专利名称：植物侧枝数目相关转录因子AtDOF4.2及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物侧枝数目相关转录因子AtD0F4. 2及其编码基因与应用。
背景技术：
植物侧枝发育在植物形态建成中具有十分重要的地位，是植物形成根、茎和花序形态结构的主要发育过程。作物的分枝是影响作物产量的重要农艺性状之一，玉米可以通过减少分枝数来达到增产的目的，水稻分蘖数的多少也将直接决定着其产量。植物地上部分的株型源于胚胎发育时期的莖顶端分生组织(shoot apical meristem, SAM)和胚后发育的侧生分生组织(axillary meristem,AM)。SAM产生植物的主轴,AM则分化产生腋芽并最 终发育形成侧枝，SAM和AM的的分生活动共同构筑了植物的整体模式。目前植物分枝方面研究主要集中在番茄、水稻和拟南芥等模式物种。对于侧枝的发生机制，存在两种比较流行的假说。一种认为侧枝的发育直接源于主茎的SAM细胞，这种现象主要是发现在番茄及马铃薯中；另一种则认为侧枝发育完全重新形成于叶腋处，而此种现象主要是发现在拟南芥中。两种模式是一个连续统一体的两个方面，而不是两种截然不同的机理。影响侧芽与侧枝发育的因素很多，概括起来主要包括环境条件、植物激素以及植物自身遗传性因素即基因调控三个方面。其中环境条件主要是指光周期的影响，而激素中，起主要作用的包括生长素、细胞分裂素和Strigolaetone,赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)以及乙烯对植物的侧枝发育也能起到一定的调节作用。植物通过调控基因的表达来控制体内激素的含量，从而达到对分枝发育的调控。越来越多的基因被证明参与调控了植物侧枝的发育，它们分别参与了叶腋分生组织的形成以及腋芽的形成和发育过程。影响侧枝发育的第一类基因是与类胡萝卜素切割相关的基因CCD家族，这个基因家族有多个进化分枝，包括ABA合成途径的限速酶NCEDS，降低顶端优势的DAD1，参与调控分枝的祖乂3/007，及能够在9，10或9"，10"双键位置处切割类胡萝卜素的MAX3/CXD7等。影响侧枝发育的第二类基因是GRAS基因家族，有西红柿的LS基因、拟南芥的LAS基因以及水稻的MOCl基因等。此3个基因是同源基因，功能相似，均可控制叶腋分生组织的形成。其缺失突变体导致侧枝发育的减少或丧失。影响侧枝发育的第三类基因是bHLH转录因子家族。已报道的基因有水稻的LAXdAXPANICAL)和SPA (SMALL PANICLE)基因，是水稻中主要的侧生分生组织的调节者。细胞色素P450家族是另一类影响侧枝发育的基因家族，已经发现了多个与侧枝发育相关的细胞色素P450家族基因，通过调节吲哚乙醛肟的量来调节游离IAA的水平。影响生长素浓度，调控植物顶端优势，从而调控分枝量。除了以上列出的基因外，还发现有一些其它基因如miR164/⑶C、AXR1、AXR2、AXR3、AXR6和BUDl等，它们通过参与不同的生理过程来达到调控侧枝的发育过程。
综上可得，越来越多的基因被证明参与到植物的侧枝发育中来，它们或者与叶腋分生组织的起始有关，或者与腋芽的生长发育有关。随着对植物基因组认识的进一步深入，以及更多的突变体被人们所发现，将有更多的基因会被证明与植物的侧枝发育相关，植物侧枝发育的影响因素及机制将会得到更清楚的阐释。Dof (DNA bi nding with one finger)蛋白是植物所特有的一个转录因子家族，由N端和C端以及一段短的核定位信号组成。研究表明，Dof基因参与了很多的生理过程。主要包括植物的光应答与氮吸收、防卫反应、种子发育、种子萌发以及脂肪酸代谢等方面。在玉米中，Dofl, Dof2可调节玉米的碳代谢过程。马铃薯的StDof基因调控气孔保卫细胞的发育。南瓜的Dof蛋白AOBP能够结合到抗坏血酸化酶基因启动子上，响应生长素的应答。此外，Dof基因常见的功能之一是调节单子叶植物胚乳发育和种子萌发，如，玉米PBF，大麦PBPF, SAD，水稻0sDof3都参与了赤霉素调节的胚乳发育。Dof蛋白还参与植物生长发育的其它方面。AtDof2. 4和AtDof5. 8启动子在维管束形成的早期的不同阶段起作用，水稻OsDof 12能调控开花时间，Shirycz等报道了 Dof转录因子参与硫代葡糖酸盐类(一些次生代谢产物)的生物合成，大豆中的GmDof4和GmDofll能调节脂肪酸代谢的过程。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物侧枝数目相关转录因子AtD0F4. 2及其编码基因。本发明提供的与植物侧枝数目相关的蛋白质，名称为AtD0F4. 2，是一种转录因子，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana cv Columbia-0, Col_0),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的侧枝数目相关的由(a)衍生的蛋白质。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由个194个氨基酸残基组成。为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
标签残基序列
Poly-Arg5-6(通常为 5 个) RRRRR
Poly-His2-10(通常为 6 个) HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
上述(b)中的取代和/或缺失和/或添加，可由自然变异或人工诱变弓I起。上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得至IJ。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白AtD0F4. 2的基因AtD0F4. 2也属于本发明的保护范围。所述基因可为如下⑴或⑵或(3)的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物的侧枝数目相关蛋白的DNA分子； (3)与⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物的侧枝数目相关蛋白的DNA分子。所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. I % SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS、0. 5M NaPOJP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC，0. I % SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,0. 5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. 1% SDS 中漂洗；还可为50°C，在7% SDS、0. 5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，0. I X SSC，0. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,0. 5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0. I XSSC,0. 1% SDS中漂洗；也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 I X SSC, 0. 1% SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由585个核苷酸组成，全部为AtD0F4. 2蛋白的编码序列，自5’端的第I至3位脱氧核糖核苷酸为起始密码子ATG，第583至585位脱氧核糖核苷酸为终止密码子TAA。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体是将所述基因插入pROK II载体的Bgl II和Kpn I识别位点间得到的重组载体。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pR0KII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)。如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因,和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为如下(I)或(II)(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对； (II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的表型如下I)-3)中任一一种或几种I)所述转基因植物的侧枝数目多于所述目的植物；2)所述转基因植物的株高低于所述目的植物；3)所述转基因植物的节间长度小于所述目的植物。所述节间长度为第一节间长度，所述第一节间长度为从基部(根部)起第一个节间距，即第一茎分枝与根的距离。所述基因通过所述重组载体导入所述目的植物中。所述侧枝为莲座叶分枝和/或莖分枝。所述目的植物为双子叶或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。所述茎分枝为二级茎分支，所述莲座叶分枝为二级莲座叶分枝。所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的株型得到改良。所述基因可先进行进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35 %,优选为多于45 %,更优选为多于50%，最优选多于约60% ；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是双子叶植物(如油菜、月季、蔷薇等)也可以是单子叶植物(如草坪草等)。所述目的植物优选为十字花科植物，如油菜等；或其它双子叶植物，或单子叶植物。所述目的植物还可为树，如杨树、合欢、槐树、冬青、黄杨等。所述双子叶植物具体可为油菜、蔷薇
坐寸o本发明的实验证明，本发明克隆了 AtD0F4. 2基因，之后构建了 AtD0F4. 2的植物表达载体，转化拟南芥，获得了转AtD0F4. 2基因的纯系，检测转基因纯系的表型，说明AtD0F4. 2基因的过量表达能够显著增加植株的侧枝数。本发明对于培育绿化植物品种,特别是培育用于绿化的花卉、林草等新品种具有重要价值。
图I为AtD0F4. 2的转录激活活性鉴定图2为AtD0F4. 2突变体dof4. 2的鉴定图3为pR0KII_AtD0F4. 2的结构示意4为RT-PCT检测AtD0F4. 2基因在转基因植株中的表达量图5为过表达AtD0F4. 2株对侧枝发育的影响
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。所有植物材料均生长于22°C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗)。pROKII 载体(双兀表达载体)记载在 D. C. Baulcombe, G. R. Saunders,M. ff. Bevan,M. A. Mayo and B. D. Harrison,Expression of biologically active viral satellite RNAfrom the nuclear genome of transformed plants. Nature 321(1986), pp. 446-449 中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。农杆菌GV3101 菌株记载在 Clough-SJ, Bent-AF. Floral dip a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal. 1998,16 :6,735-743中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。实施例I、拟南芥AtD0F4. 2基因的克隆I、AtD0F4. 2 基因的克隆
为克隆AtD0F4. 2基因，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿的方法进行提取拟南芥(Arabidopsis thaliana cv Columbia-0, Col_0,以下简称野生型拟南芥,购自拟南芥中心Arabidopsis Biological Resource Center)总 RNA,mRNA 的纯化使用 Promega 试剂盒(购自 Promega 公司)PolyAT tract mRNA isolation system IV 进行分离，分离得到的 mRNA用紫外分光光度计进行定量。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，引物序列为，5’ -ATGAATAATTTGAATGTTTT-3 (序列 3)和 5’ -TTATGATTCATATTCAAAT-3 (序列 4)。对PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，PCR扩增产物的大小约为
0.5kb，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy (Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，根据pGEM_TEasy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明，测序结果表明该PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸，该PCR产物的基因命名为AtD0F4. 2，该基因的编码区为序列表中序列I自5’末端第1-585位核昔酸，该基因编码的蛋白命名为AtD0F4. 2,该蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2所示。序列表中序列I由585个核苷酸组成，序列表中序列2由194个氨基酸残基组成。2、在酵母系统中鉴定AtD0F4. 2蛋白转录激活活性以下酵母双杂交实验所用载体、培养基、DNA、菌种等凡没有特殊注明的均购自(Clontech 公司，Matchmaker Gold Yeast, Two-Hybrid System, Cat#630489,Lot#1001289A)。以AtDof4. 2 EcoRI和AtDof4. 2 Pst I为引物，以上述I得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物。AtDof4. 2 EcoRIccggaattcATGAATAATTTGAATGTTTT (序列 5)AtDof4. 2 Pst I aaactgcagTTATGATTCATATTCAAAT (序列 6)用EcoRI和PstI酶切PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的pBDGAL4连接，得到连接产物，将连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列I插入PBDGAL4的EcoRI和PstI酶切位点间的载体，将该载体命名为 pBD-AtDof4. 2。按照Stratagene公司的产品说明研究AtDof4. 2在酵母中的转录激活活性。使用酵母菌株 YRG-2，(MATa ura3-52 his3_200 ade2_101 lys2-801 trpl-901leu2-3 112 gal4-542gal80-538 LYS2::UASGAL1-TATAGAL1 -HIS3 URA3::UASGAL417mers(x3)-TATACYCl-lacZ，菌株的基因型)制备感受态细胞。挑取2_4个直径约3mm的酵母单菌落转接到含有30ml YPAD培养液(Clontech公司，Cat#630306)的IOOml三角瓶中，30°C下200rpm振荡培养18-24hr。直至OD6tltl大于或等于I. 2。将此30ml菌液移入含有500ml YPAD培养液的IL三角瓶中，30°C下200rpm振荡培养3_5hr，室温(25°C )下2，800rpm离心5min收集菌体，菌体用超纯水清洗两次后悬浮l_2ml的TE-LiAc溶液(每 IOml TE-LiAc-PEG 溶液中含 8ml 50% PEG3350, Iml 10 X TE, Iml IOXLiAc)中，分装IOOiU菌悬液(感受态细胞)/1. 5ml EP管。每IOOiU感受态细胞中加IOiU沸煮的鲑鱼精(100°C煮20min后置冰上冷却)混匀，再分别加入I Ul (约200ng)上述获得的 pBD-AtDof4. 2，然后分别加 600 u ITE-LiAc-PEG 溶液(每 IOml TE-LiAc-PEG 溶液中含8ml 50% PEG3350, Iml 10 X TE, ImllOXLiAc)涡旋混匀；30°C下 200rpm 振荡培养 30min，加70ii I DMS0,轻轻颠倒混勻；42°C热击15min,冰浴IOmin ；3, OOOrpm离心IOsec收集菌体，吸弃上清液，加0. 5ml IXTE悬浮细胞；将菌液涂于SD/-Trp培养基(Clontech公司，Cat#630308)平板上，30°C培养2_3天。将质粒pGAL4和pBD分别转化YRG-2作为阳性和阴性对照。长出的酵母菌落转到SD/-His培养基(Clontech公司，Cat#630324)平板上进行筛选。30°C培养2天,检查生长情况并分析P -半乳糖甘酶(P-Galactosidase)的活性。YRG-2中有报告基因HIS3和LacZ，在它们的上游存在激活序列UAS可以调控HIS3和LacZ 因的表达。如果融合在BD序列后的DNA编码序列具有转录激活区，那么与UAS作用的融合蛋白就可以激活HIS3和LacZ基因的表达，转化后的酵母就可以在SD/_His培养基上生长并且P -Galactosidase活性分析能显示蓝色。分别利用X-Gal和ONPG (邻硝基苯P -D-半乳批喃糖苷)对P-Galactosidase酶活性进行定性及定量分析。结果如图I所示，其中图IA为pBD-AtDof4. 2转化酵母YRG2后在YPAD、SD/_His及X-gal显色情况，图IB为PBD-AtDof4. 2转录活性的ONPG定量分析，其中，AtDof4. 2为转化了 pBD-AtDof4. 2的酵母、BD为转化了 pBD的酵母(阴性对照)、GAL为转化了 pGAL4的酵母(阳性对照)；AtDof4. 2 中 AtD0F4. 2-BD 的相对表达量为 95±5% ；BD中AtD0F4. 2-BD的相对表达量为3% ；GAL 中 AtD0F4. 2-BD 的相对表达量为 87± 14% ;由图I可见，AtD0F4. 2与正(GAL)、负(BD)对照对比具有转录激活活性。实施例2、转AtD0F4. 2拟南芥及其功能研究I. AtD0F4. 2基因T-DNA突变体的鉴定T-DNA 插入突变体 dof4. 2 (CS813276)购自 ABRC (Arabidopsis BiologicalResource Center)。将野生型拟南芥和dof4. 2突变体种子在培养皿生长2周后移栽(生长于22°C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗))至盆中待开花后，取全株提取RNA做RT-PCR鉴定。引物为AtDof4.2 5，-ATGAATAAITTGAATGnTT-3’(序列 3)AtDof4. 2 5，-TTATGATTCATATTCAAAT-3，(序列 4)以Actin作为内参，引物为Actin F 5， -GAAGATTAAGGTCGTTGCACCACCTG3，Actin R 5’ -ATTAACATTGCAAAGAGTTTCAAGGT3’
结果如图2所示，Col-O为野生型拟南芥，dof4. 2为突变体，从图中可以看出，野生型中有AtD0F4. 2的表达，而dof4. 2突变体中没有该基因的表达，因此确认了获得的突变体。2. AtD0F4. 2基因植物表达载体的构建和转化以实施例I获得的cDNA为模板，以下述Forward和Reverse作为引物进行PCR扩增Forward :5’ -ATTAGATCTATGAATAATTTGAATGTTTTTACAAATG_3;(序列 7)Bgl IIReverse :5，-ATAGGTACCTTATGATTCATATTCAAATTGCAACTTG_3;(序列 8)、Kpn I得到的PCR产物经过Bgl II和Kpn I酶切，回收酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的植物双元表达载体pROK II的载体大片段连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列I插入pROKII的CaMV 35S启动子之后的Bgl II和Kpn I酶切位点间得到的载体，将该载体命名为pR0KII-AtD0F4. 2，该载体的结构示意图如图3所示。将重组载体pR0KII-AtD0F4. 2用电击转化法导入农杆菌GV3101中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，送去测序，结果为该质粒为pR0KII-AtD0F4. 2，含有该质粒的重组菌命名为 GV3101/pR0KII-AtD0F4. 2。挑取GV3101/pR0K II_AtD0F4. 2的单菌落在5mlLB中，于28°C培养8小时，再转接到200mlLB中继续培养3小时，收菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-O的花浸泡于转化液中10秒，取出后放入MS培养基中避光培养8小时，获得Ttl代转化种子，将其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培养基上，获得30株Ttl代转AtD0F4. 2拟南芥。采用同样的方法将空载体pROK II转入野生型拟南芥中，得到Ttl代转空载体拟南芥，提取RNA,反转录得到cDNA,以Forward和Reverse作为引物，未得到目的片段，表明为将空载体转入野生型拟南芥中。提取上述30株Ttl代转AtD0F4. 2拟南芥植株叶的RNA，并反转录获得cDNA，进行Northern鉴定，探针为全长AtD0F4. 2 cDNA,以Ttl代转空载体拟南芥为对照。结果如图4A所示，由于AtD0F4. 2基因在Ttl代转空载体拟南芥叶中表达很低，因此中只看到很浅的条带，而各个转基因株系中AtD0F4. 2的表达量均较高，选取株系4和8号作进一步纯化和表型分析，分别记为4. 2-4和4. 2-8。鉴于Ttl代转空载体拟南芥中AtD0F4. 2基因的转录量很低，因此为避免转化引起对照的表型变化，以下实验以野生型拟南芥为对照。提取编号分别为4. 2-4和4. 2-8的Ttl代转AtD0F4. 2拟南芥RNA，反转录得到 cDNA,以 Forward 和 Reverse 作为引物，使用 Tiangen 公司的 RealMaster Mix (SYBRGreen)试剂盒进行 Real-time PCR 反应。将样品置于 DNA engine Opticon PCR 仪(MJReseach Incorporated)中，设定反应参数为94°C 变性 2min,然后 94°C 15sec, 56°C 15sec，68°C 30sec，共进行40个循环，反应结束后按照仪器说明书对结果进行分析。一共进行3次平行实验，取平均值作为最后的结果。拟南芥Actin基因为内标，引物为同上。
结果如4B所示，以Actin基因的转录水平为标准，Col-O (野生型拟南芥)中AtD0F4. 2的相对转录水平几乎为0 ;4. 2-4 (T0代转AtD0F4. 2拟南芥)中AtD0F4. 2的相对转录水平为0. 65 ±0. 10 ;4. 2-8 (T0代转AtD0F4. 2拟南芥)中AtD0F4. 2的相对转录水平为0. 35±0. 06 ；可以看出，转基因株系4. 2-4和4. 2-8的相对转录水平高于野生型Col_0。收获转基因转系4. 2-4和4. 2-8的Ttl代种子后，播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上。待筛选得到的T1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长。将T1代单株收获后，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯和株系，得到编号为4. 2-4的T2代转AtD0F4. 2拟南芥和编号为
4.2-4的T2代转AtD0F4. 2拟南芥。 收获Ttl代转空载体拟南芥的种子，播种，获得T2代转空载体拟南芥。3 转AtD0F4. 2拟南芥和突变体dof4. 2的表型分析将编号为4. 2-4的T2代转AtD0F4. 2拟南芥和编号为4. 2-8的T2代转AtD0F4. 2拟南芥种子灭菌后平铺于1/2MS培养基，从种子萌发开始定时观察植物形态。以野生型拟南芥、T2代转空载体拟南芥和突变体dof4. 2为对照。结果如图5所示，其中dof4. 2为突变体，Col-O为野生型拟南芥，4. 2-4为编号为
4.2-4的T2代转AtD0F4. 2拟南芥，4. 2-8为编号为4. 2-8的T2代转AtD0F4. 2拟南芥；图5A为对照和转AtD0F4. 2基因株系的表型；可见突变体dof4. 2和野生型对照Col-O的侧枝无显著差异，而转基因株系4. 2-4和4. 2-8的侧枝数明显高于对照和突变体。图5B为各侧枝标示的示意图；标明了一、二级莲座叶分枝和一、二级茎分枝的定义。图5C至5H分别为5C、ro分别为一级(RI)和二级(RH)莲座叶分枝数；5E、5F分别为茎一级(Cl)和二级(CU)分枝数；5G为株高；5H为第一节间长度。图5C 中，Col-0、dof4. 2、4. 2-4、4. 2-8 的一级莲座叶分枝数分别为 2. 2±0. 8、
2.4±1. 0,3. 7±0. 7 和 4. 1±1. 0 ;图5D 中，Col-0、dof4. 2、4. 2-4、4. 2-8 的二级莲座叶分枝数分别为 3. 9±1.0、
3.0±1. 0,6. 8±0. 8 和 8. 5±1. 5 ;从图5C和的统计数据中可以看出，转AtD0F4. 2基因株系4. 2_4和4. 2-8莲座一级和二级叶分枝数均显著高于野生型拟南芥和dof4. 2突变体，突变体的一级莲座叶分枝数与对照无明显差异，而二级莲座叶分枝数明显低于对照。图5E 中，Col-0、dof4. 2、4. 2-4,4. 2-8 的一级茎分枝数分别为 2. 8± I. 5、
3.0±1. 6,3. 2±1. 0 和 3. 8±1. 5 ;图5F 中，Col-0、dof4. 2、4. 2-4,4. 2-8 的二级茎分枝数分别为 5. 0±1. 9、
5.2±1. 4,8. 7±5. 3 和 12. 3±3. 9 ；从图5E和5F中可以看出，4. 2-4和4. 2-8与对照和突变体相比，一级茎分枝数没有明显差异，而4. 2-4和4. 2-8的二级茎分枝数均显著高于对照和突变体，而突变体与野生型相似。图5G 中，Col-0、dof4. 2、4. 2-4,4. 2-8 的株高分别为 27. 1±6. 5,25. 0±5. O、22. 0±3. 7 和 24. 5±5. 0 ；
图5H中，Col-0、dof4. 2、4. 2-4,4. 2-8的第一节间长度(第一节间长度为第一茎分枝与根的距尚)分别为3. 1±1.7、2. 9±2. 0、2. 5±1.2和1.3±1.0 ；从图5G和5H中可以看出，由于AtD0F4. 2的过量表达抑制了顶端优势，因此2个转基因株系的株高和第一节间长度均小于野生型对照和突变体。上述表型分析说明，拟南芥转录因子AtD0F4. 2与植株的莲座叶分枝数和茎分枝数相关。
野生型拟南芥和T2代转空载体拟南芥结果无显著差异。
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的侧枝数目相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下⑴或⑵或(3)的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物的侧枝数目相关蛋白的 DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具有99%同源性且编码与植物的侧枝数目相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将权利要求2或3所述基因插入PROKII载体的多克隆位点得到的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到转基因植物； 所述转基因植物的表型如下I)-3)中任种或几种 1)所述转基因植物的侧枝数目多于所述目的植物； 2)所述转基因植物的株高低于所述目的植物； 3)所述转基因植物的节间长度小于所述目的植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组载体导入所述目的植物中。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述侧枝为莲座叶分枝和/或茎分枝； 所述节间长度为第一节间长度。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶或单子叶植物； 所述茎分枝为二级茎分支，所述莲座叶分枝为二级莲座叶分枝。
全文摘要
本发明公开了一种植物侧枝数目相关转录因子AtDOF4.2及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的侧枝数目相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明实验证明，本发明克隆了AtDOF4.2基因，对于培育侧枝数高的植物品种，特别是与绿化相关的林木、花卉和草坪草等新品种具有一定价值。
文档编号C12N15/11GK102731633SQ20111008252
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者张万科, 张劲松, 林晴, 邹洪锋, 陈受宜, 马彪 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所