专利名称：乙型肝炎病毒多表位融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种融合蛋白，特别涉及一种乙型肝炎病毒 (Hepatitis B ViruS，HBV)多表位融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法，及其在制药领域的应用。
背景技术：
HBV是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是重要的肝脏疾病致病因子。我国约有 3000万人为慢性HBV感染患者，每年因此死亡的患者近50万。慢性HBV感染患者主要表现为肝损伤以及与脂肪变性和纤维化相关的代谢紊乱，长期感染患者还有可能发展成为肝硬化和肝细胞癌。目前治疗慢性HBV感染主要采用以抗病毒药物和细胞因子为主、中医药为辅的治疗方法，虽然取得了一定疗效，但存在不能有效清除HBV、复发率高等缺点。因此，研究慢性HBV感染的新型治疗方法和治疗药物，已成为我国当前亟待解决的重大课题之一。随着乙肝病毒学和现代免疫学的快速发展，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在HBV清除过程中的关键作用得到深刻认识。利用CTL抑制HBV的复制并进一步将其清除，已成为极富前景的慢性HBV感染治疗方法。HBV表达多种抗原，包括表面抗原(HBsAg)、核心抗原 (HBcAg)、e抗原(HBeAg)、χ抗原(HBxAg)和多聚酶(po 1)，每种抗原都发现了多种MHC限制性CTL表位，其中部分CTL表位为超型表位，即同一表位具有不同MHC限制性，这种表位在 HBsAg、HBcAg和pol上均存在。研究发现，HBsAg、HBcAg和pol特异性CTL过继疗法可以有效降低患者体内的病毒载量，抑制HBV复制，提示这三种抗原可能是利用CTL治疗慢性HBV 感染的理想靶标。但是，如何在体内同时激发这三种抗原泛MHC限制性的特异性CTL反应， 则是感染病学家和免疫学家共同关心的挑战性课题。现有文献已报道了一些以激发特异性CTL反应为目标的乙肝疫苗，包括多肽疫苗、蛋白疫苗和DNA疫苗等。但这些疫苗并不完善，例如多肽疫苗多数是由单一抗原单一 MHC限制性的单一表位或多表位串联而成，存在表位单一、宿主限制性、免疫原性差等缺点； 蛋白疫苗可以多次免疫，但由于单一蛋白抗原表位的免疫原性差，在体内不能有效激发特异性CTL反应；DNA疫苗虽然在体内可以有效激发特异性CTL反应，但由于质粒DNA的转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原耐受，存在多次免疫效果差的问题， 难以适应慢性HBV感染患者长期治疗、多次免疫的要求。因此，迫切需要开发一种适应广泛人群MHC限制性的更高效的乙肝疫苗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBV多表位融合蛋白，免疫原性强，能够有效激发特异性CTL反应，高效抑制和清除HBV，同时能够适应广泛人群MHC限制性。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
HBV多表位融合蛋白，是在乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的第78位和第79位氨基酸之间插入由 HBsAg313-321、HBsAg335_343、Pol 150-159、Pol455_463 和 Padre 表位通过连接肽(linker)串联而成的HBV多表位融合肽(氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示)而得到。本发明的目的之二在于提供所述HBV多表位融合蛋白的制备方法，操作简便，成本低。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案 HBV多表位融合蛋白的制备方法，包括以下步骤
a、重组质粒pET28a-HP的构建根据HBV多表位融合肽的氨基酸序列设计并合成其编码基因序列使，PCR扩增，再将扩增出的使序列克隆入质粒pET28a中，获得重组质粒 pET28a-HP ；
b、重组质粒pET28-HBc-HP的构建采用PCR法分别扩增HBc第1_78位氨基酸片段的编码基因序列HBc卜78和第79-144位氨基酸片段的编码基因序列HBc79-144,再将颁￠7-7^ 序列和HBc79-144序列分别克隆入步骤a所得重组质粒pET28a_HP中HP序列的上游和下游，获得重组质粒pET28a-HBc-HP ；
c、HBV多表位融合蛋白的表达和纯化将步骤b所得重组质粒pET28a-HBc-HP转化大肠杆菌，用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用盐酸胍溶解后，离心取上清，用M2+亲和层析柱纯化，即得HBV多表位融合蛋白。进一步，步骤a是先根据HBV多表位融合肽的氨基酸序列SEQ ID No. 1设计并合成核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的编码基因序列使，再采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物PCR扩增使序列，最后将扩增出的使序列经限制性核酸内切酶损ol和^双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET28a中，获得重组质粒 pET28a-HP。进一步，步骤b是先采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下游引物PCR扩增HBc第1-78位氨基酸片段的编码基因序列///^7-7义再将扩增出的颁C7-7S序列经限制性核酸内切酶AfcoI和损ol双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET28a- HP中，获得重组质粒pET28a-HBcl-78-HP ；然后采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的上、下游引物PCR扩增HBc第79-144位氨基酸片段的编码基因序列颁c79-7 ，再将扩增出的颁序列经限制性核酸内切酶命/ 1 和损al双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET28a-HBcl-78-HP中，获得重组质粒 pET28a-HBc-HP。进一步，步骤C是将步骤b所得重组质粒pET28a-HBC-HP转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，用终浓度为lmmol/L的IPTG于温度37°C诱导表达6小时，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用盐酸胍溶解后，离心取上清，用M2+亲和层析柱纯化，即得HBV多表位融合蛋白。本发明的目的之三在于提供所述HBV多表位融合蛋白在制药领域的应用，从而为临床疾病的防治提供更多高效、安全的备选药物，以满足临床治疗的多方面需求。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
HBV多表位融合蛋白在制备乙型肝炎治疗性疫苗中的应用。本发明的有益效果在于①本发明的HBV多表位融合蛋白为包含有HBsiVg超型表位 HBsAg313-321 和 HBsAg335_343，pol 超型表位 Pol 150-159 和 Pol455_463，以及辅助性T细胞(Th)表位I^adre的HBc，共携带了三种HBV抗原HBsAg、HBcAg和Pol的超型表位，免疫原性强，能够有效激发广谱、特异的CTL反应，高效抑制和清除HBV ；上述超型表位的MHC 限制性包括A2、A3两大超型，可以覆盖90%以上的中国人群，因此由该融合蛋白制成的乙肝治疗性疫苗适用于广泛的乙肝患者；该融合蛋白携带的1 表位还能够有效辅助特异性CTL 的产生；②本发明的HBV多表位融合蛋白为病毒样颗粒(VLP)，其大小与天然病毒相近，在体内易于被树突状细胞(DC)捕获，进而呈递给T细胞，激活CTL反应；而且VLP在体内大部分被DC和巨噬细胞捕获，对体细胞的影响小，可以解决多次免疫耐受的问题，能够满足慢性HBV感染患者长期治疗、多次免疫的要求；③由于HBc中有核定位序列，本发明的HBV 多表位融合蛋白可以模拟HBV感染过程中乙肝病毒核心颗粒的核转运过程，从而进一步增强免疫效果。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为HBV多表位融合肽编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为 DNA分子量标准，泳道2为PCR扩增产物。图2为重组质粒pET28-HBc-HP酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA 分子量标准，泳道2为Hindlll酶切产物，泳道3为幻μI酶切产物。图3为HBV多表位融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为空质粒pEI^8a，泳道3为未经IPTG诱导的pET28-HBc-HP转化菌，泳道4为经 IPTG诱导的pET28-HBc-HP转化菌。图4为HBV多表位融合蛋白的电镜图。图5为HBV多表位融合蛋白免疫转基因小鼠前后HBV DNA和HBcAg的变化，其中 A和B分别为HLA-A*0201转基因小鼠免疫前后HBV DNA和HBcAg的变化，C和D分别为 HLA-A* 1101转基因小鼠免疫前后HBV DNA和HBcAg的变化；VLP vaccine表示HBV多表位融合蛋白免疫组，HBcAg+Peptides表示HBc颗粒-HBV多表位融合肽混合免疫对照组，HBcAg 表示HBc颗粒免疫对照组，Peptides表示HBV多表位融合肽免疫对照组，Blank表示非治疗对照组，Placebo表示安慰剂对照组。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、HBV多表位融合蛋白的设计和制备一、HBV多表位融合蛋白的设计
首先，利用中国人民解放军免疫学研究所建立的HBV抗原超型表位数据库，筛选符合以下标准的超型表位①抗原为HBsAg、HBcAg或pol ；②MHC限制性为A2、A3超型；③表位长度为9肽或10肽；④体外诱导特异性CTL分泌细胞因子IFN- γ的能力高于对照表位 HBcAgl8-27。结果共筛选出以下4个超型表位，分别是HBsAg313-321 (氨基酸序列为IPIPSSWAF)，MHC限制性为A3超型(包括A0301、A1101、 A3301)；
HBsAg335-343 (氨基酸序列为WLSLLVPFV)，MHC限制性为A2超型(包括A0201、A0202、 A0203、A0206 和 A6802)；
Poll50-159 (氨基酸序列为TLWKAGILYK)，MHC限制性为A3超型(包括A0301、AllOU A310UA3301 和 A6801)；
Pol455-463 (氨基酸序列为GLSRYVARL)，MHC限制性为A2超型(包括A0201、A0202和 A0203)。其次，为了能更有效辅助特异性CTL的产生，本发明设计在上述4个超型表位串联体中加入通用1 表位I^dre (氨基酸序列为AKFVAAWTLKAAA);为了有利于各表位在体内发挥各自的功能，便于抗原的加工呈递，本发明还设计不同的连接肽来连接各表位。优选的连接肽及各表位的连接方式如下GAA- (HBsAg335-343) -GAAA- (HBsAg313_321) -KAA-Padre-G AAA-(Pol455-463)-NAAA-(Pol 150-159)-GAA (SEQ ID No. 1 )，即得 HBV 多表位融合肽。这些连接肽的优点在于，在体内能有效地被蛋白酶体剪切，有利于表位的加工和提呈。而这种交错的表位连接方式可以实现不同抗原表位肽和不同表位限制性的交叉，能更有效地激发特异性CTL产生。最后，将HBV多表位融合肽插入到HBc的第78位和第79位氨基酸之间，即得HBV 多表位融合蛋白。HBc的第78位和第79位氨基酸位于HBc颗粒的表面，能有效地把插入此位置的HBV多表位融合肽暴露给蛋白酶体，而HBV多表位融合肽的插入也有利于打破HBc 颗粒的耐受。二、HBV多表位融合蛋白的制备
UHBV多表位融合蛋白重组质粒pET28-HBc-HP的构建
首先，为了便于HBV多表位融合肽的原核表达，根据上述HBV多表位融合肽的氨基酸序列，在http://WWW. jcat. de/网站上对其编码基因的核苷酸序列进行优化，获得如SEQ ID No. 2所示的优选核苷酸序列//Λ委托上海生工生物工程技术服务公司进行合成。然后， 以合成的使序列为模板，采用上游引物HP-F :5，-gactcgagggtgcagcctggctg-3‘ (SEQ ID No. 3)和下游引物 HP-R :5，-gtggtaccggctgcaccaaaaacgc-3，(SEQ ID No. 4)进行 PCR 扩增，扩增条件为先94°C预变性2分钟，再94°C变性30秒、65°C退火30秒、72°C延伸Imin, 共33个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖电泳电泳(图1)鉴定后，切胶回收纯化目的片段。将所得目的片段用损ol和幻Μ I双酶切，再与经同样双酶切的质粒pET28a 在T4 DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pET28a-HP。其次，以提取的HBV基因组为模板，分别采用下述2对引物上游引物 HBcl-78-F :5，-agccatggagatggacattgacc-3，(SEQ ID No. 5)禾口下游弓I 物 HBcl-78-R 5，-tactcgagatc-ttccaaattacttc-3，(SEQ ID No. 6)；上游弓| 物 HBc79_144_F 5，-atggtaccccagcatccagggaatt-3，(SEQ ID No. 7)和下游引物 HBc79_144_R 5‘-tgtctagaaacggaagtgttgataa-3‘ (SEQ ID No. 8)PCR 扩增 HBc 第 1-78 位氨基酸片段的编码基因序列颁C7-7S以及HBc第79-144位氨基酸片段的编码基因序列颁c7^_7 ，扩增条件为先94 V预变性2分钟，再94°C变性30秒、60 V退火30秒、72 °C延伸Imin，共33个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖电泳电泳鉴定后，切胶回收纯化目的片段。将所得目的片段颁C7-7S用Afco I和炀ο I双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒pET28a-HP 在T4 DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pET28a- HBcl-78-HP ；再将所得目的片段 HBc79-144觅Kpn I和损a I双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒pET28a-HBcl_78-HP在 T4 DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pET28a- HBc-HP0其酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。2, HBV多表位融合蛋白的原核表达及优化
将重组质粒pET28a-HBc-HP转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含有浓度为 100μδ/πι1的氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。挑取一个阳性克隆，分别于温度16、25、 37°C诱导目的蛋白表达，诱导剂IPTG的终浓度分别为0. 1,0. 3,0. 5,0. 7、lmmol/L，诱导时间分别为2、3、5、6小时。表达产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在温度37°C、诱导剂终浓度为lmmol/L、诱导时间为6小时的条件下，HBV多表位融合蛋白的表达量最高(图3)。取冻存的pET28a-HBc-HP转化菌菌液ΙΟΟμΙ，加入新鲜培养基10ml，37 °C培养过夜，再取新鲜菌液1ml，加入新鲜培养基100ml，37°C培养2. 5小时，再加入终浓度为lmmol/ L的IPTG，37°C诱导培养6小时，收集菌体，IOOOOrpm离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细菌裂解液IOml和终浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，超声至溶液变清澈，18000rpm 离心15分钟，弃上清，沉淀用浓度为4mol/L的尿素溶液洗涤2次，再加入浓度为6mol/L的盐酸胍溶解0. 5小时，ISOOOrpm离心15分钟，取上清，过Ni2+亲和层析柱，先用柱清洗液洗柱3次，再用含有浓度为200mmol/L的咪唑和浓度为6mol/L的盐酸胍的上样缓冲液洗脱， 收集洗脱液，用浓度为0. 01mol/L的PBS透析去除咪唑、盐酸胍及盐离子等，则HBV多表位融合蛋白复性形成VLP悬浮于PBS中(图4)。实施例2、HBV多表位融合蛋白的免疫保护作用
取免疫A2、A3转基因小鼠(购自Jackson实验室)与HBV转基因小鼠(购自广州空军医院)的杂交后Fl代HBV+A2+、HBV+A3+转基因C57小鼠60只，平均分为6组HBV多表位融合蛋白免疫组、HBc颗粒-HBV多表位融合肽混合免疫对照组、HBc颗粒免疫对照组、HBV多表位融合肽免疫对照组、非治疗对照组、安慰剂对照组。免疫方法如下HBV多表位融合蛋白免疫组HBV多表位融合蛋白IOOPg/次/只，1次/周；HBc颗粒-HBV多表位融合肽混合免疫对照组HBc颗粒和HBV多表位融合肽的混合物IOOPg/次/只，1次/周；HBc颗粒免疫对照组HBc颗粒IOOPg/次/只，1次/周；HBV多表位融合肽免疫对照组HBV多表位融合肽IOOPg/次/只，1次/周；免疫部位为尾部皮下，每组共免疫3次。利用定量PCR试剂盒 (吉玛公司)检测HBV DNA的拷贝数，利用免疫组化试剂盒(碧云天)检测肝细胞HBcAg表达。 结果显示，在HLA-A*0201和HLA-A*1101转基因小鼠中，HBV多表位融合蛋白免疫组与其它对照组相比，HBV DNA的拷贝数和HBcAg的表达量均明显下调(图5)，表明HBV多表位融合蛋白存在显著的免疫保护作用，并存在广谱性。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.乙型肝炎病毒多表位融合蛋白，其特征在于在乙型肝炎病毒核心蛋白的第78位和第 79 位氨基酸之间插入由 HBsAg313-321、HBsAg3;35-343、Poll50-159、Pol455-463 和 Padre 表位通过连接肽串联而成的乙型肝炎病毒多表位融合肽而得到，所述乙型肝炎病毒多表位融合肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.权利要求1所述的乙型肝炎病毒多表位融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、重组质粒pET28a-HP的构建根据乙型肝炎病毒多表位融合肽的氨基酸序列设计并合成其编码基因序列HP, PCR扩增，再将扩增出的HP序列克隆入质粒pET28a中，获得重组质粒 pETWa-HP ；b、重组质粒pET28-HBc-HP的构建采用PCR法分别扩增乙型肝炎病毒核心蛋白第1-78位氨基酸片段的编码基因序列和第79-144位氨基酸片段的编码基因序列HBc79-144，再将HBcl-78序列和HBc79-144序列分别克隆入步骤a所得重组质粒 pET28a-HP中HP序列的上游和下游，获得重组质粒pET28a-HBc_HP ；c、乙型肝炎病毒多表位融合蛋白的表达和纯化将步骤b所得重组质粒 pET28a-HBc-HP转化大肠杆菌，用异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用盐酸胍溶解后，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱纯化，即得乙型肝炎病毒多表位融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒多表位融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤a是先根据乙型肝炎病毒多表位融合肽的氨基酸序列设计并合成核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的编码基因序列使，再采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物PCR扩增/F序列，最后将扩增出的/F序列经限制性核酸内切酶损ο I和 Kpn I双酶切后，克隆入经同样双酶切的质粒pET28a中，获得重组质粒pET28a_HP。
4.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒多表位融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤b是先采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下游引物PCR扩增乙型肝炎病毒核心蛋白第1-78位氨基酸片段的编码基因序列/Sd-ZA再将扩增出的颁C7-7S序列经限制性核酸内切酶Afco I和损ο I双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET28a-HP中，获得重组质粒pET28a-HBcl-78-HP ；然后采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的上、下游引物PCR扩增乙型肝炎病毒核心蛋白第79-144位氨基酸片段的编码基因序列颁c79-7^，再将扩增出的颁c序列经限制性核酸内切酶^ot I和损a I双酶切后，克隆入经同样双酶切的重组质粒pET28a-HBcl-78-HP中，获得重组质粒 pET28a-HBc-HP。
5.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒多表位融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤c是将步骤b所得重组质粒pET28a-HBc-HP转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用终浓度为lmmol/L的异丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷于温度37°C诱导表达6小时，收集菌体，超声破碎，离心弃上清，沉淀用盐酸胍溶解后，离心取上清，用M2+亲和层析柱纯化，即得乙型肝炎病毒多表位融合蛋白。
6.权利要求1所述的乙型肝炎病毒多表位融合蛋白在制备乙型肝炎治疗性疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种乙型肝炎病毒多表位融合蛋白及其制备方法和应用，该融合蛋白是在乙型肝炎病毒核心蛋白的第78-79位氨基酸之间插入由HBsAg313-321、HBsAg335-343、Pol150-159、Pol455-463和Padre表位通过连接肽串联而成的乙型肝炎病毒多表位融合肽(序列如SEQIDNo.1所示)而得到；其制备方法是先构建乙型肝炎病毒多表位融合蛋白表达质粒pET28-HBc-HP，再用大肠杆菌表达系统进行IPTG诱导表达，最后用亲和层析纯化即得；该融合蛋白携带了HBsAg、HBcAg和多聚酶的多个超型表位且为病毒性颗粒，具有免疫原性强、适应人群广等优点，可用于制备乙肝治疗性疫苗。
文档编号C12N15/51GK102199217SQ201110082078
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者刘 东, 吴玉章, 李霞, 王莉 申请人:中国人民解放军第三军医大学