一步法构建阳离子化载体蛋白与黄曲霉毒素B₁的偶联物的制作方法

专利名称：一步法构建阳离子化载体蛋白与黄曲霉毒素B₁的偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及阳离子载体蛋白的制备及黄曲霉毒素B广阳离子蛋白偶联物的一步法构建。将 构建的偶联物作为免疫原免疫动物，可提高机体的免疫应答水平，制备高质量的抗黄曲霉毒 素B!抗体。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是一类主要由寄生曲霉(^perg/〃^; aras衍a^)和产毒的 黄曲霉(A/7"w^)所产生的有毒次生代谢产物，其中以黄曲霉毒素B！ (aflatoxinB!, AFB,) 的危害最大，是目前已知的毒性最大的致癌物之一。国际癌症研究机构已将其列为I级致癌 物。由于AFB,污染食品的途径很多，因此要完全杜绝AFB!的污染是不可能的，完善监督措 施和采用科学检测方法可以在最大程度上减少AFB!对人类健康的危害。目前AFBi的检测方 法主要有基于理化和免疫的分析方法，前者包括薄层层析法、高效液相色谱、质谱和毛细管 电泳等，薄层层析法作为我国目前检测AFB,国标方法，虽然操作简便，成本低廉，但由于 是半定量方法，灵敏度低，已经难以满足低检测限的需要；而其他仪器分析方法虽然灵敏度 高、重现性好，但同时存在着耗时、检测仪器昂贵、操作复杂等缺点，不能满足现场快速检 测的需求；而酶联免疫吸附反应、免疫微柱以及免疫芯片等免疫学检测方法由于节省时间、 成本低、操作简便，适合批量检测和现场检测，正逐步受到我国各质检相关部门的重视。
AFB,作为半抗原，需将其与载体蛋白偶联后，才能具备刺激动物产生抗体的免疫原性。 但由于完全抗原制备过程复杂，AFBi利用率低，因此常常需要使用较大量的AFB!才能制备 得到相应的抗体；然而，"9.11"事件后，AFB,作为一种剧毒的生物试剂被美国等发达国家严 格控制。市场上该毒素标准品不仅价格高而且难以买到，这给研究AFB,的免疫学检测方法 带来很大困难，也在一定程度上阻碍了免疫学方法的应用和推广。
早期研究认为AFB，本身性质不活泼，不具备与载体蛋白连接的活性基团，需将其衍生 后，再与载体蛋白偶联，即先将AFB!转化为AFB广羧基活化物(AFBrOxime,AFB,-O)，然 后，在碳化二亚胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide， EDC)等偶联剂的催化 下，与载体蛋白发生縮合反应，形成稳定的AFB广O-载体蛋白偶联物。其中，第一步AFB, 的转化率为70%~80%， AFB广O的纯化得率为80%~90%，而第二步，仅有30%~40%的 AFB!-O偶联到载体蛋白上。因此，AFB,的总利用率在20。/。左右，利用率较低。综合上述原因，研究提高AFB!利用率的偶联物制备方法是非常必要的。
本发明利用了阳离子载体蛋白胺甲基化原理构建了 AFBr阳离子载体蛋白的偶联物。在 AFB,的结构中，由于其幾基的a-活泼氢在弱酸条件下，以烯醇式存在，可通过甲醛的偶联作 用，与载体蛋白的胺乙基发生胺甲基化偶联。由于阳离子载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基 取代，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白的偶联物，阳离子载 体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的 免疫应答，同时，也提高r机体对共价偶联在阳离子载体蛋白半抗原(AFB!)的识别和应答 水平，即可刺激抗原提呈细胞对半抗原决定簇的提呈、促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。
本发明中AFB!的总利用率在50%左右。实验证明，通过该法制备的偶联物具有较好的 免疫原性，能够刺激机体产生高质量的AFB,抗体。因此，本发明相对于传统合成方法，有 操作步骤少、毒素利用率高、抗体效价高等优点。
本专利发明者针对两歩法存在的诸多问题，发明了用阳离子载体蛋白一步构建黄曲霉毒 素Br载体蛋白偶联物的方法。相关研究国内外尚未见报道。
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发明内容
(一) 要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种一步构建AFBr载体蛋白偶联物的方法。
(二) 技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是
烯醇或者含a-活泼氢的羰基化合物，在偶联剂甲醛的作用下，能与伯胺或仲胺进行偶联。 根据该原理，AFBi上羰基的a-活泼氢就能够在甲醛的偶联作用下与含有胺乙基的阳离子 蛋白反应，得到AFBr阳离子蛋白的偶联物。阳离子化蛋白相对于简单蛋白而言，具有较多 的胺乙基，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白的偶联物，阳离 子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体 内的免疫应答。 具体步骤
1.阳离子蛋白的制备 .
载体蛋白包括牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin, OVA)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)、血孔匙蛋白(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)和多聚赖氨酸(Ploy-l-lysine， PLL)。
制备步骤
(1) 将乙二胺(ethylenediamine， EDA)加入到冰浴中的2-乙烷磺酸基(2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid， MES)缓冲液中，并用HC1调节pH至弱酸性；
(2) 将载体蛋白溶于MES后，与上述EDA溶液混匀；
(3) 滴加偶联剂EDC于(2)所述溶液中，室温反应后，用醋酸终止反应；
(4) 将上述反应物用去离子水充分透析；
(5) 将其冻干后，冻干备用。所用EDA体积在20iiL 100nL之间，所用的载体蛋白质量在5mg 100mg之间，EDA与 MES的体积比在1:25 1:5之间，MES缓冲液的pH调节到4 6。
制备得到阳离子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin, cBSA)、阳离子卵清
白蛋白(Cationized ovalbumin, cOVA)、阳离子辣根过氧化物酶(Cationized horseradish
peroxidase, cHRP)、阳离子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin, cKLH)或阳
离子多聚赖氨酸(Cationizedploy-l-lysine， cPLL)。 2. AFB!-阳离子载体蛋白偶联物的制备
AFB,-阳离子载体蛋白偶联物包括AFB广cBSA、 AFB,-cOVA、 AFB广cHRP、 AFB广cKLH 和AFB!-cPLL。 制备步骤
(1) 将阳离子载体蛋白和AFB!分别用去离子水和二甲基甲酰胺溶解后，将AFB,溶液 逐滴加入到载体蛋白液中混匀；
(2) 在上述反应液中加入偶联剂甲醛，反应后即得到AFB,-阳离子载体蛋白偶联物；
(3) 用去离子水充分透析后，冻干备用。
其中，阳离子载体蛋白与AFBi的质量比例在1:1 5:1之间，二甲基甲酰胺和甲醛的体积 比在1:1 5:1之间。 (三)有益效果
本发明以AFB,为半抗原，利用阳离子蛋白一步法合成AFBi —载体蛋白偶联物，该法具 有步骤简单、AFB利用率高等优点，避免了目前所用两歩法步骤多、利用率低等缺点。


下面结合附图和实施例对本发明专利进一步说明。
图1 AFBi的结构
图2载体蛋白的阳离子化
图3 AFBi与阳离子载体蛋白的偶联机理
① AFB!在弱酸性缓冲液中的烯醇化；
② 阳离子载体蛋白中亚胺离子的形成；
③ 阳离子载体蛋白中的亚胺离子在甲醛作用下，与烯醇化AFB,偶联
具体实施例方式
实施例1 AFB,-cBSA偶联物的制备 l.lcBSA的制备
将5(M00nLEDA加入到500 pL冰浴MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgBSA溶解于50pL的MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混 合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透 析48 72h，冻干备用。
1.2 AFB!-cBSA偶联物的制备
将5~100mg的cBSA与2mg AFBi分别用500~10000pL去离子水和50~1000nL 二甲基甲 酰胺溶解后，再将上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 50~1000]iiL甲醛，37'C下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例2 AFBrcOVA偶联物的的制备
2.1 cOVA的制备
将50~100|aL EDA加入到500 冰浴MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgOVA溶解于10(^L的上述缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混 合液中添加2 50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透 析48 72h，冻干备用。
2.2 AFBi-cOVA偶联物的制备
将5~100mg的cOVA与l~50mg AFBt分别用500~10000pL去离子水和50 1000& 二甲 基甲酰胺溶解后，再将上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 5(M00(HiL甲醛，37。C下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例3 AFBrcHRP偶联物的制备
3.1 cHRP的制备
将50~100pL EDA加入到冰浴的500 MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgHRP溶解于500pL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上 述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充 分透析48 72h，冻干备用。
93.2 AFBrcHRP偶联物的制备
将5~100mg的cHRP与l~50mg AFB!分别用500~10000nL去离子水和50~1000& 二甲 基甲酰胺溶解后，再将上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀后，迅速加入 50 1000pL甲醛，37'C下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例4 AFBrcKLH偶联物的制备
4.1 cKLH的制备
将50~100|aL EDA加入到冰浴的500 MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5~100mg KLH溶解于800pL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在 上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水 充分透析48 72h，冻干备用。
4.2 AFBrcKLH偶联物的制备
将5~100mg的cKLH与l~50mg AFB!分别用500 10000nL去离子水和50~1000|iL 二甲 基甲酰胺溶解后，再将上述AFBi溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 50 100(^L甲醛，37'C下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例5 AFB广cPLL偶联物的制备
5.1cPLL的制备
将50 10(HiLEDA加入到冰浴的500 ^LMES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右， 再将5 100mgPLL溶解于1000pL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在 上述混合液中添加2 50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水 充分透析48 72h，冻干备用。
5.2 AFB广cPLL偶联物的制备
将5 100mg的cPLL与l~50mg AFBi分别用500~10000hL去离子水和50~1000nL 二甲基 甲酰胺溶解后，再将上述AFB!溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入 50-1000^iL甲醛，37'C下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
上述所用MES缓冲液浓度均为O.lmol/L， HC1均为lmol/L，醋酸均为4mol/L。
AFBr阳离子蛋白偶联物的鉴定
采用紫外分光光度计对阳离子载体蛋白、AFB,标品及偶联物进行扫描，根据其特征吸收 峰来确定偶联是否成功。结果显示，AFBi-阳离子载体蛋白偶联物在270nm和366nm有两个主要的吸收峰，前一 个吸收峰是载体蛋白(280nm)和AFB! (266nm)的叠加峰，而后者是AFB!的另一特征吸 收峰G63nm)。根据偶联比公式，结合紫外图谱上吸收峰波长及吸光度，可以计算出AFB, 与阳离子蛋白的偶联比。
-366, -366wm
A工、 二 _^ ^
M载体蛋白 (^偶联物'278wm — j偶联物■ 366"m X f XFSi ■ 278"m / 6^FSi . 366"m)/6"载体蛋白■ 278mw
其中偶联物中AFBi的摩尔质量；
M载体蛋A:偶联物中载体蛋白的摩尔质量；
j偶联物.27S :偶联物在278nrn处的吸光度； ^偶联物.366 :偶联物在366nrn处的吸光度；
. 278 : AFB!在278nm处的摩尔吸光系数； ^4ral366 m : AFBi在366nm处的摩尔吸光系数； f载体蛋s.278腦载体蛋白在278nm处的摩尔吸光系数 经过计算，AFBi与阳离子蛋白的偶联比在6.1左右，证明了成功制备AFBr阳离子蛋白 偶联物。
权利要求
1.阳离子蛋白，其特征在于结构式其中，载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基取代，整个蛋白带正电，因而作为完全抗原免疫动物时，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的免疫应答。
2. AFBr阳离子蛋白偶联物，其特征在于它的分子结构式为其中，载体蛋白可以是阳离子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin ， cBSA)、阳离子卵清白蛋白(Cationized ovalbumin, cOVA)、阳离子辣根过氧化物酶(Cationizedhorseradish peroxidase, cHRP)、阳离子血孑L匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin，cKLH)或阳离子多聚赖氨酸(Cationized ploy-L-lysine， cPLL)，分别与AFB,结合得到AFB,-cBSA、 AFB广cOVA、 AFB广cHRP、 AFB广cKLH和AFB广cPLL。
3.制备权利要求l所述一种阳离子载体蛋白的方法，其特征在于包括步骤(1) 制备CBSA，步骤如下将20 100(xL乙二胺(ethylenediamine， EDA)加入到冰浴的500nL O.lmol/L 2-乙烷 磺酸(2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid, MES)缓冲液中，并用lmol/L HC1将pH调 节到4~6，然后，将5 100mg BSA溶解在50nL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶 液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的碳化亚二胺(l-Ethyl-3-[3-dimethylamin叩ropyl] carbodiimide, EDC)，室温搅拌l 12h，用4mol/L的醋酸终止反应，用去离子水充分透 析48 72h后，将其冻藏备用。(2) 制备cOVA，步骤如下将20 100|aL EDA加入到冰浴的500nL O.lmol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4 6，然后，将5 100mgOVA溶解在10(^L的上述MES缓冲液后，与上述 EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l~12h，用4mol/L的 醋酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，将其冻藏备用。(3) 制备cHRP，步骤如下将20 100pL EDA加入到冰浴的500pL O.lmol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4 6，然后，将5 100mgHRP溶解在50(^L的上述MES缓冲液后，与上述 EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l~12h，用4mol/L的 醋酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，冻藏备用。(4) 制备cKLH，步骤如下将20 100nL EDA加入到冰浴的500pL O.lmol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4~6，再将5~100mg KLH溶解于800pL的上述MES缓冲液后，与上述EDA 溶液混匀，再在上述混合液中添加2 50mg的EDC，室温搅拌l 12h后，用4mol/L的醋 酸终止反应，用去离子水充分透析48 72h后，冻藏备用。(5) 制备cPLL，步骤如下将20 100nL EDA加入到冰浴的500 pL O.lmol/L MES缓冲液中，并用lmol/L HC1 将pH调节到4-6，再将5 100mg PLL溶解于lOOOpL的上述MES缓冲液，然后，与上 述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2~50mg的EDC，室温搅拌l~12h后，用4mol/L 的醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48 72h，冻藏备用。所用EDA体积在20pL 100pL之间，所用的载体蛋白质量在5mg 100mg之间，EDA 与MES的体积比在1:25 1:5之间，MES缓冲液的pH调节到4~6。
4. 如权利要求2所述一种AFBr阳离子载体蛋白偶联物的制备方法，其特征在于AFB, 上羰基的a-活泼氢能够在甲醛的偶联作用下与阳离子蛋白的胺乙基反应，得到AFB,-阳离 子载体蛋白的偶联物，能够制备包括免疫抗原、包被抗原和酶标记物在内的AFB,-阳离 子蛋白偶联物，得到AFBi完全抗原。
5. 如权利要求2所述一种AFBr阳离子载体蛋白偶联物的制备方法，其特征是偶联剂甲 醛。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括步骤(1) AFB广cBSA的制备，步骤如f:将5~100mg cBSA与l~50mg AFB!分别用 500~1000(VL去离子水和50~1000pL 二甲基甲酰胺溶解，再将AFB!溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50 1000nL甲醛，37。C下轻摇24h，充分反应后即得 到AFBrcBSA，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(2) AFB广cOVA的制备，步骤如下将5~100mg的cOVA与l~50mg AFB!分别用 500~10000^iL去离子水和50~1000pL 二甲基甲酰胺溶解，再将AFB,溶液逐滴加入到上述 蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50~1000pL甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应后即得 到AFB广cOVA，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(3) AFBl-cHRP的制备，步骤如下将5~100mg的cHRP与l~50mg AFB,分别用 500~10000^iL去离子水和500|iL 二甲基甲酰胺溶解，再将AFB!溶液逐滴加入到上述蛋白 质溶液中，混匀后，迅速加入50 1000nL甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应后即得到 AFBrcHRP，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(4) AFB广cKLH的制备，步骤如下将5~100mg的cKLH与l~50mg AFB!分别用 500~10000^iL去离子水和50~100(VL 二甲基甲酰胺溶解，再将AFB,溶液逐滴加入到上述 蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50 100(VL甲醛，37'C下轻摇24h，充分反应后即得 到AFB!-cKLH，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。(5) AFB广cPLL的制备，步骤如下将5 100mg的cPLL与l~50mg AFB,分别用 500~10000pL去离子水和50 1000nL 二甲基甲酰胺溶解，再将上述AFB,溶液逐滴加入到 上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50~1000nL甲醛，37。C下轻摇24h，充分反应后 即得到AFBi-cPLL，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。其中，阳离子载体蛋白与AFBi的质量比例在l:l 5:l之间，二甲基甲酰胺和甲醛的体 积比在1:1 5:1之间。
全文摘要
本发明根据胺甲基化反应反应原理，利用黄曲霉毒素B₁结构中羰基碳的α-活泼氢，以甲醛为偶联剂，与阳离子蛋白中的胺乙基发生缩合反应，一步法构建黄曲霉毒素B₁-阳离子载体蛋白偶联物。该法较之目前采用先将黄曲霉毒素B₁衍生转化为羧基活化物后，再与载体蛋白缩合偶联的两步法，具有步骤少、操作简单、利用率高的优点。
文档编号C07K1/10GK101293912SQ20071005193
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者伟 余, 吴佳佳, 周有祥, 莺 徐, 陈福生 申请人:陈福生