一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法
【专利摘要】本发明公开了一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，使用草莓茎尖生长点来做草莓转基因，可直接从田间取材操作，操作过程简单，没有材料的时间限制，不受外界环境影响，随时可以取样；茎尖生长点具有很强的脱分化和再分化的能力，生长点通过长成愈伤组织，再分化芽的过程来长成完整植株，由于生长点的分化能力极强，因此，愈伤组织生长和分化芽的过程都会极大地缩短，一般比叶片叶柄或者茎段分化芽的过程时间都要缩短一半，解决草莓转化效率低的问题，缩短转基因周期，减小转基因工作量和工作强度；此外，生长点分化芽的能力非常强，通常情况下分化芽的能力在100%，即使经过菌液侵染以后，分化能力也能够达到50%以上，这是明显高于叶片、叶柄等其他外植体的。
【专利说明】
一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种使用草莓茎尖生长点的转基因方 法。
【背景技术】
[0002] 目前常用的草莓基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌 介导的叶盘法是草莓遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中最为成熟最常 用的一种转基因方法。虽然草莓的遗传转化技术路线成熟，但转化效率很低，获得的转基因 植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带来了障碍。即使是非常成熟的草莓叶片转化方 法，从叶片转化后到转基因植株筛选出来，获得一株完整的转基因草莓植株也需要10个月 到一年时间，如果要在田间开花结果至少需要两年时间，周期比较长。因此，无论如何优化 转化体系，使用叶片或者叶柄外植体来做草莓转基因，都无法解决周期长的问题。因此如何 寻找一个周期短且转化效率高的方法，是目前在草莓转基因中亟待解决的一个问题。转基 因中耗时最长的是叶片侵染之后的再生时间，也就是说在叶片上再生得到再生芽的这个过 程是比较长的，而且一般情况下，叶片经过侵染之后再生芽的几率就会降低，一般再生芽几 率最高30 %，而在这30%中，也只有不到5%的再生芽有可能是转基因的，故获得转基因植 株的效率更低。
[0003] 而茎尖用来无性繁殖植株或者组培苗，是常用的方法，之所以长期以来不被用于 转基因中，有以下原因：1、操作技术不成熟，茎尖生长点切取的大小操作不慎很容易会使生 长点致死;如果切取的生长点过大，菌液不容易侵染进入伤口，造成转基因失败。2、在以往 的做基因过程中，采用的基本原理都是外植体再生的原理，也就是首先用菌液侵染叶片或 者茎段的伤口，再从叶片或者茎段的伤口处生长愈伤组织，最后从愈伤组织分化出芽。而之 所以都不采用茎尖来做转基因，是因为传统都认为，茎尖本来就是一个完整的个体，不具备 分化新植株的能力。
[0004] 在草莓的转基因中，目前还有一个问题无法解决，就是不同品种之间的差异，由于 不同品种的基因型不同，遗传背景的不同，造成不同品种的转基因效率相差很大。即便目前 草莓转基因技术比较成熟，因为基因型的差异，传统的叶片农杆菌介导法也不能够将所有 品种都转化成功。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种转化效率高且 没有品种转化差异的使用草莓茎尖生长点的转基因方法。
[0006] 技术方案:本发明所述的一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，包括以下步骤：
[0007] (1)在田间取3~5cm长度的草莓茎尖，洗干净茎尖表面，用75%的酒精消毒30秒， 无菌水冲洗3次后，用质量分数0.1 %的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6 ~8次，冲洗完成后剥去茎尖外边的包叶，在解剖镜下将大小为0.2mm的茎尖生长点切下，倒 入茎尖预培养液体培养基S1中的滤纸上，预培养1~2小时；
[0008] (2)预培养结束以后，将培养基S1中的滤纸取出，放置于茎尖愈伤组织分化培养基 S2中，培养5天，生长点周围开始有部分愈伤组织生长；
[0009] (3)将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中取出滤纸，直接放置于菌液 侵染中，侵染10分钟，过程中每隔轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的接触面积，侵染 完成后将滤纸拿出放置于茎尖愈伤组织共培养培养基S3上共培养3天；
[0010] (4)共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于茎尖愈 伤组织筛选培养培养基S4上，生长25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移 至茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5上，20天可长出芽，芽长出后在体式荧光显微镜下进行 观察，可以明显看出一部分芽有非常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，保留，而一部分 没有发光，这部分芽为非抗性芽，去除，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性 愈伤经过约40天的培养以后，分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微 镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；
[0011] (5)生根培养:抗性植株长到大约2~3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培 养基S6上生根，获得完整的抗性苗，再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片、叶柄 以及根都发亮绿光的确定为转基因植株。
[0012] 进一步，所述茎尖预培养液体培养基S1中包括MS4.4g/L、蔗糖15g/L，pH值为5.8， 高压灭菌。
[0013] 进一步，所述茎尖愈伤组织分化培养基S2中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/ L、6_BA lmg/L，pH值为5.8,高压灭菌，冷却至60°C。
[0014]进一步，所述茎尖愈伤组织共培养培养基S3中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂 5.5g/L、TDZ lmg/L、IBA 0.2mg/L，pH值为5.8,高压灭菌，冷却至60°C。
[0015]进一步，所述茎尖愈伤组织筛选培养培养基S4中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂 5 · 5g/L、TDZ lmg/L、IBA 0 · 2mg/L，pH值为5 · 8，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、 羧苄青霉素300mg/L。
[0016] 进一步，所述茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂 5 · 5g/L、6_BA2mg/L、IBA 0 · 2mg/L，pH值为5 · 8，高压灭菌，冷却至60°C 加入卡那霉素20mg/L、 羧苄青霉素300mg/L。
[0017] 进一步，所述生根筛选培养基中包括MS2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L、 ΙΒΑ0 · lmg/L，pH值为5 · 8，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300mg/L。
[0018] 进一步，步骤(3)中菌液的活化步骤包括：
[0019] ①将含质粒PK7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的LB固 体培养基上划线，28 °C培养2天；
[0020] ②挑取长好的单菌落2~3个，接种到含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的50mLLB 液体培养基中，28°C，220rpm在摇床中振荡培养12~16h至0D600值0.4;
[0021]③常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上 清液去除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养1小时测定0D600值为0.2~0.3，0.2 为最佳。
[0022]有益效果：1、本发明打破传统的草莓转基因必须培育组培苗的取材方式，使用草 莓茎尖生长点来做草莓转基因，仅取茎尖生长点的一部分，通过切割，茎尖生长点上面会产 生伤口，也能够通过伤口长愈伤组织，进一步从愈伤组织诱导出芽，因此，茎尖生长点具备 更强的分化能力，能够更容易的诱导产生新的植株，缩短转基因的时间；且可直接从田间取 材操作，操作过程简单，没有材料的时间限制，不受外界环境影响，随时可以取样；
[0023] 2、茎尖生长点具有很强的脱分化和再分化的能力，生长点通过长成愈伤组织，再 分化芽的过程来长成完整植株，由于生长点的分化能力极强，因此，愈伤组织生长和分化芽 的过程都会极大地缩短，一般比叶片叶柄或者茎段分化芽的过程时间都要缩短一半，解决 草莓转化效率低的问题，缩短转基因周期，减小转基因工作量和工作强度;此外，生长点分 化芽的能力非常强，通常情况下分化芽的能力在100%，即使经过菌液侵染以后，分化能力 也能够达到50%以上，这是明显高于叶片、叶柄等其他外植体的；
[0024] 3、茎尖生长点无论在什么品种中，活力都是一样的，因此使用茎尖生长点作为转 基因的外植体，可解决转基因中品种的限制，打破叶片农杆菌介导法在不同品种之间不能 够通用的问题，解决了不同草莓品种基因型差异造成的转化效率差异问题；
[0025] 4、由于所取的茎尖生长点非常小，大小在0.2mm左右，一般情况下，茎尖的生长点 是不携带植物病毒的，并且所取的部位越小，越不容易携带病毒，因此在转基因的同时，能 够脱去植物病毒，获得无病毒的转基因植株。
【具体实施方式】
[0026] 下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施 例。
[0027]实施例:首先，配制操作过程中所需的培养基：
[0028]草莓茎尖预培养液体培养基(S1): MS4 · 4g/L、蔗糖15g/L，pH5 · 8，高压灭菌，分装至 无囷培养皿中备用。
[0029] 草莓茎尖愈伤组织分化培养基(S2):MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、6-BAlmg/ L，pH5.8，高压灭菌，冷却至60 °C分装至无菌培养皿中备用。
[0030]草莓茎尖愈伤组织共培养培养基（S3):MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、 TDZlmg/L、IBA 0 · 2mg/L，pH5 · 8，高压灭菌，冷却至60°C分装至无菌培养皿中备用。
[0031] 草莓茎尖愈伤组织筛选培养培养基1 (S4): MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、TDZ lmg/L、IBA 0.211^/1^，？!15.8，高压灭菌，冷却至60°(：加入卡那霉素2〇11^/1^、羧苄青霉素 300mg/L分装至无菌培养皿中备用。
[0032]草莓茎尖愈伤组织筛选培养培养基2(S5):MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.58/1、6-BA2mg/L、IBA 0 · 2mg/L，pH5 · 8，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、羧节青霉素 300mg/L分装至无菌培养皿中备用。
[0033]草莓生根筛选培养基（S6) :MS2 · 2g/L、蔗糖30g/L、琼脂5 · 5g/L、IBA 0 · lmg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300mg/L分装培养瓶备用。 [0034]其次，进行菌液中菌种的活化：
[0035] ①将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在LB固体培养基上（含50mg/L SPR(壮观霉素） 和50mg/L Rif(利福平））划线，28°C培养2天。
[0036]②挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50mL LB液体培养基中（含50mg/L SPR(壮观霉素）和50mg/L Rif(利福平）），28°(：，220印111在摇床中振荡培养至00600值0.4(约 12-16h)〇
[0037]③常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上 清液去除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定0D600值为0.2为最 佳(这个值很重要，不能低于0.2,不能高于0.3,控制在0.2~0.3之间，要接近0.2)。活化好 的菌液可以用来做下一步植物材料侵染。
[0038]以草莓品种'红颜''哈尼''甜查理'为例，通过以下操作获得'红颜'转基因植株， 具体操作过程如下：
[0039] (1)在田间取草莓'红颜''哈尼''甜查理' 3-5cm长度的匍匐茎茎尖，在实验室用洗 洁精洗干净茎尖表面，在超净工作台上，用75%的酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次后，用 〇. 1 %的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6-8次。冲洗完成后剥去茎尖外 边的包叶，在解剖镜下将大小为0.2mm的茎尖生长点用手术刀片切下，放置于茎尖预培养液 体培养基S1中，预培养1-2小时。由于生长点非常小，因此剥离以后如果用镊子来回转移，会 伤到生长点，导致生长点死亡，故将S1培养基倒入无菌的培养皿中，在培养皿中放一张无菌 的滤纸，将剥离的生长点都放在滤纸上面。
[0040] (2)预培养结束以后，将放置于S1培养基中的滤纸直接拿出，放置于S2培养基上， 培养5天左右，生长点周围会开始有部分愈伤组织开始生长。
[0041] (3)农杆菌侵染:将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中拿出滤纸，直 接放置于菌液中，侵染10分钟，过程中每隔2分钟轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的 接触面积。侵染完成后将滤纸拿出放置于培养基S3上共培养3天。
[0042] (4)共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于培养基 S4上，生长大约25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移至培养基S5上，大约 20天左右可长出芽。芽长出后在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分芽有非 常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分芽为非抗性 芽，去除掉，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性愈伤经过约40d左右的培养 以后，可分化出抗性植株。此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植 株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉。
[0043] (5)生根培养:抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培 养基S6上生根。获得完整的抗性苗。此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需 要再进行一次荧光检测。荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为 转基因植株。
[0044]至此，分别获得草莓'红颜''哈尼''甜查理'三个品种的完整转基因植株，与叶片 转化相比，使用茎尖生长点，转化效率明显升高，转化周期明显缩短。具体数据见下表：
【主权项】
1. 一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 在田间取3~5cm长度的草莓茎尖，洗干净茎尖表面，用75%的酒精消毒30秒，无菌水 冲洗3次后，用质量分数0.1%的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6~8次，冲 洗完成后剥去茎尖外边的包叶，在解剖镜下将大小为〇. 2_的茎尖生长点切下，倒入茎尖预 培养液体培养基S1中的滤纸上，预培养1~2小时； (2) 预培养结束以后，将培养基S1中的滤纸取出，放置于茎尖愈伤组织分化培养基S2 中，培养5天，生长点周围开始有部分愈伤组织生长； (3) 将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中取出滤纸，直接放置于菌液侵染 中，侵染10分钟，过程中每隔2分钟轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的接触面积，侵染 完成后将滤纸拿出放置于茎尖愈伤组织共培养培养基S3上共培养3天； (4) 共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于茎尖愈伤组 织筛选培养培养基S4上，生长25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移至茎 尖愈伤组织筛选培养培养基S5上，20天可长出芽，芽长出后在体式荧光显微镜下进行观 察，可以明显看出一部分芽有非常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，保留，而一部分没 有发光，这部分芽为非抗性芽，去除，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性愈 伤经过约40天的培养以后，分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微 镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉； (5) 生根培养:抗性植株长到大约2~3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基 S6上生根，获得完整的抗性苗，再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片、叶柄以及 根都发亮绿光的确定为转基因植株。2. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:所述茎尖预 培养液体培养基S1中包括MS4.4g/L、蔗糖15g/L，pH值为5.8，高压灭菌。3. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:所述茎尖愈 伤组织分化培养基S2中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5 g/L、6-BA lmg/L，pH值为 5.8,高压灭菌，冷却至60°C。4. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:所述茎尖愈 伤组织共培养培养基S3中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5 g/L、TDZ lmg/L、IBA 0.2 mg/L，pH值为5.8,高压灭菌，冷却至60°C。5. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:所述茎尖愈 伤组织筛选培养培养基S4中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5 g/L、TDZ lmg/L、IBA 0.2 mg/L，pH值为5·8，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300 mg/L。6. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:所述茎尖愈 伤组织筛选培养培养基S5中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5 g/L、6-BA2mg/L、IBA 0.2 mg/L，pH值为5·8，高压灭菌，冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300 mg/L。7. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于:所述生根筛 选培养基中包括MS2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5 g/L、IBA 0.1mg/L，pH值为5.8,高压灭菌， 冷却至60°C加入卡那霉素20mg/L、羧节青霉素300 mg/L。8. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于：步骤(3)中 菌液的活化步骤包括： ① 将含质粒PK7WG2D农杆菌EHA105在含有50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体 培养基上划线，28 °C培养2天； ② 挑取长好的单菌落2~3个，接种到含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的50 mL LB 液体培养基中，28 °C，220 rpm在摇床中振荡培养12~16h至0D600值0.4; ③ 常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液 去除，用lOOmLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养1小时测定0D600值为0.2~0.3，0.2为最 佳。
【文档编号】A01H4/00GK105969794SQ201610395014
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】王媛花, 颜志明, 蔡善亚, 冯英娜
【申请人】江苏农林职业技术学院