水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业和分子生物学技术领域，具体涉及水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用。
【背景技术】
[0002]全球近一半人口都以水稻为食。水稻，学名:0ryza sativa L.，是世界上最重要的粮食作物之一。现阶段，粮食短缺的危机日益严重，粮食作物产量尤其是水稻的产量迫切需要提高。水稻基因组计划已经完成，越来越多的重要农艺性状基因以及基因定位(数量性状位点)被科研工作者陆续鉴定出来。根据其研究进展，可以运用一系列分子生物学的知识应用于水稻育种方案，来提高水稻产量的方法。
[0003]水稻的分蘖和抽穗是决定其籽粒产量的重要性状。第一个被鉴定出来的控制水稻分蘖的基因是水稻的单蘖基因(MOCl)，在确定与水稻产量相关的重要基因方面取得了重大的进展，从而对阐明水稻产量相关性状的遗传基础得以实现。其中的一些重要基因是可以用于高产水稻的分子育种。
[0004]随着越来越多的证据表明，水稻产量受数量形状位点控制。水稻分蘖是一个重要的农艺学性状，会影响到水稻的产量，比如单株的分蘖数量决定穗数，有效分蘖数决定分蘖长成的穗数和每穗粒数的数量。之后发现的与分蘖数相关的基因还有:TADl、TE、LAX1、LAX2、0sTBl、0sMADS57、FCl、D3、D17、D10、D14、D27、DLT 等等，这些基因都通过直接或者间接来调节了水稻的穗分支。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用，即将含有0sRhoGAP2基因的表达载体转染到水稻中，然后培育水稻获得T2代过表达0sRhoGAP2基因的转基因水稻。
[0006]本发明为实现上述目的采用如下技术方案，水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用，其特征在于该水稻0sRhoGAP2基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本发明所述的水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用，其特征在于具体过程为:设计引物Pl: 5，-TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3，，含有PstI酶切位点和引物P2:5，-GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3，，含有Hindm酶切位点，通过PCR扩增为0sRhoGAP2基因cDNA编码区5’端和3’端分别添加PstI和Hindm酶切位点，连接到植物表达载体PCAMBIA1302的相应位点，再通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得T2代过表达0sRhoGAP2基因的转基因水稻。
[0008]本发明将水稻Rho蛋白调控因子编码基因0sRhoGAP2构建过表达植物载体，通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得T2代过表达0sRhoGAP2基因的转基因水稻，与对照相比，转基因水稻的分蘖数提高了32.35%-38.75%。
【附图说明】
[0009]图1为对照水稻和0sRhoGAP2基因过表达转基因水稻T2代不同株系分蘖数的统计学比较，其中WT为对照水稻日本晴，0E-0sRhoGAP2为转基因水稻；
图2为对照水稻和0sRhoGAP2基因过表达转基因水稻T2代不同株系有效分蘖数的统计学比较，其中WT为对照水稻日本晴，0E-0sRhoGAP2为转基因水稻；
图3为0sRhoGAP2植物过表达载体的构建，其中A为0sRhoGAP2的cDNA编码区扩增胶回收产物琼脂糖凝胶电泳，B为pMD18-T-0sRhoGAP2载体Hindm和PstI双酶切鉴定，图C为pCAMBIA1302-0sRhoGAP2-eGFP 表达载体 Hindm 和 PstI 双酶切鉴定；
图4为081^064?2过表达转基因水稻了2代的？0?检测，图中]\1:0嫩MakerCDL 2000)，1、野生型检测，2、阴性对照，3、阳性对照，4-13、过表达植株T2代的PCR产物，通过PCR检测可以筛选到阳性植株。条带正确且亮的代表阳性植株。
[0010]图5为0sRhoGAP2过表达转基因水稻T2代的表达量检测，通过表达量检测可以检测该基因在此植株中的表达水平，从图中我们可以得出转基因水稻中该基因的表达量都有了不同程度的提高，最少的有14倍，最多的有229倍。
【具体实施方式】
[0011]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0012]实施例1
1、水稻0sRhoGAP2基因过表达载体的构建
设计引物P1: (5 ’ -TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3 ’，含有Pst I酶切位点)和引物P2:(5 ’ -GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3 ’，含有Hindm酶切位点)，通过PCR扩增为0sRhoGAP2基因cDNA编码区5’端和3’端分别添加PstI和Hindm酶切位点，连接到植物表达载体pCAMBIA1302(购自CAMBIA公司)的相应位点。连接产物转化大肠杆菌DH5a，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，经酶切和PCR鉴定后，已经测序确认。
[0013]2、水稻的遗传转化、筛选和T2代转0sRhoGAP2基因水稻性状的分析
采用常规的水稻遗传转化方法，利用农杆菌浸染法将0sRhoGAP2基因过表达载体转化至水稻愈伤组织(将去颖壳的水稻种子点播在愈伤诱导培养基N6D2上。大约一周后，水稻种子能够长出愈伤。除去芽和根后，将愈伤置于新的的N6D2培养基上继续诱导，大约10天能够形成比较坚硬的愈伤组织，可用于农杆菌侵染。)利用潮霉素筛选阳性愈伤组织，进一步诱导培育再生阳性转基因植株，并进行分子鉴定。转基因水稻筛选至T2代时，对同一批次的对照水稻和T2代转基因水稻进行观察，测量分蘖数(如图2-3所示)，进行统计学分析，统计样本各20株，统计结果显示未转基因的对照水稻的平均分蘖数为13.90±2.77，转基因水稻的平均分蘖数为18.93 ±4.20，与对照相比，转基因水稻的分蘖数提高了32.35%_38.75%。
[0014]以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
[0015] SEQUENCE LISTING<110>河南师范大学
〈120〉水稻0sRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用 〈130〉 2015 〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211〉 1300
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
atggagggcg aggtgccggtgtcatcgccg ctgatgctgccggcggcgag gggaggagga 60
ggaggagggg tgtccgtcgtggagacggtg gcggcggcgctgcggaggtc gctgctgctg 120
tgcagcagcg tgcgcgccgcggaggacgaa ggggccgcgg cggcggcggc ggctgctgcg 180
gggatgcaga ttggccggcccaccgacgtg cggcacgtctcgcacgtcac cttcgaccgc 240
ttcgtggggt tcctcggcctccccgccgacctcgagcccg acgtgccccg ccccgcgcct 300
agcgccagtg tgagtgtatttggagtttca ccaacgtcca tgcaatgctc atacgataac 360
agaggaaaca gtgtgccaacaatactattg accatgcaaa agaagttata tcaacttggg 420
gggcttcagg ctgaaggaatcttcagaata aatgcagaca atagtcagga actacatgtc 480
agggagcaac taaacatgggtgttgttccg gatggtgttg acatgcactg tctgacgggc 540
ctcataaagg catggtttcgtgaacttcca agtggagtattggactcatt gactccagaa 600
caagtgatgc actgcaacactgaagaagaa tgcgctctccttgcgagtac tctacctcca 660
gtggaagcag cactacttgattgggccatcaatctgatgg cagatgttgt ggaacatgaa 720
aactacaata agatgaacgctcgcaacattgctatggtttttgcaccaaa catgactcag 780
atggccgatc ccttgactgctttgatacatgcagttcaag tgatgaattt tctcaagaca 840
cttatcttga agactgtgaagggacgggaa gaaacagcta tgccatcaag tgcattccca 900
tcaagctctg gttccccaagtgacaaagatgaacctcagg cattagagca tttggacaag 960
cccaccattt gttcaactcagcaaaataatgattttccaa tgattagtgg ggctactctt 1020
gatcacttcc tctttagagcagaaccattg cgtcataatg acgcacaagg tagtgctgga 1080
cgacccaaga aacgcgacaataaggaccatgacaacagca gcagggaatt ttctcccata 1140
gatagtgatt caagtagccaagccagcaattctgcaagca aattcagtaa tgacaatgtg 1200
gaaggtttat ttgacagatttaaatttcgg aaaggagtag ggaggctgtg cagacaccct 1260
gtttttcagt tgagtaggtccatgaaaaaa tcaggtgaag cgggacaagc ctgtgtatga 1300
【主权项】
1.水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用，其特征在于该水稻OsRhoGAP2基因序列如SEQ ID N0.1所示。2.根据权利要求1所述的水稻OsRhoGAP2基因在提高水稻有效分蘖中的应用，其特征在于具体过程为:设计引物Pl: 5，-TATCTGCAGATGGAGGGCGAGGTGCC-3，，含有PstI酶切位点和引物P2:5’-GCGAAGCTTTACACAGGCTTGTCCCGC-3’，含有Hindm酶切位点，通过PCR扩增为OsRhoGAP2基因cDNA编码区5’端和3’端分别添加PstI和Hindm酶切位点，连接到植物表达载体PCAMBIA1302的相应位点，再通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织获得T2代过表达OsRhoGAP2基因的转基因水稻。
【专利摘要】本发明公开了水稻<i>OsRhoGAP2</i>基因在提高水稻有效分蘖中的应用，将水稻Rho？GTP酶激活蛋白编码基因<i>OsRhoGAP2</i>构建过表达植物载体，通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，获得T2代过表达<i>OsRhoGAP2</i>基因的转基因水稻，与对照相比，转基因水稻的分蘖数提高了32.35%-38.75%。
【IPC分类】C12N15/29, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105462992
【申请号】CN201610002409
【发明人】梁卫红, 闫鑫甜, 李佳佳, 张静, 黄俊骏, 王高华, 杜京尧, 石佳, 葛慧雯
【申请人】河南师范大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月6日