcatggtcctccagaaggggcagaaatggcagcccccatcaL A G D T V F M V L Q K G Q K W Q P P S360 gaacaggggacaaggcacccactgtccctctcccataagcctgccaagaagattgatgtgE Q G T R H P L S L S H K P A K K I D V420 gcccgtgtaacgtttgatctgtacaagctgaacccacaggacttcattggctgcctgaacA R V T F D L Y K L N P Q D F I G C L N480 gtgaaggcgactttttatgatacatactccctttcctagV K A T F Y D T Y S L S * 。
上述兔抗人CIDE-3多克隆抗体的制备方法是用多克隆抗体技术先把人CIDE-3重组蛋白和同等体积的弗氏佐剂乳化后，背部皮下多点，多次注射于新西兰白兔，使其产生特异性抗体。然后用ELISA方法检测其效价，用Western blot检测抗体的特异性。通过多克隆抗体技术用人CIDE-3重组蛋白作为抗原，免疫新西兰白兔获得了高效价的免疫兔血清即兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体，经ELISA检验效价高于1∶500000，Western blot显示特异性比较强。
具体实施例方式
CIDE-3基因的诱导表达质粒pET28a(+)/CIDE-3(本实验室构建，质粒pET28a(+)购自Novagen公司)转化E.coli BL21(DE3)(购自上海生工公司)，挑单克隆菌落，于含30μg/ml卡那霉素(购自上海生工公司)的LB中37℃震荡培养过夜，次日1∶100接种于含50μg/ml卡那霉素的SOB中，37℃震荡培养至OD600＝0.6，加终浓度为0.4 mM的IPTG(购自TaKaRa公司)诱导表达3h，12000 rpm离心收集菌体。经IPTG诱导后，CIDE-3蛋白主要以包涵体的形式存在，表达的蛋白约占菌体总蛋白的32％。
CIDE-3蛋白的纯化1000ml诱导菌体重悬于含1％TritonX-100的PBS中超声裂解，分离收集包涵体，经Buffer A(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01MTris-cl，pH 8.0)变性，同Ni-NTA Agarose(购自Invitrogen公司)孵育后填柱，经Buffer B(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-cl，pH 6.3)、Buffer C(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-cl，pH 5.9)洗脱未结合成分，Buffer D(8M尿素，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-cl，pH 4.5)洗脱结合蛋白。洗脱液于4L透析液(0.01M Tris-cl，0.1％TritonX-100)中透析24h，8000rpm离心收集蛋白，重悬于PBS。
CIDE-3蛋白的鉴定将纯化前后的蛋白分别进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定分析。将纯化后的人CIDE-3蛋白进行SDS-PAGE后，转移至PVDF膜；5％脱脂奶粉封闭，加入滴度为1∶1000的鼠抗组氨酸标签抗体(购自北京中杉金桥公司)，4℃过夜；TTBS洗涤；次日加入1∶2500 HRP标记羊抗鼠IgG(购自北京中杉金桥公司)，37℃孵育1h；分别用TTBS、TBS洗涤，DAB(购自北京中杉金桥公司)显色。SDS-PAGE显示与诱导前对照相比，诱导后的表达产物在相对分子质量(Mr)23×103处有明显的蛋白带，并且经Ni-NTA Agarose纯化后，得到同样大小的一条蛋白带，符合CIDE-3理论值的大小。由于重组质粒pET28a(+)/CIDE-3在多克隆位点的上游同一阅读框架内存在组氨酸标签基因，能编码6个组氨酸(His)6与目的蛋白融合表达，所以应用鼠抗组氨酸标签抗体进行Western blot，结果证实该条带为目的表达蛋白。
兔抗人CIDE-3蛋白血清的制备选体重2.0kg的雄性新西兰白兔(购自本校动物实验中心)，于背部皮下多点注射纯化后的人CIDE-3蛋白，共免疫注射4次第一次为1mg的人CIDE-3蛋白加等体积完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)；后三次均采用500μg人CIDE-3蛋白加等体积不完全弗氏佐剂，每次间隔为10d；末次免疫1w后，股主动脉放血、收集血清。
兔抗人CIDE-3蛋白血清的鉴定采用Western blot及免疫酶联吸咐实验(ELISA)法抗原人CIDE-3蛋白经包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲液)稀释至终浓度为8μg/ml，4℃包被酶标板过夜；洗涤缓冲液(pH 7.4、0.15M PBS)洗涤，分别加滴度1∶1000-1∶1024000的兔抗人CIDE-3蛋白血清0.1ml，同时用正常兔血清做对照，37℃孵育1h；洗涤后加1∶2500的HRP标记羊抗兔IgG(购自北京中杉金桥公司)0.1ml，37℃孵育0.5h，洗涤后TMB显色，2M硫酸终止反应；ELISA读数仪测波长450nm处测吸光度。结果显示抗体效价约为1∶512000。Western blot结果显示兔抗人CIDE-3蛋白血清与CIDE-3蛋白特异性结合，不与菌体其他成分结合。
CIDE-3蛋白在组织中的定位根据文献报道，人CIDE-3蛋白在人的胃组织中阳性表达。因此申请人选取了3例正常胃组织进行了免疫组织化学法。组织切片脱蜡至水，3％双氧水室温封闭0.5h；PBS洗涤，羊血清室温封闭0.5h；加不同稀释的兔抗人CIDE-3蛋白血清，4℃过夜，同时设立用PBS替代一抗的空白对照实验及用鼠抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体(购自Dako公司)替代一抗的无关对照实验；37℃复温1h后，PBS洗涤，加即用型HRP标记的羊抗兔IgG，室温0.5h；DAB显色后，常规脱水、透明及中性树脂封片。结果显示部分胃黏膜上皮细胞CIDE-3蛋白免疫反应阳性，阳性物质为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质中，空白及无关对照实验为阴性。抗体最佳稀释度为1∶3000。
本发明的兔抗人CIDE-3多克隆抗体具有以下优点(1)敏感性高，ELISA结果显示抗体效价约为1∶512000，石蜡切片最佳效价为1∶3000；(2)特异性强，Western blot结果显示兔抗人CIDE-3蛋白血清与CIDE-3蛋白特异性结合，不与菌体其他成分结合。石蜡切片染色显示CIDE-3特异性定位于胃粘膜上皮细胞，而间质组织染色阴性。
兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体的基因序列及氨基酸序列1atggaatacgccatgaagtcccttagccttctgtaccccaagtccctctccaggcatgtgM E Y A M K S L S L L Y P K S L S R H V60 tcagtgcgtacctctgtggtgacccagcagctgctgtcggagcccagccccaaggcccccS V R T S V V T Q Q L L S E P S P K A P120 agggcccggccctgccgcgtaagcacggcggatcgaagcgtgaggaagggcatcatggctR A R P C R V S T A D R S V R K G I M A180 tacagtcttgaggacctcctcctcaaggtccgggacactctgatgctggcagacaagcccY S L E D L L L K V R D T L M L A D K P240 ttcttcctggtgctggaggaagatggcacaactgtagagacagaagagtacttccaagccF F L V L E E D G T T V E T E E Y F Q A300 ctggcaggggatacagtgttcatggtcctccagaaggggcagaaatggcagcccccatcaL A G D T V F M V L Q K G Q K W Q P P S360 gaacaggggacaaggcacccactgtccctctcccataagcctgccaagaagattgatgtgE Q G T R H P L S L S H K P A K K I D V420 gcccgtgtaacgtttgatctgtacaagctgaacccacaggacttcattggctgcctgaacA R V T F D L Y K L N P Q D F I G C L N480 gtgaaggcgactttttatgatacatactccctttcctagV K A T F Y D T Y S L S * 。
权利要求
1.一种兔抗人CIDE-3多克隆抗体，其特征在于，该抗体的基因及氨基酸序列如下1 atggaatacgccatgaagtcccttagccttctgtaccccaagtccctctccaggcatgtgM E Y A M K S L S L L Y P K S L S R H V60 tcagtgcgtacctctgtggtgacccagcagctgctgtcggagcccagccccaaggcccccS V R T S V V T Q Q L L S E P S P K A P120 agggcccggccctgccgcgtaagcacggcggatcgaagcgtgaggaagggcatcatggctR A R P C R V S T A D R S V R K G I M A180 tacagtcttgaggacctcctcctcaaggtccgggacactctgatgctggcagacaagcccY S L E D L L L K V R D T L M L A D K P240 ttcttcctggtgctggaggaagatggcacaactgtagagacagaagagtacttccaagccF F L V L E E D G T T V E T E E Y F Q A300 ctggcaggggatacagtgttcatggtcctccagaaggggcagaaatggcagcccccatcaL A G D T V F M V L Q K G Q K W Q P P S360 gaacaggggacaaggcacccactgtccctctcccataagcctgccaagaagattgatgtgE Q G T R H P L S L S H K P A K K I D V420 gcccgtgtaacgtttgatctgtacaagctgaacccacaggacttcattggctgcctgaacA R V T F D L Y K L N P Q D F I G C L N480 gtgaaggcgactttttatgatacatactccctttcctagV K A T F Y D T Y S L S *。
全文摘要
本发明公开了一种人CIDE－3蛋白兔抗多克隆抗体，本发明通过分子克隆技术，得到重组的人CIDE－3蛋白N端172个氨基酸，以此为抗原免疫新西兰白兔，获得了高效价的免疫兔血清。经针对CIDE－3蛋白的综合性能指标测试，该抗体在免疫组织化学、酶联免疫吸附和免疫印记实验中性能稳定，敏感性高，特异性强，故可用于CIDE－3功能的分子生物学及组织学实验研究。
文档编号C07K16/18GK1821404SQ200610041899
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者李青, 姚丽 申请人:中国人民解放军第四军医大学